本文描述并应用了一种制备基于树状大分子的非均匀纳米图案的方法，该方法可实现对局部精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）表面密度的纳米尺度调控，用于研究细胞黏附和软骨发生分化。
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本文内容
摘要
摘要
细胞黏附与分化受到细胞外基质（ECM）组分纳米级分布的调控，其中局部浓度具有显著影响。本文介绍一种制备大规模非均匀纳米图案的方法，该图案由精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）功能化树状大分子构成，可实现对表面局部RGD密度的纳米级调控。这些纳米图案通过将树状大分子从不同初始浓度的溶液中吸附至表面形成，并采用水接触角（CA）、X射线光电子能谱（XPS）以及扫描探针显微技术（如扫描隧道显微镜STM和原子力显微镜AFM）进行表征。利用AFM图像，通过粒子间最小距离的概率等高线图测定局部表面RGD密度，并进一步关联分析其对细胞黏附反应与分化的影响。本文所提出的纳米图案化方法操作简便，可直接扩展至大面积表面，因此完全兼容细胞培养实验流程，并可推广应用于其他具有浓度依赖性细胞效应的配体。
引言
本文介绍了一种简单且多功能的基于树状大分子的纳米图案化方法，用于制备可实现纳米尺度局部黏附性调控的细胞培养表面。已有研究报道了细胞外基质（ECM）在纳米尺度上的组织细节1,2,3，而对细胞黏附表面进行纳米图案化已为理解细胞黏附相关需求提供了深入见解4,5。利用基于胶束光刻技术的纳米图案所开展的实验表明，RGD肽的纳米间距存在约70 nm的阈值，当间距超过该值时，细胞黏附会显著延迟6,7,8,9。这些研究还强调，相较于整体配体密度，局部配体密度对细胞黏附的影响更为显著9,10,11。
在形态发生过程中，细胞与周围环境的相互作用会触发最初的分....
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方案
1. 底物制备
- 在云母基底上退火 1.4 x 1.1 cm 的 Au(111)。
- 将 Au(111) 基底放置在玻璃陶瓷炉灶上，用丁烷火焰退火 3 分钟。在氩气气氛下让基底冷却。对每一块 Au(111) 基底重复此步骤。
注意：Au(111) 基底应在退火后立即使用。
- 将 Au(111) 基底放置在玻璃陶瓷炉灶上，用丁烷火焰退火 3 分钟。在氩气气氛下让基底冷却。对每一块 Au(111) 基底重复此步骤。
- 聚左旋乳酸 (PLLA) 涂层玻璃基底的制备。
- 切割并清洗玻璃载片。
- 使用金刚石尖切割器将显微镜载片切割成 18 片 1.25 cm x 1.25 cm 的小片。在每片载片的下侧做一个小凹痕，以便后续区分上下表面。
- 先用去离子水彻底清洗载片，再用 96% 乙醇清洗。让其自然晾干。
- 制备 2% PLLA 溶液。
- 将 200 mg PLLA 加入装有 10 mL 1,4-二氧六环的压力管中。加入搅拌子并紧密封口。
- 将压力管置于加热板上的甘油浴中，在 60 °C 下温和搅拌 24 小时，然后将溶液转移至 15 mL 玻璃小瓶中。
- 用 PLLA 溶液涂覆玻璃载片。
- 将玻璃载片和装有 PLLA 溶液的小瓶置于洁净的 60 °C 热板上。确保....
- 切割并清洗玻璃载片。
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结果
我们介绍一种纳米图案化方法，可在纳米尺度上调控表面黏附性（图1）。RGD-Cys-D1 的化学结构如 图1A 所示。树枝状分子被图案化于导电的 Au(111) 表面，以便进行高分辨率 STM 表征。溶液中树枝状分子浓度较低（低至 10-5% w/w）时，可形成直径为 4–5 nm 的孤立树枝状分子（图1B）；而较高浓度下则形成高度密集的树枝状分子聚集体（图1C）。AFM 表面表征（图1D–G，上排）显示，RGD-Cys-D1 树枝状分子在表面的分布可随溶液中初始树枝状分子浓度的改变而调节。在 dmin 的概率等高线图中，这表现为表面局部 RGD 纳米尺度密度的不同（图1D–G，下排）。
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讨论
在制定所述方案的过程中，应考虑若干关键步骤。第一步涉及使用扫描探针显微技术对纳米图案进行表征。为了观察纳米图案，产生图案化的表面其粗糙度必须低于树枝状大分子的平均直径，根据扫描隧道显微镜（STM）测量结果，该直径约为 4–5 nm（图 1B）。此外，需注意高分辨率 STM 成像仅限于导电基底，本实验中为 Au(111)。在旋涂后若出现聚合物从载玻片边缘翘起的情况，可使用生物相容性胶水进行修复。
树状大分子纳米图案化是一种在纳米尺度上实现细胞黏附性局部可控的技术。该技术基于树状大分子通过吸附在表面的自组装过程，无需任何复杂的纳米图案化设备，因而与先前报道的基于光刻的技术36,37,38形成对比。树状大分子纳米图案化可轻松扩展至大面积表面，并且完全兼容细胞培养操作流程。
本文所述的树状大分子纳米图案化方法在未来可.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Oriol Font-Bach 和 Albert G. Castaño 在 dmin 定量分析方面的帮助。作者还感谢巴塞罗那生物医学研究所（IRB Barcelona）先进数字显微镜单元允许作者在其设施内录制视频。本工作由西班牙生物医学研究网络中心（CIBER）提供资助。CIBER 是由 2008–2011 年第六个国家级研发与创新计划（VI National R&D&i Plan）、Iniciativa Ingenio 2010、Consolider 计划、CIBER 行动项目以及卡洛斯三世健康研究所（Instituto de Salud Carlos III）发起并资助的项目，同时获得欧洲区域发展基金的支持。本研究还得到加泰罗尼亚自治区创新、大学与企业部大学与科研委员会（2014 SGR 1442）的资助。此外，本研究也获得了西班牙经济与竞争力部资助的项目 OLIGOCODES（编号 MAT2012-38573-C02）和 CTQ2013-41339-P，以及 INTERREG V-A 西班牙-葡萄牙 2014–2020 年跨境合作项目（POCTEP，编号 0245_IBEROS_1_E）的支持。C.R.P. 感谢西班牙经济与竞争力部提供的基金资助（编号 IFI15/00151）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 云母上的金（111）薄膜，1.4×1.1 cm | Spi Supplies | 466PS-AB | |
| 普通玻璃载玻片 | Corning | 2947-75x25 | |
| 去离子水 | Millipore | 18MΩ cm | |
| 96%乙醇 | PanReac | 131085.1212 | |
| L-丙交酯/DL-丙交酯共聚物 | Corbion | 摩尔比95/05 | |
| 1,4-二氧六环 | Sigma-Aldrich | 296309-1L | |
| 耐高温硅油 | Acros Organics | 174665000 | |
| 旋涂仪 | Laurell | WS-650MZ-23NPP/Lite | |
| 组织培养用层流罩 | Telstar | Bio II Advance | II级生物安全柜 |
| 滤器单元 | Millex-GP | SLGP033RB | 0.22 µm |
| 10 mL注射器 | Discardit | 309110 | |
| 原子力显微镜 | Veeco Instruments | Dimension 3000 AFM仪器 | |
| 硅基原子力显微镜探针 | Budget Sensors | Tap300AI-G | 共振频率300 kHz，k = 40 N/m |
| 扫描隧道显微镜 | Molecular Imaging | PicoSPM显微镜 | |
| Pt0.8:Ir0.2金属丝 | Advent | PT671012 | 直径0.25 mm |
| WSxM 4.0软件 | Nanotec electronica | ||
| 光学接触角（CA）测量系统 | Dataphysics | ||
| SCA20软件 | Dataphysics | ||
| X射线光电子能谱仪 | Physical Electronics | Perkin-Elmer PHI 5500 Multitechnique System | |
| 牛血浆来源的纤连蛋白 | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | 1.0 mL溶液 |
| 杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS） | Gibco | 21600-10 | 粉末 |
| 小鼠胚胎成纤维细胞 | ATCC | ATCC CRL-1658 | NIH/3T3 |
| 高糖型杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）液体培养基 | Gibco | 11960044 | 液体高糖型，不含谷氨酰胺，500 mL |
| 胎牛血清（FBS） | Gibco | 16000044 | 500 mL |
| L-谷氨酰胺 | Invitrogen | 25030 | 200 mM（100倍浓缩液） |
| 青霉素-链霉素 | Invitrogen | 15140 | |
| 丙酮酸钠 | Invitrogen | 11360039 | 100 mL |
| T75培养瓶 | Nunclon | 156499 | |
| 胰蛋白酶 | Life Technologies | 25200072 | 0.25% EDTA |
| 离心机 | Hermle Labortechnik | Z 206 A | |
| 非组织培养处理的12孔板 | Falcon | 351143 | 非黏附性 |
| 脂肪来源的人间充质干细胞（hMSCs） | ATCC | ATCC PCS-500-011 | 细胞冻存管，1 mL |
| MSC基础培养基 | ATCC | ATCC PCS-500-030 | |
| MSC生长试剂盒 | ATCC | ATCC PCS-500-040 | 低血清 |
| 软骨细胞分化试剂 | ATCC | ATCC PCS-500-051 | |
| 福尔马林溶液 | Sigma-Aldrich | HT5011-15ML | 中性缓冲，10% |
| 氯化铵 | Sigma-Aldrich | A9434-500G | 分子生物学级别，适用于细胞培养，≥99.5% |
| 皂苷 | Sigma-Aldrich | 47036-50G-F | 分子生物学级别，用作非离子型表面活性剂和佐剂 |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A3059-50G | |
| 兔单克隆[Y113]抗paxillin抗体 | Abcam | ab32084 | 稀释比例1:200 |
| 鼠单克隆[1F5]抗胶原蛋白α-1 XX链抗体 | Acris Antibodies | AM00212PU-N | 稀释比例：1:400 |
| Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗 | Invitrogen | A10667 | 2 mg/mL，稀释比例1:1000 |
| Alexa Fluor 568标记的山羊抗兔IgG（H+L）二抗 | Invitrogen | A11036 | 2 mg/mL，稀释比例1:1000 |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 10ML | 10 mg/mL，稀释比例1:1000 |
| 盖玻片 24×24 mm | Deltalab | D102424 | |
| Fluoromount封片剂 | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | |
| 落射荧光显微镜 | Nikon | Eclipse E1000正置显微镜 | 配备CCD相机 |
| 共聚焦显微镜 | Leica Microsystems | Leica SPE 正置共聚焦显微镜 | |
| ImageJ 1.50g 免费软件 | http://imgej.nih.gov/ij | ||
| MATLAB软件 | The MATHWORKS, Inc. | ||
| OriginPro 8.5软件 | OriginLab Coorporation |
参考文献
- Jiang, F., Hörber, H., Howard, J., Müller, D. J. Assembly of collagen into microribbons: Effects of pH and electrolytes. J. Struct. Biol. 148 (3), 268-278 (2004).
- Smith, M. L., et al. Force-induced unfolding of fibronectin in the extracellular matrix of ....
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重印与许可
