本实验方案的目的是特异性标记并选择性分离感染细胞中的病毒DNA，以用于表征与病毒基因组相关的蛋白质。
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摘要
摘要
本实验方案的目的是从感染细胞中分离单纯疱疹病毒1型（HSV-1）DNA，以通过质谱技术鉴定与之相关的病毒和宿主细胞蛋白。尽管与病毒基因组相互作用的蛋白在决定感染结局中发挥关键作用，但此前尚无法对与病毒基因组结合的蛋白进行全面分析。本文展示了一种可直接从感染细胞中纯化HSV-1基因组的方法。通过在复制中的病毒DNA中选择性地掺入含有炔基官能团的修饰核苷酸对其进行标记。随后，利用铜(I)催化的叠氮-炔基环加成反应（即“点击”反应），将生物素叠氮物共价连接至标记的DNA上，实现特异性且不可逆的标记。生物素标记的DNA通过链霉亲和素包被的磁珠进行纯化，与其结合的蛋白被洗脱后通过质谱进行鉴定。该方法可实现从复杂的生物环境中选择性靶向并分离HSV-1复制叉或完整基因组。此外，该策略的进一步优化将有助于研究疱疹病毒感染的多个方面，也可用于其他DNA病毒基因组的相关研究。
引言
病毒自身执行基本功能的能力有限，因此依赖宿主因子来促进感染过程中的关键环节，包括病毒基因表达、复制、修复、重组和转运。这些宿主因子的功能通常被病毒编码的蛋白质所增强。此外，病毒必须逃避细胞对病毒感染的识别和干扰。因此，病毒与宿主的相互作用决定了感染的结局。尤为重要的是理解病毒如何改变细胞环境，以改造细胞机制来促进病毒自身的生命活动。特别值得关注的是，在整个感染周期中，有哪些因子和过程作用于病毒基因组。
单纯疱疹病毒1型（HSV-1）是一种双链DNA病毒，可感染大部分人类群体。在感染后的第一个小时内，病毒基因组进入细胞核，在核内，病毒基因表达按一定顺序级联发生，并与病毒DNA（vDNA）复制相协调1。在细胞核内，病毒基因组会受到表观遗传调控，经历修复和重组过程，并被包装进衣壳中，使得首批子代病毒粒子在不到六小时内即可产生。在整个感染过程中对与病毒基因组相关蛋白进行全面评估，将为研究作用于病毒基因组的各类分子机制奠定基础，并有助于揭示在感染不同阶段中所涉及的病毒和宿主细胞因子。
以往研究病毒感染过程中宿主因子的方法包括利用病毒蛋白的亲和纯化来分析与其结合的细胞蛋白2,3,4,
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方案
1. 细胞培养、病毒感染与EdC标记（图1）
以下方案涉及病毒操作。请参阅您所在机构关于病毒及其他生物制剂安全操作的生物安全规程。本方案已获匹兹堡大学机构审查委员会批准。
- 用胰蛋白酶消化一个汇合的150 cm2 MRC-5细胞培养瓶，并将细胞转移至含有100 mL DMEM加10% FBS的600 cm2 组织培养板中。在37 °C、5% CO2条件下培养3–4天，直至细胞达到汇合状态和静止期。一个汇合的600 cm2培养皿约含有~7 × 107个细胞。为每种实验条件准备1个培养板，同时为每个相应条件准备1个阴性对照板。
注意：细胞必须进入静止期以抑制细胞DNA复制，确保后续步骤中仅标记和纯化病毒DNA（vDNA）。
注意：每个样本需配备一个相应的未标记阴性对照，该对照应采用相同的感染条件和时间点处理，但不添加EdC。
注意：应同时进行本实验的缩小规模版本，通过成像检测细胞DNA的标记情况，使用相似的细胞生长、感染、EdC标记条件和时间点（见步骤2）。 - 将7 × 108 PFU HSV-1溶于7 mL冷的Tris缓冲盐水（TBS）中。移除培养基并将其置于37 °C保存。进行感染时，将7 mL稀释后的病毒....
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结果
利用点击化学方法从细胞中纯化DNA最早由iPOND技术实现21。iPOND的目的是纯化细胞中的复制叉，以鉴定与其相关的蛋白质。我们已对该技术进行改进，专门用于研究病毒感染过程中病毒DNA（vDNA）与蛋白质的相互作用。通过改造该方法，使用EdC标记病毒基因组（图1），并结合同步化感染，可实现对不同vDNA群体的选择性分离与分析。HSV-1 DNA通过EdC标记（图1），便于共价连接荧光染料用于成像或连接生物素用于纯化（图2）。病毒可在感染前预先标记，以分析与进入细胞的基因组相关联的蛋白质（图1A）；也可在DNA复制过程中进行标记，以分析与新合成的vDNA相关联的蛋白质（图1B）25。.......
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讨论
本方案包含多个步骤，若未仔细操作，可能导致蛋白质得率显著降低或样品被细胞DNA污染。所有实验必须使用处于静止期的细胞，以确保细胞DNA不会被标记并纯化。这一点可通过检测蛋白质样品中是否存在细胞DNA聚合酶来验证，因为HSV-1在基因组合成过程中不利用细胞DNA聚合酶。在EdC标记和细胞核收集步骤中，应错开处理各样品，以确保每个样品的处理条件一致。在纯化过程中，应避免通过过度移液操作细胞核。过度移液可能导致细胞核提前裂解，并因样品黏附于移液枪头内壁而造成损失。此外，超声处理步骤应根据不同的超声仪进行优化，且用于结合生物素的链霉亲和素包被磁珠的用量应进行滴定，以获得最佳的蛋白质得率。
本实验方案可进行多种修改，包括使用不同的病毒或细胞类型，或增加蛋白质与DNA交联的步骤。在选择用于蛋白质组学研究的细胞类型时，重要的是要确认该物种是否存在可用的蛋白质序列数据库。缺乏蛋白质组学资源将显著限制后续的蛋白质数据分析。另一个局限性是需要大量细胞，因此可能难以为此实验准备足够的原代细胞（如神经元）。只要病毒感染不依赖于细胞DNA复制，该方法应适用于其他DNA或RNA病毒。此外，研究HSV-1突变体.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 Hannah Fox 在准备本手稿过程中提供的帮助。本工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助 R01AI030612 的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| MRC-5 细胞 | ATCC | CCL-171 | |
| 胎牛血清（FBS） | 吉布科（Gibco） | 26140-179 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | 吉布科（Gibco） | 12800-082 | 添加 10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺、12 mM （用于瓶中培养）或 30 mM（用于皿中培养）碳酸氢钠 |
| 600 cm2 组织培养皿 | 赛默飞世尔科技（Thermo Fisher Scientific） | 166508 | |
| Tris 缓冲盐水（TBS），pH 7.4 | 137 mM NaCl、5 mM KCl、491 mM MgCl、680 mM CaCl、25.1 mM Tricine | ||
| HSV-1 储备液 | 滴度高于 1×109 PFU/mL 的储备液效果最佳 | ||
| Sephadex G-25 柱（PD-10 脱盐柱） | GE 医疗集团（GE Healthcare） | 17085101 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | 费希尔科技（Fisher Scientific） | D128-1 | |
| 5´-乙炔基-2´-脱氧胞苷（EdC） | 西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich） | T511307 | 溶于 DMSO 配制成 40 mM 储备液，分装后于 -20 °C 保存 |
| 2´-脱氧胞苷（deoxyC） | 西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich） | D3897 | 溶于水配制成 40 mM 储备液，分装后于 -20 °C 保存 |
| 核提取缓冲液（NEB） | 现配现用（20 mM Hepes pH 7.2、50 mM NaCl、3 mM MgCl2、300 mM 蔗糖、0.5% Igepal） | ||
| 细胞刮刀 | 贝尔科玻璃（Bellco glass） | 7731-22000 | 使用前高压灭菌 |
| 台盼蓝溶液 | 西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich） | T8154 | |
| PBS，pH 7.2（10x） | 1.37 M NaCl、27 mM KCl、100 mM Na2HPO4、18 mM KH2PO4（使用前用无菌水稀释至 1x） | ||
| 五水合硫酸铜（CuSO4-5H2O） | 费希尔科技（Fisher Scientific） | C489 | 配制 100 mM 储备液，4 °C 保存不超过 1 个月 |
| (+) L-抗坏血酸钠 | 西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich） | A4034 | 新鲜配制 100 mM 储备液，使用前置于冰上保存 |
| 生物素叠氮化物 | 英维特罗根（Invitrogen） | B10184 | 用 DMSO 配制成 10 mM 储备液，分装后于 -20 °C 保存，最长可保存 1 年 |
| 点击反应混合液 | 使用前立即按指定顺序加入试剂配制（10 mL：8.8 mL 1x PBS、200 mL 100 mM CuSO4、25 mL 10 mM 生物素叠氮化物、1 mL 100 mM 抗坏血酸钠） | ||
| 完全蛋白酶抑制剂混合液 | 罗氏（Roche） | 11697498001 | 溶于 1 mL 水中配制成 50x 储备液，4 °C 保存不超过 1 周，或直接将 1 片加入 50 mL 缓冲液中 |
| 冻存缓冲液 | 现配现用（7 mL 100% 甘油、3 mL NEB、200 μL 50x 蛋白酶抑制剂） | ||
| 缓冲液 B1 | 现配现用（25 mM NaCl、2 mM EDTA、50 mM Tris-HCl pH 8、1% Igepal、1x 蛋白酶抑制剂） | ||
| 缓冲液 B2 | 现配现用（150 mM NaCl、2 mM EDTA、50 mM Tris-HCl pH 8、0.5% Igepal、1x 蛋白酶抑制剂） | ||
| 缓冲液 B3 | 现配现用（150 mM NaCl、2 mM EDTA、50 mM Tris-HCl pH 8、1x 蛋白酶抑制剂） | ||
| 配备 3 mm 微型探头的 Vibra Cell 超声波处理器 | Sonics | VCX 130 | |
| 细胞筛 | 法尔肯（Falcon） | 352360 | |
| Dynabeads MyOne 链霉亲和素 T1 磁珠 | 生命技术公司（Life Technologies） | 65601 | |
| DynaMag-2 磁力架 | 生命技术公司（Life Technologies） | 12321D | |
| 微型管旋转仪 | 费希尔科技（Fisher Scientific） | 260750F | |
| 2x Laemmli 上样缓冲液 | 将 400 mg SDS、2 mL 100% 甘油、1.25 mL 1 M Tris（pH 6.8）和 10 mg 溴酚蓝溶于 8 mL 水中。4 °C 保存不超过 6 个月。使用前加入 1 M DTT 至终浓度 200 mM。 | ||
| 1.5 mL 管帽锁 | 费希尔科技（Fisher Scientific） | NC9679153 | |
| 常规 Western 印迹试剂 | |||
| NOVEX 胶体蓝染色试剂盒 | 英维特罗根（Invitrogen） | LC6025 | |
| 12 孔组织培养皿 | 康宁（Corning） | 3513 | |
| 盖玻片 | 费希尔科技（Fisher Scientific） | 12-545-100 | 使用前高压灭菌 |
| 显微镜载玻片 | 费希尔科技（Fisher Scientific） | 12-552-5 | |
| 16% 戊二醛 | 电子显微镜科学公司（Electron Microscopy Sciences） | 15710 | 使用前用 1x PBS 稀释至 3.7% |
| 牛血清白蛋白（BSA） | 费希尔科技（Fisher Scientific） | BP1605 | 用 1x PBS 配制成 3% |
| 通透缓冲液（0.5% Triton-X 100） | 西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich） | T8787 | 用 1x PBS 配制成 0.5% Triton-X 100 |
| 点击反应混合液 — Click-iT EdU Alexa Fluor 488 成像试剂盒 | 分子探针（Molecular Probes） | C10337 | 按照制造商说明书配制 |
| Hoechst 33342 | 生命技术公司（Life Technologies） | H1399 | 用纯水配制成 10 mg/mL，4 °C 保存不超过 1 年 |
| 小鼠抗 ICP8 一抗 | Abcam | ab20194 | 用 1x PBS 按 1:200 稀释 |
| 小鼠抗 UL42 一抗（2H4） | Abcam | ab19311 | 用 1x PBS 按 1:200 稀释 |
| 山羊抗小鼠 594 标记二抗 | 生命技术公司（Life Technologies） | a11005 | 用 1x PBS 按 1:500 稀释 |
| Immu-mount 封片剂 | 赛默飞世尔科技（Thermo Fisher Scientific） | 9990402 | |
| 2x SDS-碳酸氢盐溶液 | 2% SDS、200 mM NaHCO3 | ||
| 苯酚:氯仿:异戊醇 | 按 25:24:1 混合，至少在使用前 1 天配制，4 °C 避光保存 | ||
| 氯仿:异戊醇 | 按 24:1 混合，至少在使用前 1 天配制，室温避光保存 | ||
| 10x Tris EDTA（TE），pH 8.0 | 100 mM Tris、10 mM EDTA（使用前稀释至 1x） | ||
| Qiaquick PCR 纯化试剂盒 | 凯杰（Qiagen） | 28104 | |
| 3 M 乙酸钠，pH 5.2 | |||
| Qubit 2.0 荧光计 | 英维特罗根（Invitrogen） | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS 检测试剂盒 | 英维特罗根（Invitrogen） | Q32851 | |
| Qubit 检测管 | 英维特罗根（Invitrogen） | Q32856 | |
| 配备成像软件的荧光显微镜 | |||
| 适用于 1.5 mL 管的微量离心机 | |||
| 适用于 15 和 50 mL 管的台式离心机 | |||
| 细胞培养箱 | |||
| 生物安全柜 | |||
| 加热块 | 65 °C 和 95 °C |
参考文献
- Knipe, D. M., Howley, P. M. Fields virology. , 6th, Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins Health. (2013).
- Engel, E. A., Song, R., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. Investigating the biology of alpha herpesviruses with MS-based proteomics. Proteomics. 15, 1943-1956 (2015).
- Wagner, L. M., DeLuca, N. A.
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重印与许可
