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全面采样与处理骨髓以检测急性髓系白血病中可测量残存病灶及白血病干细胞的实验方案

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DOI：

10.3791/56386

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2018年3月5日

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1Department of Hematology, VU University Medical Center, 2Pediatric Oncology/Hematology, VU University Medical Center, 3Janssen Research & Development, LLC, 4Princess Máxima Center for Pediatric Oncology

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

检测微小残留病（MRD）是急性髓系白血病（AML）中用于优化风险评估和预测复发的重要预后生物标志物。这些关于MRD一致且准确识别与检测的最佳实践指南和建议，可有助于制定有效的AML治疗决策。

摘要

急性髓系白血病（AML）的疗效评估标准近期已重新确立，其中形态学检查被用于判断患者是否达到完全缓解（CR）。大约一半进入完全缓解的成年患者会在12个月内复发，原因是骨髓中残留的AML细胞重新增殖。对这些残存白血病细胞的定量，即所谓的微小残留病或可测量残留病（MRD），可作为预测复发的强有力生物标志物。此外，多项研究的回顾性分析表明，AML患者骨髓中存在MRD与较差的生存率相关。不仅反映携带白血病相关免疫表型（LAIP）细胞的总体白血病细胞群与临床预后相关，而且白血病干细胞（LSC）这一不成熟且频率较低的亚群也与预后相关，这两类细胞均可通过流式细胞术MRD或类似MRD的方法进行监测。基于疾病特异性或疾病相关特征（异常分子标志物或异常免疫表型）来检测残留白血病（干细胞）的高灵敏度检测方法的出现，已极大改善了AML中MRD的评估。然而，鉴于AML本身具有内在的异质性和复杂性，在可能的情况下，骨髓取样及MRD和LSC分析的方法应尽可能实现标准化。本文中，我们描述了一套详细的方法，涵盖合格的骨髓穿刺抽吸取样、样本运输、样本处理以优化多色流式细胞术检测，以及用于评估MRD和LSC的设门策略，以辅助AML患者的治疗决策。

引言

急性髓系白血病（AML）是一种骨髓恶性肿瘤，其特征是髓系前体细胞的成熟程序存在缺陷，导致异常增殖和积聚，抑制正常造血功能，并最终引发骨髓衰竭。该疾病在形态学、免疫表型、细胞遗传学、分子异常以及基因表达谱方面具有高度异质性，同时在治疗反应和治疗结局上也存在显著差异1,2。目前的治疗策略包括诱导化疗，旨在实现完全缓解（CR），随后进行缓解后治疗；后者主要依据分子、细胞遗传学和免疫表型研究的结果来制定，治疗方案包括多疗程的附加化疗或（自体或异基因）干细胞移植3。尽管强化化疗后的缓解率可高达90%，但成人患者的5年生存率仅为约30%–40%，主要原因在于疾病复发，而复发病例通常对化疗耐药，治疗极为困难。儿童患者的预后较好，但仍有约三分之一会经历复发。因此，对即将发生的复发进行早期检测将填补一项尚未满足的临床需求，并可能指导缓解后的治疗决策4。

治疗后残留病灶可能反映了所有诊断及诊断后耐药机制/因素的总和；因此，对其检测可能具有预后价值，并有助于指导治疗。目前，定义残留病灶（既往称为微小残留病灶，现称为可测量残留病灶，MRD）的灵敏度已远低于形态学标准的5%原始细胞阈值，这正在改变风险分层的格局。目前，检测MRD最常用的两种方法分别为基于流式细胞术的方法和基于分子生物学的方法，后者可通过逆转录定量PCR（RT-qPCR）5进行检测，或虽仍处于早期阶段但也可通过下一代测序（NGS）进行检测。大量针对成人和儿童的研究已表明，多种MRD检测方法在诱导治疗和巩固治疗后均能为急性髓系白血病（AML）提供强有力的预后信息6,7，一种优于形态学完全缓解（CR）的新疾病负荷定义正在逐步确立8。这提示，通过流式细胞术和/或分子生物学技术评估的MRD应成为、并且实际上正在成为AML所有临床试验中的标准指标。

本文讨论了通过流式细胞术对骨髓样本中的微小残留病（MRD）进行准确且可重复的免疫表型表征的详细操作流程，包括流式细胞术前的骨髓取样与样本处理步骤。在诊断和随访阶段获得高质量的骨髓样本，对于在不同临床机构和临床试验中成功实施该检测至关重要。事实上，这些分析前因素对于分子学方法（如PCR和NGS）检测MRD同样具有重要意义。在MRD的免疫表型表征中，通过将异常表达的标志物与正常的髓系及前体细胞标志物联合使用，以识别白血病相关免疫表型（LAIP）9。MRD反映了多种影响治疗反应的因素的综合作用，包括白血病细胞的内在或获得性耐药性、治疗药物的药效动力学与药代动力学、免疫监视功能以及患者依从性。因此，当通过受试者工作特征（ROC）曲线分析确定阈值并据此将MRD分为阳性或阴性时，MRD是一个与临床结局密切相关的强有力诊断后预后指标。在我们的HOVON 42a研究成人急性髓系白血病（AML）队列中，该阈值设定为LAIP阳性细胞占总白细胞的0.1%。采用此标准判断MRD阴性或阳性状态，可识别出一组具有显著更高复发率以及更差无复发生存率和总生存率的患者6。此外，我们还描述了对具有干细胞样特征（CD34+CD38- 白血病干细胞，即LSC）的未成熟耐药白血病细胞的检测，该指标可强有力地预测患者预后10。LAIP与LSC方法共同构成了基于流式细胞术的MRD检测策略。LAIP方法适用于约90%的患者，而LSC方法适用于约80%的患者。综合来看，超过95%的患者可至少接受其中一项参数的评估，或同时接受两项评估。

最后，本出版物提供了通过流式细胞术评估微小残留病（MRD）的详细操作说明。内容包括：1）骨髓采样程序的协调和/或标准化，2）样本运输指南，3）使用多种抗体组合通过流式细胞术（FACS）检测白血病细胞的详细描述，包括采用单管单细胞方法对白血病干细胞（LSC）进行表征，4）为实现标准化检测而进行的FACS仪器设置，5）用于MRD检测的分析程序，以及6）用于LSC检测的分析程序。

我们的目标是展示该操作的所有方面，包括样本制备，因为尽管样本制备对最终结果的质量至关重要，却很少被讨论。骨髓穿刺和骨髓活检是用于评估骨髓中造血细胞的临床操作。这些操作通常与全血细胞计数（CBC）和血涂片检查一并进行。骨髓穿刺的最佳方法对于准确诊断以及微小残留病（MRD）检测的随访至关重要。此外，一次成功的骨髓穿刺应获取足够数量的细胞，以进行LAIP和LSC流式分析（至少1000万个活细胞）。本文描述了骨髓穿刺的操作方法，并提供了相关指南，以确保获得足够的细胞样本（并尽量减少血液稀释的可能性），满足准确诊断及进一步研究的需求。这些分析前的注意事项对于分子学方法（如PCR和NGS）检测MRD同样至关重要。所有用于免疫表型分析的标本应优先在采集后24小时内处理。尽管不推荐，骨髓和外周血样本在室温下保存不超过72小时仍可进行处理和分析。此外，所有样本操作均应在无菌条件下进行，以便后续对无菌细胞进行冷冻保存，用于研究或质量评估等用途。

方案

本方案遵循荷兰VU大学医学中心的研究规范和研究伦理委员会的指导方针。

1. 骨髓穿刺与样本制备

  1. 患者与材料准备
    1. 使用16号针头将1%利多卡因注入一个或两个10 mL注射器中，随后更换为21号针头。
    2. 在表面皿上滴加两滴5% EDTA。
    3. 准备载玻片（n=15，标注一致的患者编号和日期），用于涂片制备。
    4. 将患者置于侧卧位，定位髂后上棘，并用笔标记。
      注：通常，髂后上棘位于髂嵴远端约一手掌宽度、中线外侧约一手掌宽度处。在女性中，该骨性突起可能略偏外侧，而在部分男性中可能略偏内侧。
    5. 用含0.5–1%氯己定的乙醇溶液以目标穿刺区域为中心向外环形消毒皮肤。
    6. 打开无菌手套包装，戴上无菌手套，并将包装纸平铺于桌面以建立无菌区域。打开骨髓穿刺针包装，将其放置于无菌区域内。
    7. 浸润皮肤、皮下组织，最终达骨膜。在骨膜处注射利多卡因，确保直径约1 cm的区域被充分麻醉。
      注：对骨膜充分注射利多卡因是保障患者舒适度的最重要因素之一。可通过穿刺针轻叩目标穿刺点并询问患者是否感到疼痛，以测试骨膜麻醉是否充分。需注意：儿童在整项操作过程中均接受全身麻醉。
    8. 手持骨髓穿刺针（15 Ga × 2.8″），近端置于掌心，示指抵住针体金属杆靠近针尖的一侧；此握持方式可提供更好的控制力。
    9. 以旋转动作（快速交替进行旋前/旋后运动）将穿刺针经皮肤穿入，朝向髂后上棘方向推进，直至针尖接触髂后上棘骨面。
    10. 确保穿刺针进入已麻醉的骨膜区域；此时患者应仅感到压力而无疼痛。若患者感到疼痛，应重新调整针的位置，或追加利多卡因注射。
    11. 施加轻柔但坚定的压力，同时以交替顺时针-逆时针方向旋转推进穿刺针。通常当穿刺针进入骨髓腔时，阻力会明显降低。
    12. 从穿刺针中取出针芯，将一个10 mL空注射器连接至穿刺针上。
    13. 通过轻柔抽拉注射器活塞施加负压。提前告知患者在抽取骨髓时可能会感到抽筋样感觉或疼痛。若未获得足够骨髓小粒，可再进行一次快速抽吸。大多数骨髓小粒存在于首次抽吸所得的前1–2 mL样本中。仅抽取1–2 mL，以避免样本稀释。
      注：样本稀释将导致血液稀释，可能干扰MRD检测结果。
    14. 取下注射器，重新插入针芯。将部分骨髓排入表面皿，其余部分排入一支8 mL肝素抗凝管中。
      注：骨髓样本注入标本管后应立即轻轻颠倒混匀，以确保充分抗凝。骨髓凝固常是导致样本不合格的原因。可从同一穿刺点再次抽取额外骨髓，但更推荐在首次穿刺基础上将穿刺针前移5–10 mm后再行抽吸。建议每次穿刺深度最多不超过两次抽吸。务必在试管上标记递增编号，以表示第一次、第二次或后续抽吸样本。通常应优先使用第一次抽吸样本进行最重要的诊断分析。
    15. 或者，可将穿刺针从原穿刺点退出，再于原穿刺点数毫米外重新穿入骨髓腔，并重复操作。
      注：每次抽吸量不应超过1–2 mL，以避免显著的血液污染。
    16. 根据所需材料量重复操作。当获得满足特定临床研究方案所需的足够材料后，拔出骨髓穿刺针。
      注：若骨髓抽吸缓慢或困难，使用预先用抗凝剂冲洗过的注射器可能有所帮助。若出现“干抽”（dry tap），应进行骨髓活检（trephine biopsy），此操作不在本文讨论范围内。
  2. 用于形态学检查的涂片制备
    1. 为获得最佳形态学评估效果，从表面皿中的骨髓样本中挑取骨髓小粒（例如使用塑料刮刀），置于载玻片上。
    2. 将另一张载玻片轻轻覆盖于含有骨髓的载玻片上，并轻轻滑动；避免施加压力。
      注：仅当骨髓小粒非常大时，可施加轻微压力以减少细胞层厚度。此过程可由助手协助处理标本管，提高效率。准确标记每支试管上的患者编号及骨髓抽吸顺序编号至关重要。
    3. 彻底干燥载玻片，随后进行May-Grünwald-Giemsa染色（参见材料表）。在光学显微镜下观察细胞形态（见图1）。
      注：图1A显示正常骨髓涂片，包含多种功能细胞类型；而图1B显示急性髓系白血病（AML）患者骨髓，以原始白血病细胞为主。为更精确评估残余白血病负荷，需进一步进行免疫表型分析。

2. 样本转运以进行后续处理

  1. 样本运输前的准备
    1. 为确保材料不会泄漏且试管不会破损，需进行正确的包装（参见 图2）。
      注：根据我们及他人的经验，骨髓样本在室温下保存时细胞活力最佳。对于长期运输，建议使用室温“凝胶包”以在运输过程中维持温度稳定。
    2. 对包装进行标签标注，并附上正确表格，以避免包裹丢失、运输延误或患者信息混淆。
      注：表格至少应包括：（表1）患者资料，需包含研究编号以及通常所需的“出生日期”；为确保接收实验室在样本到达后能正确处理，必须在该表格中明确注明所要求的具体实验室检测项目（如分子诊断、免疫分型、MRD等）。（表2）联系人的地址和电话号码，必要时还需附上海关相关文件。为避免邮件丢失，送检实验室应始终通知接收实验室已寄出样本。建议使用“追踪与追溯”服务。
  2. 接收来自其他机构的样本
    1. 确保所在机构具备适当的物流安排，以便样本送达机构后能立即送至实验室。
      注：为实现最优的物流组织，最好设立一个中心实验室，统一接收并收集来自本地诊所及外部医院的所有样本。尤其需要制定明确的样本分发流程，并与执行检测的实验室保持清晰沟通。
    2. 收到样本后，应在纸质记录表和安全的数据库中准确记录相应的编号信息，数据库应包含以下关键字段：MRD编号、试验特异性编号、医院登记号、送检机构、出生日期、样本类型（骨髓或外周血）、白细胞计数（WBC）、骨髓穿刺日期、样本检测日期，以及任何与检测质量相关的备注。
      注：理想情况下，该数据库还应能够存储附加数据（或与其他数据库连接），包括分析结果以及随访等进一步的患者信息。

3. 流式细胞仪设置

注意：本节基于 Euroflow 指南。11

  1. 光电倍增管（PMT）电压的设置，用于FCS、SSC参数及目标荧光通道
    1. FCS SSC 参数 启动流式细胞仪并执行 "流式细胞仪设置与追踪（CST）" 使用CST微球在流式细胞仪上进行检测（参见材料表）。裂解来自健康供体的红细胞（见第4.1节）。
      1. 创建一个新实验（在菜单中：Experiment → New Experiment → 选择 Blank experiment），使用制造商软件（见材料表），并设置前向散射光（FSC）与侧向散射光（SSC）的点图，以调整FSC和SSC参数。将此实验命名为FSC/SCC PMT加日期。首先使用当前流式细胞仪设置（右键点击： "应用当前 CST"）。这些设置是使用CST校准微球（见材料表）通过CST性能检查生成的。调整FSC和SSC以显示淋巴细胞 "全球实验设置"。注意：在我们的流式细胞仪中，这两个电压分别为 285 V 和 400 V。勾选确认 "启用补偿" 在：检测仪/仪器设置/补偿
      2. 通过测量未标记的裂解外周血细胞的前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）来评估细胞大小和颗粒度 "获取细胞" 功能。圈定淋巴细胞群，并调整/微调FSC和SSC电压，使圈选的淋巴细胞群达到以下平均目标值：FSC：100,000（范围95,000 - 105,000）；SSC：15,000（范围13,000 - 17,000）。
      3. 通过检测至少10,000个事件来获取并记录数据。验证门控淋巴细胞的FSC和SSC平均目标值，并在必要时重新调整。
    2. 使用8峰彩虹微球校准颗粒（见材料表）设置目标荧光通道的PMT电压。
      1. 在FACS上为7峰创建新实验。创建一个工作表 "目标平均荧光强度（MFI）" 包含所有必要的散点图（n=2；FSC 对 SSC，FITC 对 PE）、直方图（n=8；每个荧光检测器对应一个直方图）以及显示各荧光通道参考峰值（MFI 和变异系数（CV））的统计结果。
      2. 新鲜配制含有1滴（± 60 µL）彩虹珠加入 1 mL dH2O. 轻柔涡旋以混匀溶液中的微珠。
      3. 使用上述FSC/SSC电压的PMT设置，开始通过以下方式测量彩虹微球的荧光信号 "获取" 功能（不记录）于 "低" 流速设置阈值为5,000。使用 "矩形门控按钮" 在FSC与SSC散点图中圈选单一群珠子群体P1。圈选7th PEAK - FITC 与 PE 点图中 P2 群体。
      4. 继续采集7峰彩虹微球悬浮液，并根据随微球提供的标注MFI目标通道，在所有荧光通道中调整/微调光电倍增管（PMT）电压，以达到目标MFI值。
      5. 使用 "记录" 收集约 10,000 个事件的数据，并检测 7 的 MFIth 峰值微球。如有必要，校正光电倍增管（PMT）电压。一旦7种荧光标记的靶MFI值达到预期th 峰达到后，记录/覆盖文件以保存最终的PMT值。
      6. 保存最终的PMT值，并将文件命名为包含日期的PMT设置，该文件将保存在制造商软件的目录中。使用此PMT设置来校正每种荧光染料的溢出。
  2. 荧光补偿设置
    1. 为未染色对照管和每种荧光素偶联抗体分别标记试管（所用荧光素见表S1）。移取100 μL骨髓单个核细胞悬液至各管中。 µ每管加入 L 缓冲液。
    2. 充分涡旋混匀多色补偿微珠试剂管（见材料表），然后加入1整滴（约50 μL）± 60 µ将这些微珠各取 L 加入每管。
      注意：向各管中加入磁珠时，避免将磁珠滴在管壁上。这可能导致磁珠浓度过低，从而影响补偿矩阵的结果。
    3. 移液适量体积的荧光染料偶联抗体，该体积是根据一个检测所需的量计算得出的（足以标记106 将细胞加入相应的试管中并充分涡旋混匀。未染色对照管中不加抗体。室温（RT）避光孵育15至30分钟。
    4. 加入4 mL洗涤缓冲液（磷酸盐缓冲盐水（PBS）/0.05%叠氮化钠-0.1%人血清白蛋白（HSA）（见材料表））至每管中。将各管以300 × g离心g 离心10分钟。移除上清液，向每管中加入0.2 mL洗涤缓冲液，重悬磁珠沉淀。充分涡旋振荡各管。
    5. 打开制造商的分析软件（参见材料表），创建一个新实验（菜单路径：Experiment → New Experiment，选择 Blank experiment），并将其重命名为包含当前日期的补偿文件。
    6. 前往 "流式细胞仪设置" 并使用3.1节中的PMT设置。确保FSC的阈值为5,000，且所有所用荧光染料的补偿值均为零。
    7. 根据需要创建补偿对照，包括单标对照管，并务必包含未染色对照。从菜单中选择：实验、补偿设置、创建补偿对照。
    8. 加载未染色对照管，调整P1门以圈定单细胞微球群体，并确保P1门内仅包含单细胞微球。
    9. 右键单击 P1 门，然后选择 "应用于所有补偿对照"记录所有单标记荧光管的数据。验证P2门是否包含每个荧光直方图中的阳性细胞群。如有需要，调整该门。
    10. 计算补偿。选择“实验”、“补偿设置”、“计算补偿”。
    11. 如果补偿计算未成功，将显示错误信息。请进行必要的调整后重新计算。当补偿计算成功时，会弹出对话框，提示输入补偿设置的名称。
    12. 输入一个名称（例如 YY-MM-DD 8色设置），然后点击、链接并保存。补偿设置也将被保存到补偿设置目录中。
      注意：对于使用相同荧光染料的所有实验，均可采用相同的设置。

4. 流式细胞术评估（LAIP 和 LSC）

注意：此处我们描述的是染色前的全裂解程序，该程序可使白细胞（WBC）达到理想的染色浓度。大多数微小残留病（MRD）检测方案均采用此方法，尽管也有部分方案成功采用了其他方法，例如裂解前染色。裂解前对全骨髓样本进行染色可最大限度减少特定细胞的丢失12，但其缺点是细胞浓度不可预测，可能过低。

  1. 细胞大量裂解
    注意：若无法在当天进行流式细胞术检测，需将未经处理的样本在室温下保持水平放置，以便次日启动完整实验流程。
    1. 将抗凝骨髓样本通过反复倒置混匀至均匀状态。使用细胞计数板和 Turk 细胞染色液（见材料表）对骨髓细胞浓度（白细胞计数（WBC））进行测定。
    2. 将所需体积的骨髓液用移液器转移至另一支15 mL离心管中。细胞用量取决于分装染色管的数量；每份染色（每管）使用约2 x 106 用于LAIP检测的白细胞以及8x106 用于LSC管检测的白细胞
    3. 通过加入溶血溶液（见材料表）裂解红细胞。溶血溶液的所需体积应为细胞悬液体积的10倍。
    4. 轻轻颠倒混匀，在室温下孵育10分钟。在室温下以800g离心7分钟。弃去上清液（例如使用真空泵或巴斯德吸管）。在室温下用磷酸盐缓冲液（PBS）/0.05%叠氮化钠-0.1%人血清白蛋白（HSA）（见材料表）重悬细胞沉淀，使用管子的最大容积。
    5. 在室温下以800g离心7分钟。 弃去上清液（例如使用真空泵或巴斯德吸管）。将细胞沉淀重悬于 PBS/0.05% 叠氮化钠-0.1% HSA 中，调整细胞浓度至 100×10⁶ 细胞/mL。6 WBC/mL，并根据计划使用的试管数量进行分配。
  2. 用于流式细胞术的细胞染色
    1. 将单克隆抗体（MoAb）混合溶液加入相应的荧光激活细胞分选（FACS）管中，与裂解后的骨髓细胞在避光条件下孵育15分钟。
      注意：当使用串联染料时，这一点尤为重要。例如，参见我们实验室常规使用的检测 panel 的混合物（表 S1）。
    2. 用 3 mL PBS/0.05% 叠氮化钠-0.1% 人血清白蛋白洗涤细胞，在 400 ×g 条件下离心 5 分钟g. 弃去上清液（例如使用真空泵或巴斯德吸管），然后将细胞沉淀重悬于 300 µL PBS/0.05% 叠氮化钠-0.1% HSA
    3. 用于LSC检测：将细胞沉淀重悬于400 µL PBS/0.05% 叠氮化钠-0.1% HSA，并加入 4 µL 空白微球（例如 Spherotech，参见材料表），用于分析中的阴性对照群体。
    4. 在FACS（见材料表）上打开MRD或LSC实验布局，对AML患者诊断时的样本以及治疗后样本进行检测，测量MRD时至少采集100,000个经WBC设门的事件6 随访时 AML 样本的白细胞计数。对于 LSC 实验，至少检测 4x106 诊断和随访时的白细胞计数均需可靠，以获得准确的LSC结果。
    5. 使用标准化的适当文件名保存数据，以便进行结果分析。记录急性髓系白血病细胞及白血病干细胞上不同检测标志物的表达情况（阳性、阴性、过表达/低表达），并将这些数据存入实验记录本中。
    6. 若无可用于诊断的LAIP，则在随访时检测全部4个样本管，以确保可通过不同于正常细胞的免疫表型模式识别出任何可能存在的可测量LAIP。
    7. 选择最可靠的LAIP（白血病相关免疫表型）13 在诊断时建立并尽可能获取更多的事件 > 最低数量定义。

5. 白血病相关免疫表型（LAIP）的鉴定：不同细胞群体的分析

注意：FCS 文件可使用多种软件程序进行分析，以实现对不同细胞群的最佳可视化（参见材料表）。

  1. 白细胞群体
    1. 圈选FSC/SSC图中CD45阳性且形态上存活的细胞，排除低FSC信号的细胞（如非活细胞、红系细胞）；这些细胞包含白细胞（WBC）图3Ai）。显示白细胞，并使用一种原始细胞标志物（例如 CD34；图3Aii)以帮助确定幼稚细胞在CD45dim区域的最终位置（图3Aiii).
    2. 圈选 CD45dim 细胞，并反向圈选 FSC/SSC 图中的细胞（图3Bi）。移除 CD34 门（gate）图 3Bii) 同时在程序的群体树中将此门内的细胞百分比报告为原始细胞百分比。在SSC/CD34图中显示原始细胞，并圈定CD34阳性细胞（图3Biii).
  2. 淋巴细胞
    1. 使用淋巴细胞作为内部对照：以髓系细胞群为阴性对照，淋巴细胞群为阳性对照。
    2. 从白细胞群体开始（图4A）。以CD45设门淋巴细胞高/SSC低 群体（图4B).
    3. 确保使用 CD34、CD117、CD13 或 CD33 排除门控中的髓系细胞，并圈选 CD13 阴性/CD33 阴性细胞图4C-E）。在群体树中将此群体命名为“淋巴细胞”（lymphocytes）图4F).
  3. 诊断时的LAIP
    1. 在SSC/CD34图中圈定原始细胞，随后圈定CD34阳性细胞，并在群体树中将这些细胞标记为“原始标志物”。
    2. 在新图中绘制原始细胞（此处为CD34阳性）和淋巴细胞，以淋系标志物（CD7）对髓系标志物（CD33）作图。圈定异常细胞群（参见补充文件1中的指南），并在细胞群树中将其命名为“LAIP阳性”。
      注意：最终选定的LAIP以占原始细胞群的百分比（% LAIP）形式报告。LAIP的灵敏度、特异性和稳定性仅能由具备丰富MRD检测经验的人员进行评估。这些参数的综合结果决定了LAIP的质量。以下是诊断时四种不同LAIP评估示例 图5 A-D.
    3. 确定LAIPs的表达水平（占原始细胞的百分比），并将这些数据保存在数据库或Excel文件中。
    4. 制作FACS分析报告以及用于MRD检测的LAIPs记录。
      注意：由于LAIP的定义对于随访期间准确的MRD检测至关重要，因此须由专家团队进行授权确定。
  4. 随访时的微小残留病
    1. 按照5.1中所述圈定原始细胞群，但需根据治疗后的时间点进行调整；该圈门的准确判定可能具有挑战性。应重点关注诊断时确定的LAIP表型，并圈定其中的未成熟细胞群体。
    2. 如5.1节所述，根据定义的异常特征确定正确的原始细胞门，并注意再生骨髓及正常表达，以将其排除在门控之外
    3. 在所有随访时间点重复相同的设门策略，并以LAIP细胞占全部白细胞群体的百分比来确定MRD。示例见下文 图6A 以及 6B.
    4. 当MRD百分比≥白细胞总数的0.1%时，报告为MRD阳性。将分析数据以标准格式打印，供每周与MRD团队讨论。在达成共识后登记结果。结果须经主管授权后，方可向临床医生通报。

6. 干细胞微小残留病（LSC单管）分析14

  1. 诊断及随访期间对LSC的分析
    1. 按照第5.1节所述方法圈定原始细胞群。
    2. 以红细胞组分作为CD38阴性的潜在阴性对照（即裂解后残留的红细胞，其特征为SSClow/FSClow且CD45negative）。如有必要，可在该图中通过额外设门排除死细胞和细胞碎片。
    3. 在白血病原始细胞门内确定表达CD34的亚群。在该群体中选择CD34+ CD38-细胞（设门阈值可采用空白校准微珠的上限、红细胞组分，或以103作为截断点）。将该群体命名为“CD38low前体细胞”（图7）。
      注：有关设定CD38阴性截断水平的更多细节，请参见补充文件1。
    4. 在该CD38low群体中，进一步确定真正的CD34+CD38very low干细胞群体，可使用红细胞组分的中位值、空白校准微珠的下限，或选择102作为截断点（图7）。有关设定CD38阴性截断水平的更多细节，请参见补充文件1。
    5. 在上述两个群体中，通过分析面板中提供的每一项白血病相关标志物（即CD45RA、combi-6（CLEC12A、TIM-3、CD7、CD11b、CD22和CD56，均标记PE）、CD123、CD33和CD44），区分白血病干细胞与正常造血干细胞（LSC vs HSC）。
    6. 将感兴趣的干细胞标志物与其他干细胞标志物作图，比较其阳性/阴性与其它标志物阳性/阴性的关系，以优化LSC与HSC频率的区分。
    7. 报告未成熟原始细胞、淋巴细胞、CD34+细胞的百分比。针对每个单独标志物，列出CD38low 和CD38verylow的总细胞数，以及其中标志物阳性（即肿瘤性）的CD38low 和CD38verylow细胞数。
    8. 选择最能区分正常造血干细胞与白血病干细胞的标志物用于进一步分析。计算LSC和HSC占全部白细胞总数的百分比。
      注：在诊断时，若LSC百分比≥0.004%则报告为LSC阳性；而在随访时，截断值为0.0001%。随访样本中异常干细胞的设门方法与诊断时相同，但干细胞群体中的细胞数量可能极低，因此必须采集足够数量的事件。

结果

在90%的急性髓系白血病（AML）患者中，至少可以识别出一种白血病相关免疫表型（LAIP）。为了在诊断时准确计算LAIP阳性细胞占原始原始细胞的比例，正确设定原始细胞设门至关重要，其验证过程如图所示。 图3每例患者在CD34+原始细胞中携带特定类型异常的示例图示如下所示 图5. 在随访期间进行微小残留病（MRD）检测时，需圈定先前定义的LAIP+细胞，并将其占白细胞（WBC）总数的百分比作为LAIP+细胞的比例。因此，该圈门的设定对于获得准确的MRD结果至关重要。 图6 显示一位患者在第二次诱导治疗周期后微小残留病灶（MRD）呈阳性（≥ 0.1%）并出现复发，以及另一位患者保持完全缓解。

目前该实验方案仅适用于在 CD34+ 细胞中定义干细胞，因为对该细胞亚群的深入表征表明，CD38- 群体含有最具潜能的干细胞样细胞组分。为了在此组分中将白血病干细胞（LSC）与造血干细胞（HSC）区分开来，需使用额外的标记物。最常用于区分 LSC 的标记物是 CD45RA 以及一个包含 6 种特异性 LSC 标记物并用 PE 标记的组合通道。根据进一步的临床评估，定义 ≥ 0.004% 为 LSC 阳性阈值，该水平与诊断时更差的生存率相关；而在随访时则采用 0.0001% 作为阈值10。

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图1： 骨髓涂片。 A）健康供者和B）急性髓系白血病患者（FAB 5亚型）。Giemsa染色，放大倍数为100倍。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图2：生物液体的正确包装材料。 有关运输生物液体的规则与法规的更多详情，请访问美国疾病控制与预防中心的网站15。请点击此处查看此图的放大版本。

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图3：定义原始细胞的设门策略。 A) 设门 CD45dim，B) 设门 CD34+ 原始细胞。

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图4：淋巴细胞设门。 A) 蓝色细胞为FSC/SSC图中显示的白细胞，B) 绿色细胞为具有CD45high/SSClow特征的淋巴细胞，C) CD34阴性表达示例，D) CD117阴性表达，以及E) CD13阴性表达，F) 不同细胞类型的总体群体树状图。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图5：急性髓系白血病（AML）诊断时的白血病相关免疫表型（LAIP）。 A) 基于跨谱系异常（CD33阳性细胞表达CD7）的LAIP；B) 基于异步分化（CD13阳性细胞表达CD11b）的LAIP；C) 基于与正常细胞相比过表达（CD13阳性细胞上CD34极强表达）的LAIP；D) 基于与正常细胞相比低表达（CD33阳性细胞上HLA-DR弱表达）的LAIP。请点击此处查看该图的放大版本。

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图6：治疗过程中监测的LAIP变化。 A) 诊断时定义的LAIP（CD34+/CD13+/CD33-），以及在持续完全缓解患者随访期间LAIP的消失；B) 诊断时定义的LAIP（CD117+/CD7+/CD33+），以及在复发患者随访期间LAIP的持续存在。请点击此处查看该图的放大版本。

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图7：干细胞设门策略。 A) 基于微球的CD34+/CD38不同细胞群设门（CD38low位于微球上边界以下，而CD38very low定义为真正阴性细胞，代表白血病干细胞（LSC），位于微球中位值以下）；B) 两名患者在随访期间基于CD45RAneg和CD45RApos表达区分造血干细胞（HSC）与白血病干细胞（LSC）的两个示例。请点击此处查看该图的放大版本。

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讨论

已有大量数据表明，微小残留病（MRD）阳性与较差的生存率相关，因此通过提供可用于临床决策的额外预后信息，MRD评估可能改善患者治疗结局。因此，建立一致且标准化的免疫表型MRD评估方法对于最终优化患者治疗至关重要。在比较不同临床机构之间的临床研究时，该标准化方法同样具有重要意义，并可能最终有助于临床决策，以及作为总生存期的替代临床终点。鉴于准确且一致的MRD检测亟需明确的指导原则，欧洲白血病网（European Leukemia Network, ELN）已采取协同行动，制定最先进的指南。该综合性文件将于2017年底发布，对未来众多研究团队和实验室的工作将起到关键指导作用。

方案中的关键步骤

微小残留病（MRD）分析中一个关键但常被忽视的方面是样本质量对MRD准确检测的影响。在全球性临床试验中，当样本需要被转运至其他机构时，这一问题尤为突出，因为此时需考虑更多的操作因素。为降低患者信息混淆的风险并确保样本及时送达，充分的管理至关重要。在此运输阶段，必须使用正确的表格，和/或在电子医院系统中进行录入，并明确标注所要求的检测项目。记录MRD取样时所处的治疗阶段也至关重要，因为该信息可能与临床决策相关（例如在第二疗程治疗后），因此应予以清晰定义。使用模拟数据（例如每年出生年份均设为1月1日）会增加患者或检测结果混淆的风险。若法律有要求，应采用其他匿名化的方式进行身份识别。

用于免疫表型分析的所有标本应优先在采集后24小时内进行处理。尽管不推荐，骨髓和外周血样本在室温下保存不超过72小时仍可进行处理和分析。此外，所有对标本的操作最好在无菌条件下进行，以便后续细胞可在（本地）生物样本库中冷冻保存：许多临床研究需要在后期进一步开展分子、免疫表型及功能特征等方面的分析，以深入研究白血病细胞。然而，生物样本库保存的具体细节不在本文讨论范围之内。

将微小残留病（MRD）作为诊断工具意味着需要一个经过认证的实验室，不仅用于流式细胞术，还涉及MRD评估的质量控制。这可能需要将样本分发至特定的参考实验室，或由参考团队对包含MRD检测结果的流式数据文件进行（重新）分析。

本文介绍了从骨髓穿刺液采集到临床样本中微小残留病（MRD）检测的各个关键步骤——这一过程需要一个由专家组成的团队，每位成员承担特定的任务与责任，并通过频繁沟通以实现有效的表征与分析。由于每个步骤对整个流程都至关重要，因此建议建立完善的后勤保障体系，包括各实验室均应具备标准化操作规程，以及配备经过专门培训的足够后备人员。此外，由于部分操作步骤（尤其是LAIP和LSC异常标志物的识别）具有一定的主观性，团队必须对最终结果进行讨论，并由一组主管人员共同审核并授权最终报告。目前，相关研究正致力于开发计算机软件，以推动（LAIP和LSC）MRD分析的标准化进程。

修饰与故障排除

每个实验室可以使用自己的一组抗体来定义不同的亚群，但为了获得可比较的结果，必须建立标准化的核心标志物组合，这一点在上述 ELN 关于微小残留病（MRD）检测的最新技术指南文件中已有明确说明。无论选择何种标志物，都存在一些可能使结果分析变得困难的问题，需要加以考虑。

该技术的局限性

在诊断时首先评估LAIP和LSC异常标志物的表达情况，并在治疗期间及治疗后持续监测，以准确表征微小残留病（MRD）的表型。尽管超过95%的患者可通过LAIP或LSC（或两者联合）进行评估，但仍有一些患者缺乏明确的LAIP，或不存在CD34+CD38-的LSC，或表现为CD34阴性的原始细胞，或缺少诊断时的样本。对于这些情况，仍值得尽可能使用抗体组合进行MRD检测，抗体数量应根据可获取细胞的数量达到最广泛覆盖，随后选择最可靠（能够最清晰区分白血病细胞）的LAIP。鉴于部分最终复发的患者其免疫表型与诊断时并不完全一致，这是由于急性髓系白血病（AML）具有异质性，因此建议在MRD检测时使用广泛的抗体组合。这些免疫表型变化涉及原始细胞和LSC，已被证实可在治疗过程中发生16，可检测到的疾病可能正是基于这些所谓的新兴细胞群。然而目前尚不明确所有免疫表型亚群是否均会导致疾病复发，因此在临床试验中，基于这些细胞制定个体化MRD治疗方案尚未成为常规做法。需要注意的是，采用单管法可降低因细胞群变化而遗漏LSC的风险，该方法将定义最重要异常特征的标志物集中于一个流式细胞术（PE）通道中14。

相对于现有方法的意义

本方案中所述的方法依赖于定义一个或多个在治疗过程中用于追踪细胞的白血病相关免疫表型（LAIP）。该方法的一个缺点是，最近的研究表明，LAIP可能在治疗过程中发生变化。因此，一些具有不同异常标志物的新出现细胞群体可能会被遗漏。为避免这一问题，最好检测所有异常标志物，而不仅限于诊断时发现的标志物。这种方法将类似于多个实验室所采用的“与正常细胞不同”的策略17。

未来应用

近年来，微小残留病（MRD）在新型临床试验设计中受到更多关注。在个体化治疗选择和靶向药物治疗的时代，将MRD作为结局指标可缩短确立新疗法临床有效性所需的时间，最终加快急需的治疗方案进入临床应用。由于美国食品药品监督管理局（FDA）目前正在评估将MRD作为总生存期替代终点的可行性，因此，实现标准化MRD检测的适当后勤安排与实际操作对今后急性髓系白血病（AML）治疗的成功至关重要18。

披露

用于在多个独立研究机构验证干细胞检测管的抗体混合物由BD公司慷慨提供。作者声明本论文无任何利益冲突。

致谢

本研究得到了荷兰癌症协会（ALPE 2013-6371）和Egbers基金会对VONK的支持。我们感谢荷兰急性髓系白血病微小残留病（AML-MRD）工作组的合作以及富有成效的讨论，这些讨论推动了AML-MRD检测的持续改进和标准化。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BD 生物科学120995496,060996589 和 013729FACS Canto II 
BD 生物科学555360CD7 FITC
DAKOF076701CD2 FITC
SanquinM1613CD36 FITC
BD 生物科学332778CD15 FITC
BD 生物科学335039CD45RA FITC
BD 生物科学345810CD56 PE
BD 生物科学337899CD22 PE
BD 生物科学345785CD14 PE
Miltenyi Biotec130-080-801CD133 PE
BD 生物科学562566Clec12a PE
BD 生物科学565568Tim-3 PE
BD 生物科学332774CD7 PE
BD 生物科学333142CD11b PE
BD 生物科学337899CD22 PE
BD 生物科学345810CD56 PE
BD 生物科学347222CD34 PERCP-CY5.5
BD 生物科学558714CD123 PERCP-CY5.5
Beckman CoulterB49221CD117 PE-CY7
BD 生物科学562854CD33 BV421
BD 生物科学345791CD19 APC
BD 生物科学333143CD11b APC
BD 生物科学345800CD33 APC
BD 生物科学345807CD38 APC
BD 生物科学641411HLA-DR APC-H7
BD 生物科学560532CD44 APC-H7
BD 生物科学562596CD13 BV421
BD 生物科学348811CD34 PE-CY7
Beckman CoulterA96416CD45 Krome Orange
BD 生物科学655873CD45 HV500c
BD 生物科学655051CST beads 
BD 生物科学555899Pharm 溶血溶液
BD 生物科学644204多色补偿微珠
BD 生物科学655051CST beads
BD 生物科学FACSDiva 软件
CytognosInfinicyt 
SpherotechEuroflow RCP-30-5a
Sigma-AldrichTürk 溶液
SpherotechBCP-100-5空白校准颗粒微珠
      HSA
      叠氮化物
      ddH2O

参考文献

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