我们介绍一种基于芯片的平台，用于在微型生物反应器中进行细胞的三维培养。一块芯片可容纳多达1000万个细胞，并可在无菌、封闭的循环系统中，对流体流动、氧张力等条件进行精确控制，从而实现细胞培养。
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本文内容
摘要
摘要
我们开发了一种基于芯片的细胞培养系统，用于细胞的三维培养。该芯片通常由非生物降解性聚合物（如聚碳酸酯或聚甲基丙烯酸甲酯）通过微注塑成型、微热压印或微热成型工艺制造而成，但也可使用可生物降解的聚合物制造。芯片的整体尺寸为0.7–1 × 20 × 20 × 0.7–1 mm（高 × 宽 × 长）。所用芯片的主要结构特征为：最多包含1156个立方形微容器的网格结构（cf-芯片），每个微容器尺寸为120–300 × 300 × 300 μm（高 × 宽 × 长）；或直径300 μm、深度300 μm的圆形凹腔（r-芯片）。该支架可在三维构型中容纳一千万个细胞。为了实现最佳的营养物质和气体供应，芯片被置于生物反应器外壳中。该生物反应器是封闭无菌循环回路的一部分，在最简单的配置中，该回路还包括一个滚压泵和一个带有气体供应的培养基储液罐。生物反应器可运行于灌注、上流灌注，甚至混合操作模式。我们已成功培养多种细胞系及原代细胞达数周之久。对于大鼠原代肝细胞，我们证实其器官特异性功能可维持超过两周；对于肝细胞癌细胞系，我们观察到在标准单层培养中不表达或仅微弱表达的肝脏特异性基因被显著诱导表达。该系统也可能适用于干细胞培养，因为初步的干细胞系分化实验结果令人鼓舞。
方案
本文介绍了一种基于芯片的平台（图1），用于细胞系以及原代细胞的三维培养。由于许多细胞仅在三维环境中才能表达器官特异性功能，我们开发了一种聚合物芯片，该芯片可为细胞提供可在所有空间方向上黏附的支架，并可安装于生物反应器外壳中，以调控流体流动、氧张力等条件。根据实验设计的不同，可通过多种技术对聚合物表面进行修饰，例如紫外照射、等离子体增强化学气相沉积（PECVD）、γ射线接枝或传统的湿法化学处理。
图 01
1. 芯片的脱气与亲水化处理
使用前，芯片必须进行脱气和亲水化处理。为此，需进行一系列酒精处理。配制含有100%、70%、50%、30%异丙醇的DMPC处理水溶液，将芯片依次浸入各浓度溶液中，从100%溶液开始，每步不超过30秒。该系列处理的最后一步是使用纯二甲基焦碳酸酯（DMPC）处理水。自此之后，必须始终保持芯片湿润。
2. I型胶原包被
经过酒精系列处理后，芯片通常会用大鼠尾部来源的I型胶原溶液进行包被。从浓度为2 mg/ml、溶于0.2%乙酸的胶原蛋白储备液中取一份相当于30 μg胶原蛋白的 aliquot，用DMPC处理过的水稀释至终体积150 μl。这样可在芯片表面形成每cm2面积上含10 μg I型胶原蛋白的包被密度。
3. 肝细胞癌细胞的接种
将 Hep G2 细胞系的肝细胞癌细胞进行胰蛋白酶消化并计数。对于短期实验（1 至 6 天），将 5×106 个细胞接种至每个芯片以及相应的对照 6 cm 组织培养培养皿中。接种时，将 5×106 个细胞重悬于 150 μl 培养基中，并加至芯片的微结构区域上方（图 2）。随后，将芯片置于培养箱中孵育 2–3 小时。在此孵育期间，细胞沉降进入微容器中，并黏附于 I 型胶原包被的支架上。
图2
4. 将芯片插入生物反应器外壳
孵育结束后，将芯片从培养箱中取出，并安装到生物反应器外壳中。在超净台内，将预先组装好的生物反应器从无菌包装中取出，并部分拆解，以便插入芯片。使用无菌镊子小心操作芯片，将其放入带有密封垫圈的凹槽中，该垫圈可密封芯片，并在生物反应器内形成上、下两个腔室。随后，重新组装生物反应器，并转移至培养箱中，连接泵、气体供应装置和氧气分析仪。
5. 系统填充
当生物反应器与培养基储液罐、泵和气体供应连接后，即可向封闭循环回路中注入培养基。通过调整三通连接器的位置，使培养基流经芯片表面（即所谓的灌流），从而排出生物反应器循环系统中的封闭空气，同时不会将细胞从支架上冲走。当系统完全充满培养基后，将三通连接器切换至另一种状态，使培养基从芯片下方流经组织（即所谓的灌注）。在灌注模式下，流速需根据细胞需求进行调节，肝细胞的典型流速范围通常为 60–500 μl/min。
6. 取样
实验过程中可采集培养基样品。采集时，将注射器连接至培养基储液罐顶部的无菌取样口。取样后，用70%异丙醇对取样口进行消毒。
7. 从芯片中分离完整细胞用于下游应用
实验结束后，将生物反应器从气体供应系统和滚轴泵上断开，转移至超净工作台，并按前述方法拆卸。使用无菌镊子将芯片从生物反应器外壳中取出，放入3.5 cm的培养皿中，并用PBS冲洗。随后，将芯片置于含胰蛋白酶/EDTA（0.25%/0.53 mM）的孵育箱中孵育5–15分钟，以使细胞从微结构区域脱落。收集的细胞悬液在600 ×g条件下离心5分钟。所得细胞可用于常规的下游应用，例如总RNA或蛋白质的提取。常规操作中，我们使用总RNA（PARIS试剂盒，Ambion Inc.，Austin, Texas, USA）进行微阵列分析和实时RT-PCR。芯片内细胞的蛋白表达可通过激光扫描共聚焦显微镜进行免疫组织化学染色后分析，也可采用其他方法分析，例如流式细胞术。
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讨论
我们开发了一种基于芯片的平台，用于在主动灌注的微型生物反应器中进行细胞的三维培养。这些芯片可通过微注塑成型、热压印以及微热成形技术，使用非生物降解性或生物降解性聚合物制造3。根据实验设计，聚合物表面可通过紫外线照射进行修饰4。肝细胞系以及原代大鼠肝细胞均可在这些装置中成功培养，通过部分肝特异性基因的表达分析以及部分肝特异性蛋白质的分析已证实了其功能5,6。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢Mechthild Herschbach和Anke Dech提供的出色技术协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 细胞 | 其他 | ATCC | HB-8065 | |
| 大鼠尾胶原 I | 试剂 | Roche Group | 11 179 179 001 | |
| PARIS 试剂盒 | 试剂 | Ambion | AM1921 | |
| Syto16 | 试剂 | Invitrogen | S7578 | |
| 抗细胞角蛋白 18 抗体 | 抗体 | Abcam | ab668 | 一抗，小鼠单克隆抗体，按 1/100 比例稀释于 PBS 中使用 |
| 抗 E-钙黏蛋白抗体 | 抗体 | Abcam | ab1416 | 一抗，小鼠单克隆抗体，按 1/50 比例稀释于 PBS 中使用 |
| 羊抗人白蛋白抗体 | 试剂 | Bethyl Laboratories | E80-129 | 一抗，羊抗人白蛋白抗体，按 1/200 比例稀释于 PBS 中使用 |
| 兔抗小鼠 IgG1 抗体 | 抗体 | Invitrogen | A11059 | 二抗，Alexa Fluor 488 标记，按 1/100 比例稀释于含 0.5% BSA 的 PBS 中使用 |
| Cy3 标记抗山羊 IgG 抗体 | 试剂 | Jackson ImmunoResearch | 705-165-003 | Cy3 AffiniPure 驴抗山羊 IgG 抗体，按 1/700 比例稀释于含 0.5% BSA 的 PBS 中使用 |
参考文献
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- Seglen, P. O. Preparation of rat liver cells. 3. Enzymatic requirements for tissue dispersion. Exp. Cell Res. 82, 391-398 (1973).
- Giselbrecht, S., Gietzelt, T., Gottwald, E., Trautmann, C., Truckenmueller, R., Weibezahn, K. F., Welle, A. 3D tissue culture substrates produced by microthermoforming of pre-processed polymer films. Biomed. Microdev. 8, 191-199 (2006).
- Welle, A., Gottwald, E. UV-based patterning of polymeric substrates for cell culture applications. Biomed. Microdev. 4, 33-41 (2002).
- Gottwald, E., Giselbrecht, S., Augspurger, C., Lahni, B., Dambrowsky, N., Truckenmueller, R., Piotter, V., Gietzelt, T., Wendt, O., Pfleging, W., Welle, A., Rolletschek, A., Wobus, A. M., Weibezahn, K. -F. A chip-based platform for the in vitro generation of tissues in three-dimensional organization. Lab Chip. 7, 777-785 (2007).
- Eschbach, E., Chatterjee, S. S., Noldner, M., Gottwald, E., Dertinger, H., Weibezahn, K. -F., Knedlitschek, G., G, Microstructured scaffolds for liver tissue with high density: Morphological and biochemical characterization of tissue aggregates. J. Cell. Biochem. 95, 243-255 (2005).
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