Qa-1(人类中的 HLA-E)属于非经典主要组织相容性复合体 1b 分子家族。研究表明,使用 Qa-1 结合表位进行免疫可增强组织特异性免疫调节,并改善多种自身免疫性疾病。本文介绍一种重叠肽库策略,用于鉴定蛋白质中的 Qa-1 表位。
Qa-1(人类中的 HLA-E)属于非经典主要组织相容性复合体 1b 分子家族。研究表明,使用 Qa-1 结合表位进行免疫可增强组织特异性免疫调节,并改善多种自身免疫性疾病。本文介绍一种重叠肽库策略,用于鉴定蛋白质中的 Qa-1 表位。
Qa-1(人类中的 HLA-E)属于非经典主要组织相容性复合体 1b(MHC-Ib)分子家族。近期研究表明,Qa-1 分子在监测细胞的结构与功能完整性、诱导免疫调节以及限制对病毒感染的免疫应答中发挥重要作用。此外,通过表位免疫增强 Qa-1 限制性 CD8+ T 细胞功能已在多种自身免疫性疾病动物模型中显示出治疗效果,例如 实验性过敏性脑脊髓炎、胶原诱导性关节炎和非肥胖型糖尿病。因此,迫切需要一种能够高效、快速鉴定蛋白质中功能性 Qa-1 表位的方法。本文描述了一种利用针对重叠肽(OLP)文库的 Qa-1 限制性 CD8+ T 细胞系来确定蛋白质中 Qa-1 表位的实验方案。该 OLP 文库包含覆盖整个蛋白质序列的 15 肽重叠肽,相邻肽段之间重叠 11 个氨基酸。利用本方案,我们近期在髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)中鉴定出一个 9 肽 Qa-1 表位。新鉴定的 MOG Qa-1 表位可诱导表位特异性、Qa-1 限制性的 CD8+ T 细胞,从而增强针对髓鞘的免疫调节作用。因此,该方案有助于未来进一步研究 Qa-1 限制性 CD8+ T 细胞的新靶点及其功能。
Qa-1 属于小鼠中的一类非经典主要组织相容性复合体 1b(MHC-Ib)分子,其人类同源分子为 HLA-E。已有研究表明,Qa-1 分子具有重要的生物学功能。首先,Qa-1 分子在监测细胞结构与功能完整性方面发挥关键作用。在此过程中,Qa-1 分子进化出多种策略以监控细胞的正常功能。其中一种策略是 Qa-1 分子可与经过加工的信号肽(表位)形成复合物, 即 内质网中由经典MHC-Ia分子加工产生的Qa-1决定簇修饰肽(Qdm)1这些Qa-1/Qdm复合物随后呈现在细胞表面,并与NK细胞上的抑制性NKG2A受体结合,从而抑制NK细胞的杀伤活性。2如果MHC-Ia分子的表达缺失,细胞(例如恶性细胞)将对自然杀伤细胞(NK)的杀伤作用变得敏感。2另一种策略使Qa-1分子能够在缺乏TAP(抗原加工相关转运蛋白)的细胞表面形成新的Qa-1/表位复合物3 和/或ERAAP(内质网氨基肽酶,与抗原加工相关)4 (这两种缺陷在恶性细胞中常同时出现)。表达这些新Qa-1/表位复合物的细胞可被表位特异性的Qa-1限制性CD8+ T细胞。其次,Qa-1分子诱导免疫调节5在此方面,Qa-1/表位复合物已被证明可刺激CD8....
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所有实验均按照德克萨斯大学埃尔帕索分校和洛马林达大学动物护理与使用委员会批准的机构动物护理与使用方案进行。
1. 生成覆盖蛋白质全长的OLP文库
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覆盖蛋白质全长的OLP文库设计
从蛋白质的N端开始,每条肽段包含15个氨基酸(15肽)。因此,第一条肽段覆盖第1至第15位氨基酸。第二条肽段的N端与第一条肽段的C端重叠11个氨基酸,因此其覆盖第5至第19位氨基酸。按照此方式设计肽段,直至覆盖蛋白质C端(图1)。我们选择15肽文库,是因为我们及其他研究者已证实,当15肽被加入树突状细胞(DCs)或巨噬细胞时,可被有效加工成CD8+ T细胞识别的表位14,15。重叠肽(OLP)文库中的肽段数量取决于蛋白质的长度。此外,最后一个OLP的长度可根据蛋白质长度在12至15肽之间变动。例如,髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)全长为247个氨基酸,其OLP文库包含59条OLP12.......
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本文中,我们描述了一种用于分析蛋白质中Qa-1表位的实验方案。与此方案相关,此前已有若干其他策略被报道。首先,曾利用同种异体CD8+ T细胞系和克隆来鉴定Qdm1。其次,通过分析Qdm获得的推测性Qa-1结合基序被用于鉴定HSP60p216-224以及TCRBV8.1表位9,18。第三,使用来自某一蛋白质的一系列重叠肽段免疫动物,随后从免疫后的动物中分离CD8+ T细胞,以鉴定TCRBV8.2肽段p42-50,并进一步证实该肽段可与Qa-1结合6,10,19。第四,将具有功能的CD8+ T细胞系与cDNA展示文库联合使用,用于鉴定FL9 Qa-1表位4。
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作者声明无利益冲突。
感谢 Penelope Garcia 在技术方面提供的帮助以及对本文手稿的准备工作。本研究得到了洛马林达大学医学院研究创新基金(RIG,编号 681205-2967)和国家多发性硬化症协会试点基金(PP1685)对 XT 的资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 待分析的蛋白质 | N/A | N/A | 蛋白质序列可从NCBI获取 |
| 二甲基亚砜(DMSO) | Sigma-Aldrich | Cat#: D2650 SIGMA | DMSO应为无菌且经细胞培养测试。 |
| Kb-/-Db-/- 小鼠 | Lauson实验室 | Stock#: 019995 | 我们曾使用Taconic H2-KbH2-Db 双重敲除小鼠(货号:4215-F 和 4215-M),但该品系目前已不再提供。 |
| AIM V无血清培养基 | ThermoFisher Scientific | Cat#: 12055091 | |
| 2-巯基乙醇 | ThermoFisher Scientific | Cat#: 21985023 | |
| 丙酮酸钠 | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11360070 | |
| 非必需氨基酸 | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11140076 | |
| Dynabeads CD8阳性分离试剂盒 | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11333D | |
| Bio-Gel P-100 | Bio-Rad | Cat#: 150-4171 | |
| 磷酸盐缓冲液(PBS) | ThermoFisher Scientific | Cat#: 20012027 | |
| 移液管 | Globe Scientific | Mfg#: 137238 | |
| 小鼠M-CSF | PeproTech | Cat#: 315-02 | |
| 48孔组织培养板 | USA Scientific | Cat#: CC7682-7548 | |
| Corning Costar TC处理多孔板,96孔,V型底 | Sigma-Aldrich | Cat#: Z372129 Sigma | |
| 1 ml深孔6孔聚丙烯板,无菌 | USA Scientific | Item#: 1896-1110 | |
| 重组小鼠IL-2 | PeproTech | Cat#: 212-12 | |
| 重组小鼠IL-7 | PeproTech | Cat#L: 217-17 | |
| 捕获型抗IFN-γ 抗体 | BD Biosciences | Cat#: 551881 | |
| ELISPOT板 | Sigma-Aldrich | Cat#: S2EM004M99 | |
| C1R | ATCC | Cat#: ATCC CRL-1993 | |
| C1R.Qa-1b | 定制构建(GenBank登录号:NM_010398.3) | ||
| Qa-1慢病毒载体 | GeneCopoeia | Product#: Mm02955 | |
| 检测型抗IFN-γ 抗体 | BD Biosciences | Cat#: 551881 | |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | Cat#: P9416 | |
| 链霉亲和素-HRP | BD Biosciences | Cat#: BD557630 | |
| AEC底物 | BD Biosciences | Cat#: 551951 | |
| 免疫斑点分析仪 | ImmunoSpot | 任何免疫斑点分析仪均可用于此目的。 |
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