重叠肽文库用于绘制蛋白质中Qa-1表位

摘要

Qa-1（人类中的 HLA-E）属于非经典主要组织相容性复合体 1b 分子家族。研究表明，使用 Qa-1 结合表位进行免疫可增强组织特异性免疫调节，并改善多种自身免疫性疾病。本文介绍一种重叠肽库策略，用于鉴定蛋白质中的 Qa-1 表位。

摘要

Qa-1（人类中的 HLA-E）属于非经典主要组织相容性复合体 1b（MHC-Ib）分子家族。近期研究表明，Qa-1 分子在监测细胞的结构与功能完整性、诱导免疫调节以及限制对病毒感染的免疫应答中发挥重要作用。此外，通过表位免疫增强 Qa-1 限制性 CD8⁺ T 细胞功能已在多种自身免疫性疾病动物模型中显示出治疗效果，例如 实验性过敏性脑脊髓炎、胶原诱导性关节炎和非肥胖型糖尿病。因此，迫切需要一种能够高效、快速鉴定蛋白质中功能性 Qa-1 表位的方法。本文描述了一种利用针对重叠肽（OLP）文库的 Qa-1 限制性 CD8⁺ T 细胞系来确定蛋白质中 Qa-1 表位的实验方案。该 OLP 文库包含覆盖整个蛋白质序列的 15 肽重叠肽，相邻肽段之间重叠 11 个氨基酸。利用本方案，我们近期在髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）中鉴定出一个 9 肽 Qa-1 表位。新鉴定的 MOG Qa-1 表位可诱导表位特异性、Qa-1 限制性的 CD8⁺ T 细胞，从而增强针对髓鞘的免疫调节作用。因此，该方案有助于未来进一步研究 Qa-1 限制性 CD8⁺ T 细胞的新靶点及其功能。

引言

Qa-1 属于小鼠中的一类非经典主要组织相容性复合体 1b（MHC-Ib）分子，其人类同源分子为 HLA-E。已有研究表明，Qa-1 分子具有重要的生物学功能。首先，Qa-1 分子在监测细胞结构与功能完整性方面发挥关键作用。在此过程中，Qa-1 分子进化出多种策略以监控细胞的正常功能。其中一种策略是 Qa-1 分子可与经过加工的信号肽（表位）形成复合物， 即 内质网中由经典MHC-Ia分子加工产生的Qa-1决定簇修饰肽（Qdm）¹这些Qa-1/Qdm复合物随后呈现在细胞表面，并与NK细胞上的抑制性NKG2A受体结合，从而抑制NK细胞的杀伤活性。²如果MHC-Ia分子的表达缺失，细胞（例如恶性细胞）将对自然杀伤细胞（NK）的杀伤作用变得敏感。²另一种策略使Qa-1分子能够在缺乏TAP（抗原加工相关转运蛋白）的细胞表面形成新的Qa-1/表位复合物³ 和/或ERAAP（内质网氨基肽酶，与抗原加工相关）⁴ （这两种缺陷在恶性细胞中常同时出现）。表达这些新Qa-1/表位复合物的细胞可被表位特异性的Qa-1限制性CD8⁺ T细胞。其次，Qa-1分子诱导免疫调节⁵在此方面，Qa-1/表位复合物已被证明可刺激CD8^....

方案

所有实验均按照德克萨斯大学埃尔帕索分校和洛马林达大学动物护理与使用委员会批准的机构动物护理与使用方案进行。

1. 生成覆盖蛋白质全长的OLP文库

1. 设计一个OLP文库，其中所有肽段均为15个氨基酸长度，相邻肽段之间重叠11个氨基酸。
   注意：在MOG OLP研究中，通过以下链接从NCBI蛋白质数据库获取MOG前体蛋白[Mus musculus]的序列：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_034944。使用包含信号肽和成熟肽的MOG前体（共247个氨基酸），因为大多数已报道的Qa-1（HLA-E）表位位于信号肽内（例如Qdm¹）。从其N端开始，确定15-mer肽段的序列，使相邻两个肽段重叠11个氨基酸（图1）。因此，在247个氨基酸的MOG前体中恰好识别出59个OLP。然而，最后一个OLP的长度可根据蛋白质总长在12至15个氨基酸之间变动。此外，我们选择15-mer文库是因为我们及其他研究者已证明，当15-mer肽段被加入树突状细胞（DCs）或巨噬细胞时，可被有效加工成CD8⁺ T细胞识别的表位^14,15。
2. 商业途径购买每种单独肽段。每种....

结果

覆盖蛋白质全长的OLP文库设计

从蛋白质的N端开始，每条肽段包含15个氨基酸（15肽）。因此，第一条肽段覆盖第1至第15位氨基酸。第二条肽段的N端与第一条肽段的C端重叠11个氨基酸，因此其覆盖第5至第19位氨基酸。按照此方式设计肽段，直至覆盖蛋白质C端（图1）。我们选择15肽文库，是因为我们及其他研究者已证实，当15肽被加入树突状细胞（DCs）或巨噬细胞时，可被有效加工成CD8⁺ T细胞识别的表位^14,15。重叠肽（OLP）文库中的肽段数量取决于蛋白质的长度。此外，最后一个OLP的长度可根据蛋白质长度在12至15肽之间变动。例如，髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）全长为247个氨基酸，其OLP文库包含59条OLP¹².......

讨论

本文中，我们描述了一种用于分析蛋白质中Qa-1表位的实验方案。与此方案相关，此前已有若干其他策略被报道。首先，曾利用同种异体CD8⁺ T细胞系和克隆来鉴定Qdm¹。其次，通过分析Qdm获得的推测性Qa-1结合基序被用于鉴定HSP60p216-224以及TCRBV8.1表位^9,18。第三，使用来自某一蛋白质的一系列重叠肽段免疫动物，随后从免疫后的动物中分离CD8⁺ T细胞，以鉴定TCRBV8.2肽段p42-50，并进一步证实该肽段可与Qa-1结合^6,10,19。第四，将具有功能的CD8⁺ T细胞系与cDNA展示文库联合使用，用于鉴定FL9 Qa-1表位⁴。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
待分析的蛋白质	N/A	N/A	蛋白质序列可从NCBI获取
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma-Aldrich	Cat#: D2650 SIGMA	DMSO应为无菌且经细胞培养测试。
Kb-/-Db-/- 小鼠	Lauson实验室	Stock#: 019995	我们曾使用Taconic H2-KbH2-Db 双重敲除小鼠（货号：4215-F 和 4215-M），但该品系目前已不再提供。
AIM V无血清培养基	ThermoFisher Scientific	Cat#: 12055091
2-巯基乙醇	ThermoFisher Scientific	Cat#: 21985023
丙酮酸钠	ThermoFisher Scientific	Cat#: 11360070
非必需氨基酸	ThermoFisher Scientific	Cat#: 11140076
Dynabeads CD8阳性分离试剂盒	ThermoFisher Scientific	Cat#: 11333D
Bio-Gel P-100	Bio-Rad	Cat#: 150-4171
磷酸盐缓冲液（PBS）	ThermoFisher Scientific	Cat#: 20012027
移液管	Globe Scientific	Mfg#: 137238
小鼠M-CSF	PeproTech	Cat#: 315-02
48孔组织培养板	USA Scientific	Cat#: CC7682-7548
Corning Costar TC处理多孔板，96孔，V型底	Sigma-Aldrich	Cat#: Z372129 Sigma
1 ml深孔6孔聚丙烯板，无菌	USA Scientific	Item#: 1896-1110
重组小鼠IL-2	PeproTech	Cat#: 212-12
重组小鼠IL-7	PeproTech	Cat#L: 217-17
捕获型抗IFN-γ 抗体	BD Biosciences	Cat#: 551881
ELISPOT板	Sigma-Aldrich	Cat#: S2EM004M99
C1R	ATCC	Cat#: ATCC CRL-1993
C1R.Qa-1b			定制构建（GenBank登录号：NM_010398.3）
Qa-1慢病毒载体	GeneCopoeia	Product#: Mm02955
检测型抗IFN-γ 抗体	BD Biosciences	Cat#: 551881
Tween20	Sigma-Aldrich	Cat#: P9416
链霉亲和素-HRP	BD Biosciences	Cat#: BD557630
AEC底物	BD Biosciences	Cat#: 551951
免疫斑点分析仪	ImmunoSpot		任何免疫斑点分析仪均可用于此目的。