本方案描述了一种用于模拟寨卡病毒感染发育中人脑的技术。研究人员可利用野生型或经基因改造的干细胞系，通过该技术揭示可能影响寨卡病毒感染胚胎早期脑部感染及其导致小头畸形的各种机制或治疗方法。
方法文章
模拟寨卡病毒感染人类发育中大脑 体外 利用干细胞衍生的大脑类器官
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
寨卡病毒（ZIKV）在易感人群中的近期暴发，导致新生儿小头症及其他神经发育障碍病例急剧增加。尽管蚊虫叮咬是病毒传播的主要途径，但研究已证实该病毒也可通过性接触以及母婴垂直传播。在后一种传播方式中，由于ZIKV具有独特的病毒嗜性，被认为主要靶向发育中大脑的神经前体细胞（NPCs）。
本文介绍了一种模拟寨卡病毒（ZIKV）感染及其导致小头畸形的方法，该模型通过将人脑类器官暴露于活体ZIKV而建立。类器官的神经前体细胞群体中表现出高水平的病毒载量，并随时间推移出现严重的细胞死亡和小头畸形表型。这种三维脑类器官模型使研究人员能够开展与人类相匹配的实验，以观察甚至干预ZIKV对发育中人脑的感染过程。相较于传统的二维培养方法，该模型具有更高的相关性，且具备动物模型无法实现的人类特异性细胞结构和蛋白质表达特征。
引言
寨卡病毒（ZIKV）已在密克罗尼西亚、法属波利尼西亚和美洲迅速传播，最近研究发现其可穿越胎盘屏障1,2，感染发育中的胎儿大脑，导致神经发育障碍，如小头症3,4,5,6。这些患者长期的生活影响以及目前缺乏有效治疗手段，促使研究人员和临床医生迫切希望更深入地了解ZIKV感染与复制的机制。以往研究已采用多种生理相关细胞类型中的体外系统来考察ZIKV感染7,8,9，同时也利用免疫健全和免疫缺陷小鼠11,12,13以及非人灵长类动物14,15,16进行了体内10研究。除这些较为传统的方法外，多个研究团队已采用干细胞来源的脑类器官，以进一步探究ZIKV对发育中人脑的感染。这些团队利用人类脑类器官验证了小头症表型17,18，研究了与病毒进入相关的受体19，分析了感染后的生理反应20,21，并可能用于候选药物的筛选22。本文介绍了一种快速制备并感染干细胞来源脑类器官的技术，如先前研究所示19，以增进对ZIKV感染发育中人脑机制的理解。
由于类器官来源于标准的多能干细胞（PSC）培养体系，该技术可用于回答关于发育中大脑病毒感染的多种科学问题。例如，可在类器官感染前，利用CRISPR基因编辑技术对这些PSC系进行改造，其编辑速度较大多数方法更快 体内 遗传学研究19此外，与标准的二维（2D）分化培养不同，类器官展现出对皮质发生至关重要的复杂细胞结构，而近期研究显示，这种结构在感染后可能会被破坏21最后，相较于其他方法，类器官的生成成本相对较低，有利于开展高通量的实验与筛选。 体内 模型。另一方面，利用类器官研究寨卡病毒（ZIKV）也存在一些局限性。尽管类器官在生物学相关性上远高于二维（2D）培养体系，但由于其三维（3D）结构特性，在评估类器官时面临更多挑战。类器官的成像和解离过程通常比标准二维培养需要更多设备和更高的资源投入。此外，类器官缺乏真实组织中存在的脉管系统和免疫组分 体内 因此，对病毒感染这些方面感兴趣的研究人员应考虑采用替代方案。
目前已有多种技术可用于在培养中形成人类类器官和神经球，这些技术通常可分为模式化和非模式化两类。模式化方法通过引入调控因子来调节Wnt、BMP、TGFβ及其他信号通路，从而引导细胞向特定谱系分化23。而非模式化方法（例如本文所述方法）则利用诱导性多能干细胞（iPSCs）和人类胚胎干细胞（hESCs）在默认情况下倾向于向神经外胚层谱系分化的特性24。经过约三周的分化后，所形成的类器官包含多种在早期发育脑组织中可见的细胞类型，并组成大型的、具有生物模拟特性的神经上皮结构。
本文完整介绍了从标准的无饲养层PSC培养物中生成类器官，并用寨卡病毒（ZIKV）感染这些类器官的技术。有关无饲养层PSC培养方法的指导，请参见之前发表的方法学文献25,26。此外，为了在多个实验中使用一致的病毒感染量，有必要提前计算感染复数（MOI）。该步骤通过感染Vero细胞，随后进行覆盖培养基处理、孵育以及免疫染色来完成。该技术的详细描述和方法此前已有报道19,27。
当PSC培养达到50%-70%的目标汇合度时，将细胞解离并聚集到超低吸附96孔板中。细胞在无异源成分的干细胞维持培养基（SCMM）中维持培养3天，随后转换为神经诱导培养基继续培养。类器官分化3周后，即可进行感染实验。通过在感染后每周定期采集图像，研究人员将观察到类器官中逐渐加重的细胞死亡和结构破坏。研究人员也可在此时将类器官解离，以进行转录组或蛋白质组分析。推荐使用冷冻切片和光片显微成像方法进行成像，研究人员可观察到类器官中尤其是神经前体细胞（NPC）群体内存在高水平的感染和病毒复制。该技术最终使研究人员能够以低成本和有限设备快速研究病毒感染人类大脑的机制。
方案
1. 从iPSC/hESC二维培养物生成脑类器官（第0天）
注意：本方案假设干细胞（SC）的维持培养是在含有纤连蛋白或Geltrex基质的SCMM培养基中进行的。如果使用其他高蛋白干细胞培养基，建议在启动类器官形成之前，先将干细胞培养物转换至SCMM培养基中传代至少两次。本方案尚未在基于饲养层的干细胞培养方法中进行测试。
- 采用常规的干细胞（SC）培养维护方法25,26，将细胞培养至50%–70%汇合度。通常在传代后3–4天达到此状态，但具体时间可能因培养方法和细胞系而异。
注意： 大约需要6孔板中的2个孔来生成一个完整的96孔板类器官。 - 使用明场显微镜在10X–20X放大倍数下检查培养物，确保细胞集落形态健康，无明显分化迹象。
- 将干细胞培养基（SCMM）置于37 °C水浴中预热，并将一支50 µL的50 mM Y-27632（ROCK抑制剂）溶液和2 mL酶解解离试剂解冻至室温。
- 准备一个超低吸附U型底96孔板、一个多通道P200移液器以及一个25 mL试剂储液槽。
- 在50 mL锥形管中分装45 mL SCMM，并加入45 µL 50 mM Y-27632。通过吹打充分混匀。
- 用真空抽吸法吸除含有干细胞的两个孔中的培养基，然后使用P1000移液器快速向每个孔中加入1 mL无酶解离试剂。将培养板置于37 °C培养箱中孵育4分钟。
- 用真空抽吸法吸除处理后的孔中液体，再使用P1000移液器向每个孔中加入1 mL酶解解离试剂。
- 将培养板置于37 °C培养箱中继续孵育5分钟。
- 取出培养板并观察处理后的孔。轻轻敲击培养板以打散聚集的细胞。若仍可见较大细胞团块，则在37 °C下额外孵育2分钟。重复此步骤，直至肉眼不可见明显细胞团块。
- 当细胞充分解离后，向每个孔中加入1 mL SCMM以终止解离酶的作用。将4 mL细胞悬液合并至一个50 mL锥形管中，并取少量用于细胞计数。
- 将维持培养板中其余未处理的孔放回37 °C培养箱继续培养。
- 在细胞计数的同时，将细胞悬液在300 ×g条件下离心5分钟。
- 确定细胞总数，并计算为获得60,000个细胞/mL的悬液所需添加的SCMM + Y-27632溶液的体积。
- 小心地用真空抽吸法吸除上清液，加入计算好的SCMM + Y-27632溶液体积。用5 mL移液器吹打混匀5–10次，确保细胞悬液均匀。
- 立即将细胞悬液转移至试剂储液槽中，使用多通道P200移液器向U型底超低吸附96孔板的每孔加入150 µL。此操作可生成96个独立的类器官，每个类器官初始含9,000个细胞。
- 将培养板在150 ×g条件下离心1分钟。
- 将培养板放入37 °C培养箱中，48小时内勿扰动。
2. 脑类器官的维持（第2天）
- 在50 mL锥形管中配制17 mL SCMM，并加入17 µL的50 mM Y-27632。将SCMM + Y-27632溶液置于37 °C水浴中预热。
- 从培养箱中取出类器官培养板，使用多通道P200移液器（设定体积为75 µL），从第一行孔的边缘缓慢吸取培养基。吸液完成后，迅速将培养基重新排回孔中，以使松散的细胞和类器官悬浮。对每一行均重复此操作。
注意：该技术在此后称为"分散"，可使细胞碎片和类器官进入悬浮状态。类器官会迅速沉降至孔底，而较小的碎片则保持悬浮，从而可在换液时被去除。这有助于防止类器官在培养过程中停留在细胞碎片中。- 完成所有孔的分散操作后，静置15秒，确保类器官已沉降至各孔底部。
- 使用多通道P200移液器缓慢而小心地从每个孔中吸出75 µL培养基，并排入废液容器。
注意：多数使用者在常规换液时偶尔会吸出类器官，发生概率约为1%。请合理规划实验，以确保有足够数量的类器官存活至实验所需时间点。 - 将SCMM + Y-27632溶液转移至试剂储液槽中，使用多通道P200移液器向每个类器官培养孔中加入150 µL。
- 将培养板放回37 °C培养箱中继续培养。
3. 脑类器官的维持（第3天）
- 将17 mL SCMM预热至37 °C，此次不添加Y-27643。
- 将多通道P200移液器设定至100 µL，吹打分散类器官板的所有孔（参见步骤2.2）。静置15秒，确保类器官沉降至孔底。
- 准备废液储液槽，并将预热的SCMM转移至加样储液槽中。
- 小心吸出每孔中的125 µL培养基，使用多通道P200移液器加入150 µL新鲜SCMM。
- 将培养板放回37 °C培养箱中继续培养。
4. 脑类器官的维持（第4天及以后）
注意：每隔一天进行一次常规维护，直至感染发生。
- 在第4天开始换液前，配制神经诱导（NI）培养基。
- 解冻一份250 µL的2 mg/mL肝素溶液，同时解冻一瓶5 mL的100X N-2添加剂。将250 µL肝素、5 mL 100X N-2添加剂和5 mL 100X MEM-NEAA加入500 mL DMEM/F12+GlutaMAX培养基中。使用500 mL滤器对混合溶液进行无菌过滤。
注意：不使用时将NI培养基保存在4 °C；NI培养基最多可保存两周，之后需配制新鲜培养基。
- 解冻一份250 µL的2 mg/mL肝素溶液，同时解冻一瓶5 mL的100X N-2添加剂。将250 µL肝素、5 mL 100X N-2添加剂和5 mL 100X MEM-NEAA加入500 mL DMEM/F12+GlutaMAX培养基中。使用500 mL滤器对混合溶液进行无菌过滤。
- 将17 mL NI培养基预热至37 °C。
- 将多通道P200移液器设定为100 µL，吹打类器官培养板的所有孔（参见步骤2.2）。静置15秒，确保类器官沉降至孔底。
- 准备废液储液槽，并将预热的NI培养基转移至加样储液槽中。
- 使用多通道P200移液器小心吸出每孔125 µL培养基，并加入125 µL新鲜NI培养基进行替换。
- 将培养板放回37 °C培养箱中继续培养。
5. 类器官的ZIKV感染（约第24天）
注意：分化约3周后，类器官中将出现较大的神经上皮结构和菊形团，这些结构对寨卡病毒（ZIKV）感染高度易感。
- 将Earle's 1X平衡盐溶液（EBSS）、1X PBS和NI置于水浴锅中加热至37 °C。
- 用1X EBSS稀释已知浓度的ZIKV，使其达到目标感染复数（MOI）。
注意：建议进行不同MOI的滴定实验，以获得病毒剂量反应曲线。该数值可能因病毒株而异；对于ATCC VR-1838和ATCC VR-1843，典型的MOI值范围为0.1至10。 - 使用单通道P200移液器小心吸除类器官孔中的全部培养基。使用多通道P200移液器快速向每孔加入200 µL 1X PBS，以洗涤类器官。
- 使用单通道P200移液器小心吸除类器官孔中的全部液体。迅速向每孔加入50 µL仅含1X EBSS的溶液（模拟感染）或ZIKV病毒溶液，并确保类器官完全浸没。对研究中需要感染的每个类器官重复此步骤。
- 将培养板放回37 °C培养箱中孵育2小时。
注意：模拟感染的类器官在此期间孵育不应对其生长产生显著影响，与未受干扰的类器官相比无明显差异。 - 在病毒孵育结束前约30分钟，将25 mL NI分装至50 mL锥形管中，并置于水浴锅中加热至37 °C。
- 病毒暴露结束后，每孔用200 µL 1X PBS洗涤类器官，静置15秒使类器官沉降，然后使用单通道P200移液器吸除1X PBS。
- 向每孔加入200 µL新鲜NI，并将培养板放回培养箱。
- 可选步骤：若需设置第0天时间点，可在感染后1小时对类器官进行成像。
- 每隔一天使用分散法更换125 µL NI继续培养（见步骤4）。务必妥善处理废弃培养基和移液枪头，因其含有具有感染性的ZIKV颗粒。
结果
在类器官形成的当天，干细胞（SC）培养物应处于对数生长期，此时细胞融合度为50%–70%，如图1(A-C)所示。培养物应形成边缘清晰的圆形克隆，且培养孔中应无分化迹象，如图1(D-E)所示。若已出现分化现象，建议在制备类器官前至少一天进行挑除操作，以清除培养板中受影响的区域。若培养物中有较大部分已发生分化，则可能需要额外传代一次、复苏新的冻存管，或调整干细胞培养技术，以确保类器官由纯的干细胞培养物形成。
通过非酶和酶消化试剂联合处理进行解离后，应主要获得单细胞，但在计数过程中仍可能观察到少量细胞聚集体。小聚集体的存在似乎不会干扰类器官的形成，但可能影响计数准确性。建议对每个样本进行多次计数，若计数结果差异超过20%，则可能需要延长解离时间以进一步获得单细胞悬液。
当细胞接种并在ULA U型底96孔板中离心后（图2A），它们将呈现为每个孔底部平坦且致密的单层细胞。在接下来的两天内，细胞会缓慢聚集。在这48小时内最好避免扰动培养板，因为机械力可能会破坏尚未牢固形成的细胞聚集体。在培养的前10天内，类器官将基本保持球形，并从约300 µm生长至600–800 µm（图2B）。在第10天到第20天之间，类器官中开始出现更明显的结构（图2C–E）。到第24天，研究人员应可通过明场显微镜观察到类器官中出现玫瑰花环样结构（图2F）。在继续培养过程中，这些神经上皮结构的数量和尺寸可能在数天内进一步增加（图2G）。在换液过程中，研究人员会注意到每个孔底部积聚了大量碎片，尤其在培养的前两周更为明显。步骤2.2中所述的分散技术可去除大部分此类细胞碎片，防止凋亡碎片在多次换液后持续累积（图3A）。这些碎片可能干扰成像，增加感染诱导细胞死亡的观察与定量难度，并可能向邻近类器官提供不对称信号，从而影响其分化。若正确执行分散操作，碎片量应显著减少（图3B–C，3D–E）。
建议进行冷冻切片或光片成像，以观察类器官内形成的皮层结构。在第25天的类器官中，DAPI染色可清晰显示玫瑰花环样结构和室管膜区图4A) 和磷酸化波形蛋白（phospho-vimentin）图4B) 染色。TBR2 的存在（图4C) 表明中间前体细胞正在形成，其形态提示存在向外迁移的趋势。MAP2+（图4D) 神经元分布于每个玫瑰花结结构的外周区域。通过这些蛋白可观察到每个玫瑰花结内部的室管膜区（VZ）、室下区（SVZ）、中间区（IZ）以及皮质板（CP）。图4E,4E'）。可以继续培养这些类器官以观察其发育的后期阶段。尽管此类类器官中的皮层分层不如其他类型显著，但向胶质细胞生成的自然转变仍会发生，其过程与体内情况类似。 体内在第108天的类器官中可以观察到这一现象，其中大部分细胞表达MAP2或GFAP图4F-I).
感染寨卡病毒（ZIKV）约3天后，用户可能会观察到类器官大小出现差异，具体差异取决于施加于类器官的病毒MOI（图5A-B）。此后3天内，与对照组孔相比，感染孔中细胞碎片将有所增加。该类器官大小的差异将在接下来的一周内进一步加剧，直至感染的类器官开始解体（图5C-D）。此时可采用多种检测方法研究感染机制，包括病毒RNA提取和冷冻切片（推荐抗体见材料表）。冷冻切片后，用户将观察到神经上皮结构顶端区域存在大量病毒，提示神经前体细胞（NPCs）对ZIKV感染具有易感性（图6）。对切片类器官进行免疫荧光染色还可显示，感染类器官中cleaved caspase-3的表达水平升高（图7）。
图1：类器官形成前干细胞集落的形态。
在消化前，集落应达到50%–70%的融合度，以产生大量一致的类器官。(A) 接种后稀疏的培养物尚未进入对数生长期，无法形成较多类器官。(B) 当细胞达到合适的融合度时，即可进行消化。此外，应仔细检查这些集落，确保无分化迹象。(C) 若集落生长过度，达到过融合状态，则不建议用于类器官形成。此类培养物更可能含有正在分化的细胞。(D) 集落边缘应清晰，中心为圆形细胞，边缘细胞略呈伸长状，细胞形态应保持一致。(E) 培养物中应仅有极少的分化现象。若在集落中心或边缘观察到较大、扁平的细胞（白色箭头），且占比超过约1%，建议进行挑除或额外传代，以获得均一的干细胞群体。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：脑类器官随时间的生长过程。
(A) 从在无异源、无饲养层培养基中维持的二维PSCs生成脑类器官的示意图。 (B) 在前8天内，类器官将基本保持球形，几乎无明显特征。类器官的直径范围约为300 µm至500 µm。 (C-E) 到第10天，类器官周边区域将开始出现更清晰的结构，且其形状将逐渐失去球形特征。它们的尺寸会继续增大，直径可达约1 mm，具体大小主要取决于用于生成类器官的细胞系。 (F) 经过约20天的分化后，大多数类器官的透明周边区域中可观察到神经上皮结构（黑色箭头）的形成。这些结构呈环状形态，具有类似发育中皮层的顶端和基底结构。 (G) 这些神经上皮结构将持续生长并增大，持续约20-30天。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：通过分散加样技术清除细胞碎片。
在类器官生长过程中，预期会出现大量细胞死亡，可能导致类器官基部周围积聚细胞碎片。(A) 图示的分散技术可使研究人员在每次换液时清除大部分此类碎片。操作时，使用多通道P200移液器缓慢吸取用过的培养基，然后快速排出，以将类器官和细胞碎片悬浮起来。类器官会迅速沉降到孔底，此时可进行常规换液。图中显示了第6天的类器官在分散加样前(B)和之后(C)的实例，可见碎片显著减少。该效果可持续数周，如第18天的类器官在分散加样前(D)和之后(E)的对比所示。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：通过免疫组织化学对脑类器官进行表征。
展示的光片成像图像示例显示了脑类器官中形成的细胞结构。在第25天，DAPI (A) 和磷酸化波形蛋白（phosphor-Vimentin）(B) 分别标记出单个的玫瑰花环结构和室管膜区。(C) TBR2 标记正在向外迁移的中间前体细胞，而 MAP2 (D) 标记已在皮层板中形成的神经元。(E,E') 这些蛋白的联合染色清晰地展示了脑类器官模型中皮层发育过程的再现。(F-I) 到第108天，胶质发生已经发生，类器官的大部分区域被GFAP阳性和MAP2阳性细胞混合占据。VZ = 室管膜区，SVZ = 室下区，IZ = 中间区，CP = 皮层板。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5：感染类器官的降解情况。
(A) 模拟感染组与ZIKV感染组脑类器官在MOI = 0.1和10条件下的明场图像。图像分别于感染后即刻（第0天）、感染后第3天和第6天采集。(B-C) 感染后第3天，MOI = 10条件下模拟感染组(B)与ZIKV感染组(C)脑类器官周围细胞碎片的明场图像。 请点击此处查看该图的高清版本。
图6：感染类器官的冷冻切片与免疫荧光分析。
第24天的类器官以MOI = 0.1暴露于寨卡病毒（ZIKV），6天后进行冷冻切片。在此阶段，类器官的室管膜区、室下区和中间区可见明显的病毒存在，这些区域是神经前体细胞和放射状胶质细胞所在的位置。(A) 通过细胞核染色，由于细胞核密度较高并围绕顶面形成环状结构，这些神经上皮区域清晰可见（白色箭头所示）。(B) 对病毒包膜蛋白进行染色后，可在这些玫瑰花结样结构中观察到相对高量的病毒存在（白色箭头所示）。请注意，在一些未明确识别的外周细胞中也有少量病毒存在。(C-D) MAP2或其他神经元特异性染色显示，培养物中存在神经元，当与病毒染色信号叠加时，这些神经元似乎未被病毒感染。 请点击此处查看该图的放大版本。
图7：感染类器官中裂解型caspase-3的免疫荧光染色。
感染后，可使用凋亡标志物来研究类器官内发生的细胞死亡机制。在本示例中，第24天的类器官以MOI=0.1暴露于寨卡病毒（ZIKV），6天后进行冷冻切片。(A) 未感染的类器官未显示病毒包膜蛋白（4G2蛋白），仅因组织内稳态性凋亡而呈现极少量的裂解型caspase-3。(B) 感染的玫瑰花环结构开始表现出升高的凋亡水平。(C) 通过4G2染色显示严重感染的玫瑰花环区域也倾向于表现出高水平的裂解型caspase-3。在感染的玫瑰花环结构中，感染严重程度与裂解型caspase-3的表达呈直接相关。 请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
在利用人脑类器官研究寨卡病毒（ZIKV）感染时，需考虑若干注意事项。一个重要因素是类器官的形成和结构高度依赖于其来源的干细胞系。在比较不同细胞系（包括同基因工程改造的细胞系）时应格外谨慎；最好基于多个亚克隆，理想情况下使用多个干细胞系，以得出可靠结论。此外，由于不同细胞系之间存在差异，建议开展预实验，以确认类器官中是否发生了正常的分化。尽管神经上皮结构可通过明场显微镜观察到，但仍建议进行qRT-PCR或冷冻切片实验，检测PAX6或磷酸化波形蛋白（phospho-vimentin）等神经分化标志物的表达。
还应预见到同一细胞系内类器官之间存在显著的变异性。由于该实验方案未进行模式化设计，不同类器官之间的神经上皮结构数量和大小可能存在差异。通常情况下，每个类器官可观察到至少两个较大的（第24天时直径>200 µm）神经玫瑰花环样结构。因此，进行纵向研究（例如观察感染后类器官大小的变化）尤为具有启发性。不同批次之间也可能出现变异，最可能的原因是细胞计数或接种不准确。建议进行多次计数，并在将细胞接种至超低吸附U型底96孔板前，确保细胞悬液充分混匀。
在超低吸附U型底96孔板中培养类器官时，应注意板边缘区域会出现明显的蒸发效应。建议将边缘孔用PBS填充，并仅在中心60个孔中进行实验操作。由于蒸发作用，外周孔中的类器官所处环境条件将与中心孔不同，可能影响其生长和分化状态。在规划实验所需类器官数量时，请充分考虑这一因素。此外，类器官在培养约30天后将开始超出96孔板的容纳能力，表现为培养基颜色改变。若计划将类器官培养超过30天，建议将其转移至超低吸附24孔板中。进行转移时，可用剪刀将P1000枪头剪开，使其开口明显大于类器官本身，然后通过移液操作完成类器官转移。
人脑类器官在推动对神经发育及疾病认知方面具有巨大潜力。研究人员可根据需要对本方案进行修改。例如，可引入模式化因子以提高向特定细胞类型的分化效率，从而探索病毒对特定解剖区域的影响。寨卡病毒（ZIKV）的神经发育效应目前仍知之甚少，但这一新方法将为研究人员提供一种便捷、快速且高通量的研究感染机制的途径。
披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者感谢哈佛医学院的 Priscilla L. Yang 和 Dominique J. Burri 在寨卡病毒（ZIKV）初始扩增与定量方面的帮助。我们还要感谢 Nathaniel D. Kirkpatrick 在成像方面的支持。K.E. 的研究工作得到了精神病学研究斯坦利中心和哈佛干细胞研究所的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 无酶解离试剂 ReLeSR | StemCell Technologies | 5873 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
| 添加谷氨酸的 DMEM/F12 (1X) | Gibco | 10565-018 | (+)2.438 g/L 碳酸氢钠，(+)丙酮酸钠 |
| N-2 补充剂 (100X) | Gibco | 17502-048 | |
| MEM 非必需氨基酸 (MEM-NEAA) | Gibco | 11140-050 | |
| Earle's 平衡盐溶液 (EBSS) | GE Healthcare Life Sciences | SH30029.02 | |
| Stericup 滤器 (500 mL) | Millipore | 220009-140 | |
| Costar 超低吸附板，96 孔，圆底 | Corning | 7007 | |
| 低残留体积试剂储液槽 (25 mL) | Integra | 4312 | |
| Pipet-Lite 多通道移液器 L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | |
| 大型离心机，兼容培养板 | Thermo Scientific | 75007210 | |
| 培养板离心机转子 | Thermo Scientific | 75005706 | |
| Vero 细胞 | ATCC | CCL-81 | 用于病毒扩增（如需要） |
| 寨卡病毒（乌干达株） | ATCC | VR-1838 | 可使用其他毒株 |
| 寨卡病毒（波多黎各株） | ATCC | VR-1843 | 可使用其他毒株 |
| phospho-vimentin | MBL | D076-3 | 小鼠多克隆抗体， 1:250 稀释 |
| TBR2 | Abcam | ab23345 | 兔多克隆抗体，1:300 稀释 |
| MAP2 | Novus | NB300-213 | 鸡多克隆抗体，1:1500 稀释 |
| GFAP | Cell Signaling Technologies | CST12389S | 兔多克隆抗体，1:200 稀释 |
| D1-4G2 黄病毒包膜蛋白 | EMD Millipore | MAB10216 | 小鼠单克隆抗体，1:500 稀释 |
| cleaved caspase-3 | Cell Signaling Technologies | 9661 | 兔多克隆抗体，1:200 稀释 |
| 488 标记抗小鼠 IgG | Thermo Fisher | A-11001 | 山羊多克隆抗体，1:1000 |
| 594 标记抗兔 IgG | Thermo Fisher | A-11037 | 山羊多克隆抗体，1:1000 稀释 |
| 647 标记抗鸡 IgY | Thermo Fisher | A-21449 | 山羊多克隆抗体，1:1000 稀释 |
参考文献
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- Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro - Preliminary Report. New Engl J Med. 375, 2321-2334 (2016).
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