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方法文章

人源蛋白的过表达与纯化 顺式- prenyltransferase 在 大肠杆菌

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DOI：

10.3791/56430

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2017年8月3日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 2Department of Physiology and Pharmacology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 3Department of Ophthalmology, Tel Aviv Sourasky Medical Center, affiliated to the Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 4Tel Aviv Sourasky Medical Center, affiliated to the Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文描述了一种在非变性条件下，于大肠杆菌（Escherichia coli）中过表达并纯化密码子优化的人源cis-异戊二烯基转移酶的简单方案，同时包含酶活性检测方法。该方案可推广应用于其他cis-异戊二烯基转移酶蛋白的制备，所得蛋白在数量和质量上均适用于机理研究。

摘要

预nyl转移酶（PT）是一类利用异戊烯基焦磷酸（IPP）催化烯丙基焦磷酸链延伸的酶 通过 多个缩合反应。DHDDS（去氢多萜醇二磷酸合酶）是一种真核生物长链 顺式-PT（形成 顺式 双键来自缩合反应）催化法尼基焦磷酸（FPP，一种烯丙基焦磷酸）的链延伸 通过 与异戊烯基焦磷酸（IPP）的多次缩合反应。DHDDS具有重要的生物医学意义，因为该酶中的一个非保守突变（K42E）会导致 视网膜色素变性，最终导致失明。因此，本实验方案旨在获得大量高纯度的DHDDS，适用于其作用机制研究。本文中，通过蛋白融合技术、优化培养条件以及密码子优化，实现了功能活性人源DHDDS的高效表达与纯化 E. coli该方案简单、经济且节省时间。同源性 顺式不同物种间的 PT 表明，本方案可能适用于其他真核生物 顺式-PT 也是如此，例如参与天然橡胶合成的酶。

引言

预nyl转移酶是一类以异戊烯基焦磷酸（IPP）催化烯丙基焦磷酸链延伸的酶 通过 多次缩合反应 1,2Z型酶催化形成 顺式 缩合反应中的双键，而E型酶催化 转 双键形成 3. 顺式- 预nyl转移酶（顺式-PT、Z型酶）传统上根据其产物链长分为短链（C15），中链（C50-55）以及长链（C70-120) 4. DHDDS（去氢多异戊二烯二磷酸合酶）是一种真核生物长链 顺式-催化法尼基二磷酸（FPP，一种烯丙基二磷酸）链延伸的PT 通过 与异戊烯基焦磷酸（IPP）的多次缩合反应 1,5,6。这导致去氢多萜二磷酸的形成，一种C55-100作为N-连接蛋白糖基化中糖基载体分子焦磷酸多萜醇前体的多萜基焦磷酸 1在阿什肯纳兹犹太人中，DHDDS 基因的错义非保守突变（K42E）导致常染色体隐性遗传性视网膜色素变性 7,8因此，本实验方案旨在获得适用于机制研究的高纯度DHDDS蛋白。

大肠杆菌 被认为是重组蛋白表达最方便且成本效益最高的宿主，因此也是使用最频繁的宿主。然而，当尝试在其中异源过表达蛋白质时 E. coli，应考虑蛋白质的特异性。从 E. coli，由于不同蛋白质具有不同的特性，因此并非易事。目前已开发出多种方法以克服这些困难。本文采用蛋白质融合、优化培养条件以及密码子优化等策略，实现了功能活性人源DHDDS的过表达与纯化 E. coli值得注意的是，此前曾有尝试在酵母中过表达 顺式- 未融合蛋白的PT因完全不溶而失败，即使在去垢剂存在下也是如此 12该方案操作简便、成本低廉、节省时间，且能够获得适用于机制研究的DHDDS制备样品。鉴于其同源性 顺式-PT 在不同物种间的应用，我们建议本方案也可用于其他真核生物 顺式-PT 也是如此。

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方案

1. 克隆 顺式-PT 用于过表达 E. coli

  1. 获取 pET-32b 表达载体，该载体设计用于克隆并高水平表达与 109 个氨基酸的硫氧还蛋白（TRX）融合的蛋白序列17，并含有大肠杆菌（E. coli）密码子优化的18全长cis-PT 编码序列。
  2. 确保在cis-PT 序列上游包含 TEV 蛋白酶（烟草蚀刻病毒蛋白酶）切割位点（ENLYFQ/G，其中"/"表示切割位点）9，并在其后连接一段短的柔性连接子（SGSGSG，以增强切割位点的可及性）（图 1A）。同时，在两端添加合适的 5' 和 3' 限制性酶切位点以用于克隆。
  3. 使用标准连接技术将合成的 DNA 构建体克隆至 pET-32b 载体中10。

2 . 人源 DHDDS 的过表达在 E. coli

  1. 转化 E. coli 根据制造商说明书，将TRX融合的DHDDS构建体转化至T7表达感受态细胞中。
  2. 根据制造商的说明，在含氨苄青霉素（200 mg/L）的选择性LB-琼脂平板上接种转化后的细胞。
  3. 将挑选的菌落接种于含有100 mg/L氨苄青霉素的250 mL三角瓶中的100 mL LB培养基中，作为种子培养物，于37 °C、200 rpm恒定振荡条件下过夜培养。
  4. 将80 mL培养物接种至两个5 L的锥形瓶中（每瓶40 mL），每个锥形瓶中含有1.5 L添加了100 mg/L氨苄青霉素的2x YT培养基（16 g/L胰蛋白胨、10 g/L酵母提取物、5 g/L NaCl）。
  5. 在37 °C、180 rpm持续振荡条件下培养菌液，直至达到OD600纳米米 = 0.5.
  6. 将温度降至16 °C，并加入0.5 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导细胞。在相同条件下继续培养16–20小时以表达蛋白。
  7. 通过离心收集细胞（10,000 x g 10分钟。
    注意：此处可暂停实验流程；细胞沉淀应保存在 -80°C，直至进行纯化。

3 . 人源 DHDDS 的纯化

  1. 用缓冲液 A（25 mM Tris-HCl，pH 7.5，150 mM NaCl，0.1% Triton X-100，10 mM β-巯基乙醇）、1 µg/mL DNase I 和蛋白酶抑制剂混合物重悬细胞。
  2. 使用玻璃-聚四氟乙烯匀浆器匀浆细胞。
  3. 使用微流化器或等效设备在 12,000 - 15,000 psi 条件下裂解细胞11。
  4. 将细胞裂解物在 4 °C 下以 40,000 x g 离心 45 分钟，收集含有可溶组分的上清液。
  5. 将上清液上样至 5 - 10 mL 钴固定化金属亲和层析柱（Co2+-IMAC）12，柱中含 10 mM 咪唑，随后用含 10 mM 咪唑的缓冲液 A 充分洗涤，以减少非特异性蛋白结合。
  6. 用添加了 250 mM 咪唑的缓冲液 A 洗脱过表达蛋白。
  7. 使用经缓冲液 A 平衡的 53 mL 制备型脱盐柱去除咪唑。
  8. 向洗脱蛋白中加入 6xHis 标签 TEV 蛋白酶（每 50 mg 蛋白加入 1 mg TEV 蛋白酶），在 4 °C 下过夜孵育，以去除其 6xHis 标签的 TRX 融合蛋白。
  9. 将切割后的蛋白上样至经含 5 mM 咪唑缓冲液 A 平衡的 Co2+-IMAC 柱，以去除切割下来的 6xHis 标签 TRX 融合蛋白及 TEV 蛋白酶。
  10. 收集穿流液，并使用 30 kDa 分子量截留的离心滤膜浓缩至 3 - 4 mL。
  11. 将浓缩后的蛋白上样至经缓冲液 A 平衡的 Superdex-200 凝胶过滤层析柱进行最终纯化。该蛋白以二聚体形式洗脱（约 76 kDa）。
  12. 通过将洗脱图谱与柱校准曲线比较，选择目标组分。
  13. 使用 SDS-PAGE 评估样品纯度。
  14. 确定下游实验所需的蛋白浓度，将纯化浓缩后的蛋白分装，于液氮中速冻后保存于 -80 °C，待用。

4 . 分析型尺寸排阻色谱（SEC）

  1. 为确保蛋白耐受冻融循环的能力，将一份冷冻蛋白样品解冻后，在21,000 x g 孵育10分钟以去除不溶性聚集体。收集上清液。
  2. 使用超高效液相色谱系统，将蛋白质上样至预先用含25 mM Tris-HCl（pH 7.5）、150 mM NaCl、0.02% Triton X-100和10 mM β-mercaptoethanol的缓冲液平衡的Superdex-200分析柱上 13,14.
  3. 监测色氨酸荧光（λex = 280 nm, λem = 350 nm）检测蛋白质的洗脱轮廓。确保具备有效的分子量测定校准曲线——此类曲线可获取 通过 SEC色谱柱制造商。

5 . 酶动力学 - 时间依赖性活性 15,16,17

  1. 为确保纯化蛋白的活性，将5 μM纯化的DHDDS与10 μM FPP和50 μM 14C-IPP 在含 0.5 mM MgCl 的缓冲液 A 中启动反应2 在 22 - 30 °C 条件下。
    注意：具体的反应条件可能因不同制备方法而有所差异 顺式- 与DHDDS不同的PTs。此外，DHDDS的活性还依赖于温度和[Mg2+].
    注意： 14C-IPP 具有放射性，应根据当地辐射安全法规使用。
  2. 在0、2、4和6小时时，从反应体系中取出15 μL样品，并立即加入15 μL含20 mM EDTA的缓冲液A（终浓度为10 mM EDTA）以终止反应。
  3. 加入1 mL H2用氧气饱和的1-丁醇充分涡旋振荡，以萃取反应产物。
    注意：此处可暂停实验方案，样品可留存以备后续检测。
  4. 向样品中加入闪烁液，并使用闪烁计数器定量分析正丁醇相中的反应产物 14C，以及反应混合物中15 μL的放射性，代表总放射性。
  5. 从每个时间点的读数中减去使用0 h样品测得的背景读数，并计算百分比 14C-IPP 已使用。
  6. 计算净量 14通过计算各时间点利用的占总量的百分比来确定C-IPP的并入情况 14C-IPP 浓度，并将结果绘制成随时间变化的函数图。净增加 14预期随着时间推移，C-IPP 的掺入量会增加。

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结果

此处使用的构建体及纯化过程的总体概述见图1。各纯化步骤所获得样品的结果见图2。该SDS-PAGE分析显示了DHDDS的逐步纯化过程，最终获得高纯度产物。图3展示了纯化酶的分析型SEC结果，表明该蛋白质仅以同源二聚体形式存在。图4显示了一个典型的时间依赖性活性测定实验。14C-IPP的掺入量在6小时内明显上升，证实所获得的纯化酶具有功能活性。

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讨论

本文所述在大肠杆菌（E. coli）细胞中纯化功能性人源DHDDS蛋白的方案简单高效，一旦获得合适的表达载体，可在3至4天内完成蛋白的过表达与纯化。鉴于基因组测序领域的突破已提供了大量关于多种疾病遗传学的信息18，此类蛋白纯化方案具有特殊重要意义，因而迫切需要建立高通量方法，在蛋白水平上表征致病机制19。

为了克服异源蛋白过表达与纯化中的常见问题，本研究采取了若干关键措施，这些措施对于成功获得可溶且具有功能的蛋白至关重要。首先，DHDDS 以硫氧还蛋白（TRX）融合蛋白的形式进行过表达。TRX 有助于融合蛋白的正确折叠，并提高其可溶性，从而防止包涵体的形成20。其次，为了提高蛋白产量，对DNA构建体进行了大肠杆菌（E. coli）密码子优化21。最后，为进一步降低包涵体形成的可能，于16 °C条件下诱导蛋白表达，以减缓蛋白合成速率，从而更有利于蛋白正确折叠<...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由以色列科学基金会结构细胞生物学卓越研究中心（I-CORE，项目编号1775/12）、以色列科学基金会资助项目1721/16和2338/16（Y.H.）以及825/14（D.K.）提供经费支持。作者对Fields Estate基金会对D.K.的支持深表感谢。本工作由Ilan Edri和Michal Goldenberg完成，作为特拉维夫大学萨克勒医学院医学博士论文的部分要求。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
pET-32bNovagen69016-3
T7 Express lysY Competent E. coli (高效率)NEBC3010I
cOmplete，无EDTA蛋白酶抑制剂混合物Roche11873580001
TALON-superflow树脂GE Healthcare28-9574-99
HiPrep 26/10脱盐柱 GE Healthcare17508701
HiLoad 16/60 superdex-200 GE Healthcare28989335
superdex-200 increase 5/150 GL GE Healthcare28990945
14C-异戊烯基焦磷酸Perkin-ElmerNEC773050UC 
反,反-法尼基焦磷酸Sigma44270-10MG

参考文献

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