本文描述了一种在非变性条件下，于大肠杆菌（Escherichia coli）中过表达并纯化密码子优化的人源cis-异戊二烯基转移酶的简单方案，同时包含酶活性检测方法。该方案可推广应用于其他cis-异戊二烯基转移酶蛋白的制备，所得蛋白在数量和质量上均适用于机理研究。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
人源蛋白的过表达与纯化 顺式- prenyltransferase 在 大肠杆菌
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
预nyl转移酶（PT）是一类利用异戊烯基焦磷酸（IPP）催化烯丙基焦磷酸链延伸的酶 通过 多个缩合反应。DHDDS（去氢多萜醇二磷酸合酶）是一种真核生物长链 顺式-PT（形成 顺式 双键来自缩合反应）催化法尼基焦磷酸（FPP，一种烯丙基焦磷酸）的链延伸 通过 与异戊烯基焦磷酸（IPP）的多次缩合反应。DHDDS具有重要的生物医学意义，因为该酶中的一个非保守突变（K42E）会导致 视网膜色素变性，最终导致失明。因此，本实验方案旨在获得大量高纯度的DHDDS，适用于其作用机制研究。本文中，通过蛋白融合技术、优化培养条件以及密码子优化，实现了功能活性人源DHDDS的高效表达与纯化 E. coli该方案简单、经济且节省时间。同源性 顺式不同物种间的 PT 表明，本方案可能适用于其他真核生物 顺式-PT 也是如此，例如参与天然橡胶合成的酶。
引言
预nyl转移酶是一类以异戊烯基焦磷酸（IPP）催化烯丙基焦磷酸链延伸的酶 通过 多次缩合反应 1,2Z型酶催化形成 顺式 缩合反应中的双键，而E型酶催化 转 双键形成 3. 顺式- 预nyl转移酶（顺式-PT、Z型酶）传统上根据其产物链长分为短链（C15），中链（C50-55）以及长链（C70-120) 4. DHDDS（去氢多异戊二烯二磷酸合酶）是一种真核生物长链 顺式-催化法尼基二磷酸（FPP，一种烯丙基二磷酸）链延伸的PT 通过 与异戊烯基焦磷酸（IPP）的多次缩合反应 1,5,6。这导致去氢多萜二磷酸的形成，一种C55-100作为N-连接蛋白糖基化中糖基载体分子焦磷酸多萜醇前体的多萜基焦磷酸 1在阿什肯纳兹犹太人中，DHDDS 基因的错义非保守突变（K42E）导致常染色体....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 克隆 顺式-PT 用于过表达 E. coli
- 获取 pET-32b 表达载体，该载体设计用于克隆并高水平表达与 109 个氨基酸的硫氧还蛋白（TRX）融合的蛋白序列17，并含有大肠杆菌（E. coli）密码子优化的18全长cis-PT 编码序列。
- 确保在cis-PT 序列上游包含 TEV 蛋白酶（烟草蚀刻病毒蛋白酶）切割位点（ENLYFQ/G，其中"/"表示切割位点）9，并在其后连接一段短的柔性连接子（SGSGSG，以增强切割位点的可及性）（图 1A）。同时，在两端添加合适的 5' 和 3' 限制性酶切位点以用于克隆。
- 使用标准连接技术将合成的 DNA 构建体克隆至 pET-32b 载体中10。
2 . 人源 DHDDS 的过表达在 E. coli
- 转化 E. coli 根据制造商说明书，将TRX融合的DHDDS构建体转化至T7表达感受态细胞中。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
此处使用的构建体及纯化过程的总体概述见图1。各纯化步骤所获得样品的结果见图2。该SDS-PAGE分析显示了DHDDS的逐步纯化过程，最终获得高纯度产物。图3展示了纯化酶的分析型SEC结果，表明该蛋白质仅以同源二聚体形式存在。图4显示了一个典型的时间依赖性活性测定实验。14C-IPP的掺入量在6小时内明显上升，证实所获得的纯化酶具有功能活性。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文所述在大肠杆菌（E. coli）细胞中纯化功能性人源DHDDS蛋白的方案简单高效，一旦获得合适的表达载体，可在3至4天内完成蛋白的过表达与纯化。鉴于基因组测序领域的突破已提供了大量关于多种疾病遗传学的信息18，此类蛋白纯化方案具有特殊重要意义，因而迫切需要建立高通量方法，在蛋白水平上表征致病机制19。
为了克服异源蛋白过表达与纯化中的常见问题，本研究采取了若干关键措施，这些措施对于成功获得可溶且具有功能的蛋白至关重要。首先，DHDDS 以硫氧还蛋白（TRX）融合蛋白的形式进行过表达。TRX 有助于融合蛋白的正确折叠，并提高其可溶性，从而防止包涵体的形成20。其次，为了提高蛋白产量，对DNA构建体进行了大肠杆菌（E. coli）密码子优化21。最后，为进一步降低包涵体形成的可能，于16 °C条件下诱导蛋白表达，以减缓蛋白合成速率，从而更有利于蛋白正确折叠<.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由以色列科学基金会结构细胞生物学卓越研究中心（I-CORE，项目编号1775/12）、以色列科学基金会资助项目1721/16和2338/16（Y.H.）以及825/14（D.K.）提供经费支持。作者对Fields Estate基金会对D.K.的支持深表感谢。本工作由Ilan Edri和Michal Goldenberg完成，作为特拉维夫大学萨克勒医学院医学博士论文的部分要求。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| pET-32b | Novagen | 69016-3 | |
| T7 Express lysY Competent E. coli (高效率) | NEB | C3010I | |
| cOmplete，无EDTA蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 11873580001 | |
| TALON-superflow树脂 | GE Healthcare | 28-9574-99 | |
| HiPrep 26/10脱盐柱 | GE Healthcare | 17508701 | |
| HiLoad 16/60 superdex-200 | GE Healthcare | 28989335 | |
| superdex-200 increase 5/150 GL | GE Healthcare | 28990945 | |
| 14C-异戊烯基焦磷酸 | Perkin-Elmer | NEC773050UC | |
| 反,反-法尼基焦磷酸 | Sigma | 44270-10MG |
参考文献
- Grabinska, K. A., Park, E. J., Sessa, W. C. cis-Prenyltransferase: New Insights into Protein Glycosylation, Rubber Synthesis, and Human Diseases. J Biol Chem. 291 (35), 18582-18590 (2016).
- Ogura, K., Koyama, T., Sagami, H. Polyprenyl diphosphate synthases. Subcell Biochem. 28, 57-87 (1997).
- Ogura, K., K....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
