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方法文章

研究固有蛋白质聚集随年龄变化的方法 秀丽隐杆线虫

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DOI：

10.3791/56464

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2017年11月26日

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1Protein Aggregation and Aging, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 2Graduate School of Cellular and Molecular Neuroscience, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE)

本文内容

摘要

本文所介绍方法的目的是研究模式生物 C. elegans 在正常衰老过程中蛋白质的聚集现象。该实验方案是一种强大的工具，可用于研究随年龄增长而形成的高不溶性大分子聚集体，并确定蛋白质稳态的变化如何影响蛋白质聚集。

摘要

近几十年来，神经退行性疾病（如阿尔茨海默病（AD）和帕金森病（PD））的发病率不断上升。这些与年龄相关的疾病特征是患者大脑中出现具有纤维结构的蛋白质聚集体。目前尚不完全清楚为何原本可溶性的蛋白质会经历聚集过程。近年来发现，蛋白质聚集不仅限于疾病状态，而是正常衰老过程的一部分，这使得研究人员能够在不使用异位表达的人类疾病相关蛋白的情况下，研究调控蛋白质聚集的分子与细胞机制。本文中，我们描述了通过互补方法在Caenorhabditis elegans中检测固有蛋白质聚集的技术。首先，我们介绍如何培养大量年龄同步化的C. elegans以获得老年个体，并提供用于分离高度不溶性大聚集体的生化实验流程。结合特异性基因敲低技术，可通过定量质谱进行系统性分析，或通过抗体进行候选蛋白分析，从而解析特定基因在促进或抑制年龄依赖性蛋白质聚集中的作用。随后，利用表达荧光标记的易聚集蛋白的转基因动物进行in vivo分析，以验证上述发现。这些方法将有助于阐明为何某些蛋白质在衰老过程中易于聚集，并最终揭示如何维持这些蛋白质的完全功能状态。

引言

蛋白质错误折叠和聚集被认为是多种神经退行性疾病（如阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症（ALS）、额颞叶痴呆（FTD）以及其他许多疾病）的标志性特征。例如，在帕金森病患者中，α-突触核蛋白会组装成淀粉样纤维，并在黑质区域积聚形成路易小体；而在肌萎缩侧索硬化症患者中，TDP-43 或 FUS 蛋白发生错误折叠，进而在变性的运动神经元胞质中形成聚集体。在这些神经退行性疾病中，维持蛋白质稳态（即蛋白质内稳态）的机制均无法阻止错误折叠蛋白的积累，从而导致疾病的发生。

蛋白质稳态对于维持细胞功能至关重要，在正常条件下，这些调控机制可严格控制蛋白质的合成、折叠和降解速率。多项研究表明，随着衰老，许多细胞和器官维持蛋白质稳态的能力逐渐受损，而蛋白质稳态网络在生理上的老化性衰退是神经退行性疾病的重要加剧因素（详见参考文献1,2,3）。蛋白质质量控制能力以及细胞对未折叠蛋白应激的响应能力随年龄增长而下降，这一事实提示蛋白质错误折叠和聚集可能是衰老的普遍后果。事实上，我们及其他研究团队已证明，蛋白质聚集不仅限于疾病状态，而是部分蛋白质组在衰老动物体内会变得高度去垢剂不溶4,5,6,7,8,9,10。计算分析和体内研究表明，这些生理性衰老相关聚集物在多个方面与疾病相关的聚集物相似5。内源性、依赖年龄的蛋白质聚集现象的发现，使我们能够在不使用异位表达的人类疾病相关蛋白的情况下，解析调控蛋白质聚集的分子与细胞机制。目前，关于广泛性蛋白质不溶性的调控机制，以及这种失调对机体健康影响的研究仍十分有限。

线虫 C. elegans 是衰老研究中最广泛使用的模式生物之一，因其寿命相对较短，并表现出许多在高等生物中观察到的典型衰老特征。在 C. elegans 中，研究人员已通过基于差异溶解度的逐级生化分级方法，研究了衰老对蛋白质不溶性的影响，该方法在神经退行性疾病研究领域被广泛用于提取疾病相关的蛋白聚集体11。通过定量质谱分析，已有研究显示，在无疾病模型的情况下，数百种蛋白质在 C. elegans 中会变得易于聚集5。本文详细描述了在液体培养基中大量培养线虫的实验方案，以及通过逐级提取分离聚集蛋白的方法，以便通过质谱进行定量，并通过蛋白质印迹（Western blot）进行分析。由于错误折叠及易聚集的蛋白质会在衰老的 C. elegans 生殖腺中积累，从而掩盖其他体细胞组织中的变化5,12,13，我们采用一种缺失生殖腺的突变体，以将分析重点集中在非生殖组织中的蛋白质不溶性上。本方法可用于分析那些在0.5% SDS中高度不溶、且可通过相对较低离心速度沉淀下来的大型聚集体。此外，已有其他文献报道了另一种提取条件较温和的方案，可用于收集更小且溶解性更高的聚集体10。同时，本文还描述了用于在 C. elegans 中评估体内（in vivo）蛋白聚集的方法。

总体而言，这些方法结合RNA干扰（RNAi）可用于评估目的基因在调控年龄依赖性蛋白质聚集中的作用。为此，我们描述了对年轻和年老线虫的提取物进行分析的方法，这些线虫在有或无RNAi介导的特定目的蛋白敲低条件下培养。这些方法应成为确定蛋白质稳态网络中哪些组分调控蛋白质不溶性的有力工具。已有研究表明，多种干预措施（如降低胰岛素/胰岛素样生长因子（IGF）1信号通路（IIS））可显著延缓C. elegans的衰老过程14。寿命调控通路常可诱导蛋白质质量控制机制，因此这些通路可能主动影响蛋白质聚集的速率。例如，我们展示了在长寿动物中抑制IIS通路后，其固有的蛋白质聚集水平降低7。

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方案

注意：为了更好地理解该操作流程，附上了一个工作流程示意图（图1）。

1. 针对目标基因进行RNAi处理的大量年轻与衰老期C. elegans的培养

注意：使用 秀丽隐杆线虫 温度诱导的不育 gon-2(q388) 突变体（CF2253）以获得大量年龄同步的老龄群体。所有操作步骤中，均需在半无菌条件下进行，并使用明火，同时检查是否存在污染（例如真菌或细菌污染）。若未特别说明温度，则所有步骤（包括离心）均在室温下进行。

  1. 制备 C. elegans gon-2(-) 突变体以获得无性腺动物
    注意：为获得缺乏性腺的不育动物，必须在亲代动物的最后幼虫阶段（L4）将其转移至25 °C，以避免母源效应的影响。
    1. 首次扩增 gon-2(-) 动物以收集用于温度转移的亲代
      1. 将 Escherichia coli OP50 菌株划线接种于Lysogeny Broth（LB）平板上，并在37 °C过夜培养。
      2. 次日，取一个OP50克隆接种至200 mL LB培养基中，并在37 °C过夜培养。
      3. 次日，用0.5 mL OP50接种15个高生长（HG）培养基平板（直径9 cm），并用刮刀均匀涂布。将平板置于室温下两天。
      4. 将未经历两代饥饿的 gon-2(-) 动物转移至15个接种了OP50的HG培养基平板上，并在20 °C维持培养，直至平板上成虫密集且仍有部分OP50存在。
      5. 同时，按照步骤1.1.1.3的方法接种60个HG培养基平板，并置于室温下保存。注意：接种后的平板不应保存超过一周，否则在室温下琼脂会开裂。
      6. 当大多数成虫开始产卵时，对密集的平板进行漂白处理15。将卵收集至两个15 mL离心管中，并在20 °C下置于旋转混合仪中过夜。
      7. 次日，用M9缓冲液（85 mM NaCl，42 mM Na2HPO4·7H2O，22 mM KH2PO4）洗涤孵化出的L1幼虫：在3,000 x g下离心30秒，弃上清，加M9至15 mL刻度线。再次离心，弃上清，并重复步骤1.1.1.6。最后用M9将含有虫体沉淀的离心管补至15 mL。
      8. 使用解剖显微镜，通过计数置于未接种琼脂平板上的2 µL液滴中的L1幼虫数量，评估L1总数。至少取九个液滴的平均值。
      9. 每块接种的HG平板接种6,500个L1幼虫，并在20 °C下培养至L4阶段。
    2. 第二次扩增 gon-2(-) 动物以获得用于实验的无性腺动物
      1. 在L4阶段，将步骤1.1.1.9中的线虫转移至25 °C，直至其开始产卵且L1幼虫开始孵化。
      2. 通过沉降法收集卵和L1幼虫
        注意：在温度转移至25 °C后，建议采用沉降法这一温和技术，以将脆弱的卵和L1幼虫与成虫分离。
        1. 使用每五块平板5 mL M9缓冲液冲洗平板。将线虫转移至50 mL离心管中。
        2. 将所有离心管补M9至45 mL刻度线，静置约10分钟使成虫沉降，收集上清液至50 mL离心管中，并对沉淀重复此步骤。将含有卵和L1幼虫的上清液在3,000 x g下离心1分钟，静置约10分钟使L1幼虫沉降，弃上清至剩余15 mL。
          注意：此为关键步骤。切勿过早弃去上清，以尽可能多地收集L1幼虫。
        3. 将含有卵和L1幼虫的离心管置于旋转混合仪中，在25 °C下过夜孵育。
  2. 无性腺动物的液体培养以收集经RNAi靶向目标基因处理的年轻与衰老动物
    注意：某些基因对RNAi的响应可能具有温度依赖性16。作为RNAi的替代方案，可将突变基因整合至gon-2(-)遗传背景中。
    1. 液体培养用细菌的制备
      1. 分别接种4 L LB培养基，加入12 mL相应细菌培养物，制备OP50及RNAi细菌（产生目标dsRNA的细菌及空载体对照细菌），并在RNAi细菌培养物中添加终浓度为50 µg/mL羧苄青霉素和1 mM IPTG，于37 °C、180 rpm条件下过夜培养。
      2. 次日，在4 °C、6,700 x g条件下离心10分钟收集菌体。弃上清，将每份菌体沉淀重悬于60 mL冰上预冷的S基础培养基（100 mM NaCl，50 mM磷酸钾pH 6）中。将三份重悬菌体（OP50、对照RNAi细菌及目标基因RNAi细菌）置于4 °C，直至进行步骤1.2.2或1.2.3。
        注意：线虫可从L1阶段开始进行RNAi处理（见步骤1.2.3），或为避免发育缺陷，从最后幼虫阶段L4开始处理（见步骤1.2.2）。
    2. 从最后幼虫阶段L4开始进行RNAi处理的液体培养
      1. 在Fernbach培养瓶（容量2,800 mL）中加入200 mL S基础培养基。为达到终体积300 mL（见1.2.2.4），加入10 mM柠檬酸钾（pH 6）、3 mL微量元素溶液（5 mM乙二胺四乙酸（EDTA）、2.5 mM FeSO4、1 mM MnCl2、1 mM ZnSO4、0.1 mM CuSO4）、3 mM MgSO4、3 mM CaCl2、100 ng/mL多菌灵和5 µg/mL胆固醇。用膜密封螺旋盖封闭培养瓶。缓冲液配方参见表1。
      2. 将L1幼虫从25 °C（步骤1.1.2.2.3）取出，转移至15 mL离心管中。在1,900 x g下离心3分钟，弃上清，按步骤1.1.1.8方法计数每2 µL中的L1数量。将500,000个L1幼虫加入上一步准备的Fernbach培养瓶中。
      3. 根据线虫数量按比例加入OP50（来自步骤1.2.1）。例如，对于500,000条线虫，加入60 mL OP50。
      4. 用S基础培养基补足至总体积300 mL。将线虫培养物在25 °C、150 rpm摇床中孵育至L4阶段。
      5. 次日，线虫应达到野生型L4大小。为从OP50转换为RNAi细菌，将动物收集至六个50 mL离心管中，静置沉降后弃上清。用M9洗涤L4幼虫以去除残留的OP50细菌：在1,900 x g下离心3分钟，弃上清，并将所有L4幼虫转移至一个50 mL离心管中。按每5 µL计数L4数量（至少九次）。年轻线虫收集需两份50,000个L4，衰老线虫收集需两份100,000个L4。
      6. 按照1.2.2.1所述准备四个Fernbach培养瓶。每个培养瓶中还需添加终浓度为50 µg/mL羧苄青霉素和1 mM IPTG。
      7. 按线虫数量比例加入对照RNAi细菌和目标基因RNAi细菌（来自步骤1.2.1）：每个培养瓶中，年轻线虫加7 mL相应细菌，衰老线虫加14 mL。
      8. 每个培养瓶分别加入50,000条线虫用于年轻线虫收集，或100,000条线虫用于衰老线虫收集，并用S基础培养基补足至300 mL。将四组线虫培养物在25 °C、150 rpm条件下孵育。
    3. 从L1阶段开始进行RNAi处理的液体培养
      1. 按照1.2.2.1所述准备四个Fernbach培养瓶，并添加终浓度为50 µg/mL羧苄青霉素和1 mM IPTG。
      2. 继续按照1.2.2.2所述准备L1幼虫。总共需要300,000条线虫，平均分配至四个培养瓶。
      3. 按线虫数量比例加入对照RNAi细菌和目标基因RNAi细菌（来自步骤1.2.1），并考虑L1至L4阶段的生长过程：每个培养瓶中，年轻线虫加13 mL相应细菌，衰老线虫加26 mL。
      4. 后续操作同步骤1.2.2.8。
    4. C. elegans 液体培养的维持
      1. 定期从每份液体培养物中取样，置于载玻片（或琼脂平板）上，检查是否存在污染。使用解剖显微镜检查培养物中的细菌食物水平，尤其在生长阶段。按照步骤1.2.1预先准备2 L的对照RNAi细菌和目标基因RNAi细菌培养物。必要时将其加入C. elegans液体培养物中，其余部分保存于4 °C。
      2. 定期检查动物是否不育。大多数动物应无性腺。根据gon-2突变的外显率，部分个体可能具有退化的性腺结构，但不应观察到携带卵的动物。
  3. 从液体培养中收集经RNAi处理的年轻与衰老线虫
    注意：以下所有步骤均针对一个液体培养瓶，但相同年龄的对照组和目标基因RNAi组的两个培养物应同时处理。
    1. 在第2天或第3天收集年轻线虫，以测定蛋白质不溶性的基础水平。应在半数种群死亡时（最迟）收集衰老线虫。为此，将数滴液体培养物置于琼脂平板上，计数死亡与存活的线虫。取至少九个液滴的平均值。
    2. 准备以下试剂：1 L M9、1 L 含0.01%辛基苯氧基聚乙氧基乙醇（M9 + Octoxynol-9）的M9缓冲液，以及40 mL 60%蔗糖水溶液（ddH2O）。将试剂置于冰上保存。
    3. 将一个培养瓶中的线虫倒入分液漏斗，在室温下静置10分钟使其沉降。打开活塞，将线虫滴入一个50 mL离心管中。
    4. 将虫体沉淀分至两个15 mL离心管中，在室温下1,900 x g离心5分钟。弃上清，用M9补至15 mL进行洗涤。重复离心。最后将线虫转移至两个50 mL离心管中，用冰上预冷的M9补至总体积20 mL。
    5. 为去除细菌和死亡线虫，将两个20 mL稀释后的虫体沉淀分别加入两个装有20 mL冰上预冷60%蔗糖的50 mL离心管中。在室温下快速离心（2,700 x g，5分钟，加速度9，减速度7）。用大口径移液管（25 mL）小心吸取上层虫体层。最多吸取15 mL（若明显存在大量死亡线虫则减少体积）。立即将其加入预先在冰上准备的37 mL M9 + Octoxynol-9中（每份蔗糖管对应三管）。在室温下2,700 x g离心3分钟，加速度9，减速度7。
      注意：两者均需保持冰上预冷；否则分离效果不佳。切勿混合！由于蔗糖对线虫有毒，下一步操作需迅速。
    6. 将沉淀分至四个15 mL离心管中，用冰上预冷的M9+ Octoxynol-9洗涤两次：在室温下1,900 x g离心1分钟。弃上清，用冰上预冷的M9+Octoxynol-9补至15 mL刻度线，重复操作。
    7. 用冰上预冷的M9洗涤一次，将四个离心管合并为两个。用室温M9补至15 mL离心管中总体积4 mL，在25 °C旋转混合仪上旋转40分钟。
      注意：此步骤有助于线虫消化肠道内残留的细菌。在显微镜下检查线虫，确保无死亡个体。
    8. 按照1.3.5所述，用冰上预冷的M9+Octoxynol-9洗涤线虫两次。再用M9洗涤两次，并将线虫转移至一个离心管中。
    9. 在收集前，用不含抑制剂的重装配（RAB）高盐提取缓冲液（0.1 M 4-吗啉乙磺酸（MES）、1 mM乙二醇双四乙酸（EGTA）、0.1 mM EDTA、0.5 mM MgSO4、0.75 M NaCl、0.02 M氟化钠（NaF））洗涤线虫一次。弃上清，直至虫体沉淀表面无液体残留。
      注意：此步骤及下一步应迅速完成，以避免缓冲液中高盐浓度对线虫造成人工假象。
    10. 估算虫体沉淀体积，并加入等体积含抑制剂的RAB缓冲液（2倍蛋白酶抑制剂混合物）。使用巴斯德移液管吸取线虫，缓慢滴入装有液氮的50 mL离心管中（离心管半满，置于干冰中）。待液氮挥发后，将冷冻线虫保存于-80 °C，直至进一步处理。
      注意：液氮温度极低，操作时需佩戴适当防护装备。

2. 利用RNAi靶向目标基因的年轻与年老动物的不溶性蛋白质提取

  1. 处理步骤1.3中收集的动物样本
    注意：必须避免线虫样品发生任何解冻。使用液氮预冷研钵，并全程在干冰上操作。
    警告：液氮温度极低，操作时请穿戴适当的防护装备。
    1. 将冷冻的线虫转移至预冷的研钵中，研磨2.5分钟。
      注意：研磨过程中需小心操作：初始阶段，冷冻线虫呈小颗粒状，容易丢失。
    2. 向粉末中加入液氮（约100 mL）以再次冷却，继续研磨2.5分钟。使用显微镜检查确认线虫体已被破碎。将粉末转移至2 mL离心管中，并于-80 °C保存。
  2. 用于Western blot分析的快速不溶性蛋白提取
    注意：本方法用于比较不同时间点、在有或无靶向目标基因的RNAi处理下，总蛋白含量与不溶性蛋白水平的差异。从开始至步骤2.2.3的所有操作均需在冰上进行！
    1. 用150 µL裂解免疫沉淀缓冲液（RIPA缓冲液：50 mM Tris pH 8，150 mM NaCl，5 mM EDTA，0.5%十二烷基硫酸钠（SDS），0.5%脱氧胆酸钠（SDO），1%壬基酚聚氧乙烯醚（NP40），1 mM苯甲基磺酰氟（PMSF），1×蛋白酶抑制剂混合物）溶解步骤2.1所得的50 mg研磨线虫粉末。使用带灰色针头（27 G × ½"，0.4 mm × 13 mm）的1 mL注射器混悬样品，反复抽吸10次以充分均质化。
    2. 在4 °C下以18,400 × g离心20分钟，收集上清液。
    3. 将沉淀重悬于100 µL RIPA缓冲液中，在4 °C下以18,400 × g离心20分钟。弃去上清液，短暂离心后小心吸除残留上清。
    4. 为溶解高度不溶性蛋白，将沉淀重悬于75 µL尿素/SDS缓冲液（8 M尿素，2% SDS，50 mM二硫苏糖醇（DTT），50 mM Tris，pH 8）中，在室温下孵育10分钟。
    5. 为分析总蛋白含量，将步骤2.2.2获得的第一次RIPA上清液与尿素/SDS缓冲液重悬的沉淀部分合并。为校正提取体积差异，总蛋白样品中应包含三分之二的RIPA上清液和三分之一的尿素/SDS沉淀组分。在小型4–12%梯度凝胶上，分别上样9 µL尿素/SDS组分和4 µL总合并蛋白样品，检测不溶性蛋白水平。通过总蛋白染色监测各组蛋白量，并利用特异性抗体进行Western blot分析，验证质谱定量所得的个别蛋白不溶性变化情况（见第3节）。
  3. 用于质谱分析的不溶性蛋白提取，以分离SDS不溶性蛋白
    注意：所有操作步骤均需在冰上进行。
    1. 在干冰上将每个时间点、每种RNAi细菌处理组（年轻与衰老线虫、对照RNAi细菌、靶向目标基因的RNAi细菌）的研磨线虫样品各称取两份，每份350 mg，分别放入2 mL离心管中。
    2. 为去除高盐可溶性蛋白，向每管中加入两倍样品重量的RAB缓冲液（700 µL），其中含抑制剂（1 mM PMSF）、200 U/mL DNase I和100 µg/mL RNase A，在冰上溶解粉末。使用1 mL注射器（灰色针头，27 G × ½"，0.4 mm × 13 mm）反复抽吸混悬液15次，冰上孵育10分钟。在4 °C下以18,400 × g离心20分钟。穿过脂肪层收集上清液，将每种条件的高盐可溶性蛋白上清分别收集至一个2 mL离心管中（共四管）。去除并弃去脂肪层。将高盐可溶性蛋白分装后于-80 °C冷冻保存。
    3. 为去除脂质，将沉淀用700 µL含抑制剂（1 M蔗糖，不含DNase I和RNase A）的RAB缓冲液重悬。用注射器反复抽吸10次，冰上孵育5分钟。在4 °C下以18,400 × g离心20分钟。小心彻底去除所有上清液和脂质并弃去。
    4. 为去除SDS可溶性蛋白，将沉淀用700 µL RIPA缓冲液重悬。用注射器反复抽吸10次，冰上孵育10分钟。在4 °C下以18,400 × g离心20分钟。收集含SDS可溶性蛋白的上清液，分装后于-80 °C冷冻保存。
    5. 将每种条件的两个样品合并：先分别用500 µL RIPA缓冲液重悬各管沉淀，用注射器反复抽吸10次。在4 °C下以18,400 × g离心20分钟。小心彻底去除所有上清液并弃去。
      注意：本提取流程的目标是将可溶性蛋白与不溶性蛋白分离。因此，在下一步加入甲酸前，必须确保完全去除残留的RIPA上清液。
    6. 用400 µL 70%甲酸溶解最终含有高度不溶性蛋白的沉淀，用注射器反复抽吸20次。冰上孵育20分钟。在4 °C下以50,000 × g离心20分钟（加速度3，减速度5），以去除线虫角质层碎片。收集含有高度不溶性蛋白的上清液，并于-80 °C冷冻保存。
    7. 用于质谱分析的不溶性蛋白组分透析
      注意：透析过程在4 °C下进行。
      1. 配制8 L透析缓冲液（50 mM Tris，1 mM DTT，0.1 mM PMSF，pH 7.5），平均分装至八个1 L烧杯中。每个1 L烧杯的液面上放置三张透析膜（膜孔径=0.025 µm）。
      2. 每张膜上小心加载65 µL来自步骤2.3.6的甲酸溶解的不溶性蛋白样品。每种条件的样品分别加载至六张膜上。
      3. 取5 µL样品点于pH试纸，检测其中一个样品的pH值。当pH值达到7–8之间（约2小时后），轻柔地反复吹吸收集样品。最后，用10 µL透析缓冲液冲洗每张膜上的沉淀物。将样品于-80 °C保存。

3. 通过靶向目的基因的RNAi诱导年龄相关蛋白质不溶性变化的全面鉴定与定量

  1. 质谱分析前准备
    1. 将透析后的样品取等分试样，与已知浓度的参照样品一同上样至4-12%的梯度凝胶，通过总蛋白染色并使用图像分析软件定量蛋白含量。此步骤用于估算消化所需胰蛋白酶的用量（步骤3.1.4）。
    2. 使用离心浓缩仪浓缩样品，并将不溶性蛋白溶解于终浓度为8 M的尿素溶液中。
    3. 烷基化与还原
      1. 向样品中加入Tris(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP），使其终浓度为4 mM。在57 °C、300 rpm条件下孵育1小时，随后将样品冷却至室温。
      2. 加入碘乙酰胺，使其终浓度为8.4 mM。避光、室温孵育45分钟（也可孵育2小时）。
      3. 用150 mM碳酸氢铵稀释样品，使尿素终浓度为2 M。
    4. 以5% w/w的修饰胰蛋白酶在37 °C、400 rpm条件下过夜消化蛋白。
    5. 取消化后的蛋白样品上样至12% SDS凝胶，进行总蛋白染色，以分析消化效果。若仍可见条带，则重复步骤3.1.4和3.1.5。
    6. 来自年轻和年老的对照组及RNAi处理的C. elegans的肽段，按照制造商说明书使用同重标签进行相对和绝对定量标记。
      注：也可采用其他肽段或蛋白标记方法进行定量，例如串联质谱标签（tandem mass tags）。
      注：质谱分析：为降低样品复杂性，肽段应通过强阳离子交换色谱分离为不同组分后再进行质谱分析5。多种质谱仪均可分析同重标签进行相对和绝对定量，具体方法见其他文献17。所获得的数据应使用适当的软件进行处理。总体而言，该分析可鉴定高度不溶性蛋白及其在衰老过程中以及蛋白稳态调控下的变化情况。

4. In Vivo 评估目的基因在衰老过程中对聚集模式的影响

  1. 从第3节的质谱分析中，选择一种在RNAi处理的动物中积累程度不同的、具有年龄依赖性聚集倾向的蛋白质。构建转基因 秀丽隐杆线虫 表达该蛋白且带有荧光蛋白标签的品系，在其相应启动子或组织特异性启动子控制下（参见 讨论 选择合适启动子）。使用接种了OP50的线虫生长（NG）平板，通过标准技术在15 °C条件下培养该品系。例如，我们选用了一种转基因线虫品系，其在咽部肌肉特异性启动子驱动下表达N端融合tagRFP的多聚腺苷酸结合蛋白（PAB-1） pmyo-2
  2. 在体 评估在抑制目标基因后，随着年龄增长聚集状态的变化
    1. 提前一至两天，准备含NG、羧苄青霉素（Carb）和IPTG的平板，并接种对照细菌（空RNAi载体L4440）和用于抑制目标基因的RNAi细菌。（关于线虫RNAi的详细实验方案，请参见 秀丽隐杆线虫 参见 JoVE 科学教育数据库。 生物学基础1：酵母 果蝇 和 秀丽隐杆线虫 RNAi在 秀丽隐杆线虫. JoVE，美国马萨诸塞州剑桥市，doi: 10.3791/5105 (2017)
    2. 对于从L1阶段开始的RNAi处理，将产卵的线虫放置于多个分别接种了对照RNAi细菌或目的基因RNAi细菌的小型NG/Carb/IPTG（直径6 cm）平板上，在20 °C条件下培养。2小时后移除成虫，子代继续在20 °C条件下培养。为避免发育缺陷，RNAi处理可在L4幼虫阶段之后开始。
    3. 一旦后代发育至L4幼虫阶段，将这些L4幼虫转移至新制备的含有对照RNAi或目的基因RNAi细菌的NG/Carb/IPTG平板上。每种条件设置九个平板，每个平板接种15只转基因个体，并于20 °C培养。为避免与后代混淆，需每隔两天将成虫转移至新的培养板，直至其生殖期结束。
    4. 使用荧光体视显微镜在24倍放大条件下，每隔一天评估成虫期聚集倾向性蛋白在荧光标记下的分布变化。
      注意：聚集倾向性蛋白在明亮斑点中的年龄依赖性累积被用作聚集的检测指标。这些斑点应为高度不移动的结构，方可被定义为聚集体。应通过共聚焦显微镜结合光漂白后荧光恢复（FRAP）实验来确定其流动性。对于聚集的蛋白，在至少4分钟内，漂白区域不应观察到荧光恢复5,18为了量化随年龄的变化，我们对在成虫期第2天、第5天和第7天过表达PAB-1的年龄同步化线虫中的分布模式进行了评分，评分标准如下：低聚集体水平（在咽部后球区域有0-10个tagRFP::PAB-1斑点），中等聚集体水平（在咽部后球区域超过10个斑点），高聚集体水平（在咽部前球区域超过10个斑点）。

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结果

我们采用此处所述方法，评估了胰岛素/胰岛素样生长因子信号通路（IIS）减弱的长寿动物如何调控年龄依赖性蛋白质聚集。通过蛋白质印迹法（见步骤2.2，用于蛋白质印迹分析的快速不溶性蛋白质提取），我们分析了对照RNAi以及靶向胰岛素/类胰岛素生长因子-1受体daf-2的RNAi条件下，年轻（成虫第3天）和年老（成虫第18天）线虫的总蛋白含量及不溶性蛋白含量。我们未观察到总蛋白水平在衰老过程中或对照组与daf-2 RNAi组之间发生显著变化（图2A）。如预期，我们在对照组动物中检测到高度不溶性蛋白水平随年龄显著升高（图2B）。相比之下，在daf-2 RNAi的长寿动物中，蛋白质聚集倾向显著降低。对不溶性组分进行全蛋白染色显示，与同龄对照组相比，daf-2 RNAi组第18天线虫的提取物中蛋白条带模式复杂性较低。定量质谱分析表...

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讨论

本文报道了一种从经历RNA干扰并用于质谱和蛋白质印迹分析的老年C. elegans中分离高度不溶性蛋白质聚集体的方法。我们发现，通过降低胰岛素/胰岛素样生长因子信号通路（IIS）来改善蛋白质稳态，可显著防止与年龄相关的蛋白质聚集。通过在C. elegans中选择性地过表达特定的易聚集蛋白质，可进一步解析调控固有蛋白质聚集的分子机制。

固有的年龄依赖性蛋白质聚集与疾病相关蛋白质聚集的对比
本研究基于先前的研究发现，即蛋白质聚集并不局限于特定蛋白质在疾病背景下的聚集。通过关注内源性易聚集蛋白质，而非异位表达的疾病相关蛋白质，有望为蛋白质聚集过程的生理调控提供新的见解。由于年龄依赖性蛋白质聚集物存在于不同的细胞区域5，对其研究也应有助于揭示特定区室的质量控制机制。总体而言，调控固有蛋白质聚集的机制也可能在预防疾病相关蛋白质聚集中发挥重要作用。值得注意的是，尽管年龄依赖性蛋白质聚集在多个方面与疾病相关蛋白质聚集相似，但目前仍不清楚这些聚集物是否含有淀粉样纤维，而...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由德国神经退行性疾病中心（DZNE）以及玛丽·居里国际回归基金（322120，授予 D.C.D.）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Fernbach培养瓶 康宁4425-2XLPyrex，容量 2,800 ml，带 3 个挡板凹槽
膜片螺口盖 Schott1088655GL45
往复式混合器VWR444-0148
分液漏斗Nalgene4300-1000容量 1,000 ml
1 ml 注射器 BD Plastipak300013
灰色针头，27 G × ½ "，0.4 mm × 13 mmBD Microlance 3300635
膜过滤器 0.025 µMMilliporeVSWP04700
pH 试纸Machery-Nagel92110pH-Fix 0-14
蛋白酶抑制剂混合物罗氏4693132001Complete Mini 无EDTA片剂 
辛苯聚醇-9 ApplichemA1388Triton X-100
4-吗啉乙磺酸（MES）Sigma-AldrichM1317
壬基酚聚氧乙烯醚ApplichemA1694Nonidet P40 (NP40)
DNaseI罗氏04716728001重组，无RN酶
RNaseAPromegaA7973溶液
总蛋白印迹染色赛默飞世尔科技S11791Sypro Ruby 蛋白印迹染色剂
总蛋白凝胶染色ThermofisherS12001Sypro Ruby 蛋白凝胶染色剂
TCEP（三(2-羧乙基)膦盐酸盐）塞尔瓦36970
碘乙酰胺塞尔瓦26710
碳酸氢铵Sigma-Aldrich09830
测序级修饰胰蛋白酶PromegaV5111
相对与绝对定量的同重元素标签Sciex4352135iTRAQ 试剂多重试剂盒
Centrifuge Avanti J-26XPBeckman Coulter393126
Optima Max-XP 超速离心机Beckman Coulter393315
Centrifuge 5424REppendorf5404000413
离心机 5702Eppendorf5702000329
Centrifuge Megafuge 40R赛默飞世尔科技75004518
Concentrator PlusEppendorf5305000304离心蒸发仪
荧光体视显微镜 M165 FC Leica使用 Planapo 2.0x 物镜
解剖显微镜Leica Leica S6E
高倍显微镜 Zeiss Axio Observer Z1蔡司使用 PlanAPOCHROMAT 20x 物镜和 Zeiss Axio Cam MRm
软件
图像分析软件ImageJ
质谱数据分析蛋白质探查者http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm
大肠杆菌菌株
OP50CGC
RNAi 细菌
L4440Julie Ahringer RNAi文库
秀丽隐杆线虫 突变体
CF2253CGC，菌株名称：EJ1158 基因型： gon-2(q388)
秀丽隐杆线虫 转基因技术
DCD214Della David 在德国神经退行性疾病中心（DZNE）的实验室übingen基因型： N2；uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]
DCD215Della David 实验室，德国神经退行性疾病中心（DZNE）Tübingen基因型： daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]

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年龄同步化线虫高度不溶性聚集体基因敲低定量质谱分析荧光标记蛋白RAB提取缓冲液超速离心甲酸溶解
研究固有蛋白质聚集随年龄变化的方法 秀丽隐杆线虫
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