方法研究线虫线虫中固有的蛋白质聚集与年龄的变化

Summary

本文所提出的方法的目的是在模型生物体的正常衰老过程中, 探索蛋白质的聚集性, 即线虫。该协议代表了一个强大的工具, 以研究高度不溶性的大骨料, 形成与年龄和确定如何改变 proteostasis 影响蛋白质聚集。

Abstract

在过去的几十年中, 神经退行性疾病的流行, 如阿尔茨海默氏病 (AD) 和帕金森氏症 (PD), 已经增长。这些年龄相关的疾病的特点是在这些患者的大脑中出现了纤维结构的蛋白质聚集。确切地说, 为什么通常可溶性蛋白质会经历一个聚集过程仍然是不清楚的。发现蛋白质聚集不限于疾病过程, 而是正常衰老过程的一部分, 使研究的分子和细胞机制, 调节蛋白质聚集, 不使用 ectopically 表达人类疾病相关的蛋白质。在这里, 我们描述了通过互补的方法来检查线虫线虫中固有的蛋白质聚集的方法。首先, 我们将研究如何培养大量的年龄同步的线虫来获取衰老的动物, 我们提出了分离高不溶性大团聚体的生物化学程序。结合有针对性的基因击倒, 它可以解剖的作用, 一个基因的兴趣, 以促进或防止年龄依赖性的蛋白质聚集通过使用的综合分析与定量质谱或candidate-based 分析与抗体。然后通过体内分析, 用转基因动物表达荧光标记的聚集易发蛋白来证实这些结果。这些方法应该有助于澄清为什么某些蛋白质容易聚集与年龄和最终如何保持这些蛋白质完全功能。

Introduction

蛋白质折叠和聚集被认为是一些神经退行性疾病的标志, 如 AD, PD, 肌萎缩侧索硬化症 (ALS), 颞痴呆 (FTD), 和许多其他。例如, α-核组装成淀粉样纤维, 在帕金森病患者的黑质中积累为路易体体, 而 ALS 患者 TDP-43 或 FUS 错误在退化的运动神经元中形成细胞质聚集。在这些神经退行性疾病中, 维持蛋白质稳态或 proteostasis 的机制无法阻止错误蛋白的积累, 从而导致疾病。

Proteostasis 是至关重要的, 以确保细胞功能和正常情况下, 这些调控机制严格控制蛋白质的合成, 折叠和降解率。几项研究表明, 随着衰老, 许多细胞和器官保存蛋白质稳态的能力逐渐受到损害, proteostasis 网络的生理退化是一个重要的加重因素神经退行性疾病 (参考^1,2,3)。事实上, 蛋白质的质量控制和细胞对展开的蛋白质应激的反应受到年龄的影响, 表明蛋白质折叠和聚集可能是衰老的一般后果。事实上, 我们和其他人已经证明, 蛋白质聚集不限于疾病, 而不是部分的蛋白质组成为高洗涤剂-不溶于老年动物^{4,5,6,7 ,8,9,10}。计算和体内分析显示, 这些生理年龄相关的团聚体在几个方面类似于疾病聚集,⁵。发现内源性, 年龄依赖性的蛋白质聚集使我们有机会解剖的分子和细胞机制, 调节蛋白质聚集, 不使用 ectopically 表达的人类疾病相关的蛋白质。目前, 关于广泛的蛋白质不的调控, 以及这种失调对机体健康的影响, 只存在有限的信息。

线虫是在衰老研究中最广泛研究的模型生物之一, 因为这些动物的寿命相对较短, 并且在较高的生物体中表现出许多特征老化特征. 通过基于微分溶解度的序贯生化分馏技术, 研究了衰老对蛋白质不的影响, 广泛应用于神经研究领域中的疾病聚集物的提取 ¹¹.通过定量质谱法, 在没有疾病⁵的情况下, 显示了数百个蛋白质在C. 线虫中变得容易聚集。在这里, 我们详细地描述了在液体培养中生长大量蠕虫的协议, 以及用质谱法分离聚合蛋白质并通过印迹分析的顺序提取。由于错误和聚集倾向的蛋白质积累在老年的线虫性腺和其他躯体组织的面具变化^5,12,13, 我们使用无性腺突变体来集中分析蛋白质不在非组织中。所提出的方法可以分析不溶于 0.5% SDS 的高不溶大团聚体, 并通过相对较低的离心速度进行颗粒化。另外, 在其他地方也发布了一个不太严格的提取协议来收集更小、更可溶解的聚合体,¹⁰。此外, 我们还描述了用于评估C. 线虫中的聚合在体内的方法。

总的来说, 这些方法与 rna 干扰结合, 可以评估一个基因在调节年龄依赖性蛋白质聚集中的作用。为此, 我们描述的分析, 从年轻和年老的蠕虫的提取物, 并没有被击倒的特定蛋白质的兴趣使用 rna 干扰。这些方法应该是一个强大的工具, 以确定哪些组成部分的 proteostasis 网络调节蛋白质不。一些干预措施, 如减少胰岛素/胰岛素样生长因子 (igf-i) 1 信号 (IIS) 已被证明显着延迟C. 线虫老化¹⁴。长寿途径往往诱导蛋白质质量控制机制, 因此这些途径可以积极影响蛋白质聚集率。例如, 我们在抑制 IIS 路径⁷时演示了在长寿命的动物中减少固有的蛋白质聚集。

Protocol

注意: 为了更好地理解该过程, 附加了工作流的示意图 (图 1)。

1. 大量年轻和年老的线虫的生长, 以 rna 为目标的基因为对象

注意: 使用C. 线虫温度诱导不育的2 (q388)突变体 (CF2253) 来获得大的老年同步种群。在所有的步骤, 这是重要的工作在不条件下开放的火焰和检查, 没有污染 (例如, 真菌或细菌) 存在。如果温度不被描述, 在室温下执行步骤 (也 centrifugations)。

1. 制备线虫 gon-2 (-)突变体以获得无性腺动物
   注意: 要获得缺乏性腺的无菌动物, 必须在母动物体内诱导功能突变, 将这些基因在最后幼体阶段 (L4) 转移到25° c, 以避免产妇的贡献。
   1. 首次扩展gon-2 (-)动物以收集用于温度漂移的父代
      1. 条纹大肠杆菌OP50 株在性肉汤 (LB) 板上, 在37° c 的夜间孵育。
      2. 第二天接种200毫升 LB 培养基与一 OP50 克隆和孵育它隔夜在37° c。
      3. 第二天种子15高生长 (HG) 中等板材 (直径 9 cm) 与0.5 毫升 OP50 并且分布 OP50 用刮刀。把盘子放在室温下两天。
      4. 区块gon-2 (-)动物 (不饿死的最后两代) 到15汞培养基板播种与 OP50 和维持他们在20° c, 直到板块与成人汇合, 一些 OP50 仍然可用。
      5. 同时, 在台阶1.1.1.3 中描述了 OP50 60 汞培养基板, 并在室温下保持板材。小心: 当琼脂在室温下开裂时, 不应将种子板保存超过一周。
      6. 一旦大多数成年人开始产卵, 就像先前描述的¹⁵一样, 漂白汇合的盘子。收集鸡蛋在两个15毫升管和地方在一个 nutating 搅拌机过夜在20° c。
      7. 第二天洗涤孵化 L1s 与 M9 缓冲 (85 毫米氯化钠, 42 mm Na₂HPO₄· 7H₂O, 22 mm 的₂PO₄): 离心机在 3000 x g 为三十年代, 丢弃上清, 并填补高达15毫升标记与 M9。离心机, 丢弃上清, 重复步骤1.1.1.6。填充的管与产生的蠕虫丸高达15毫升标记与 M9。
      8. 用解剖显微镜计算 L1s 的总数, L1s 2 µL 滴放在 non-seeded 琼脂板上。平均从至少九下落获得的数字。
      9. 添加 6500 L1s 每种子汞板, 让蠕虫生长在20° c, 直到 L4 阶段。
   2. 第二次扩展gon-2 (-)动物以获得无性腺动物的实验
      1. 在 L4 阶段, 转移蠕虫从步骤1.1.1.9 到25° c, 直到他们开始产卵和 L1s 孵化。
      2. 沉淀法收集卵和 L1s
         注意: 在温度转移到25° c 后, 最好使用沉淀法作为一种温和的技术, 将脆弱的卵和 L1s 从成虫中分离出来。
         1. 用5毫升 M9 每五盘子 M9 洗盘子。把虫子转移到50毫升的管子里
         2. 用 M9 把所有的管子装满45毫升的标记, 让成虫沉淀大约10分钟, 在50毫升的试管中收集每一个上清液, 然后用小球重复这一步骤。将含有卵和 L1s 的上清液离心到 3000 x g 1 分钟, 让 L1s 沉淀约10分钟, 并除去上清, 直到15毫升离开。
            注意: 这是一个关键的步骤。不要过早清除上清, 尽可能多地收集 L1s。
         3. 将含有鸡蛋和 L1s 的管子放在25° c 的 nutating 搅拌机上过夜。
2. 非性腺动物的液体培养, 以收集有兴趣的基因为对象的幼小和年老动物
   注意: 一些基因对 rna 干扰的反应可以是温度依赖性, 如先前所描述的¹⁶。作为 rna 干扰的替代方法, 突变基因可以被合并到gon-2 (-)背景中。
   1. 液体培养细菌的制备
      1. 准备 OP50 和 rna 干扰细菌 (细菌生产期望的 dsRNA 和细菌与空的载体作为控制) 通过接种 4 L LB 媒介与12毫升各自细菌文化 (增加最后的集中50µg/毫升羧和1毫米 IPTG 到干扰细菌培养) 和孵化他们在37° c 隔夜在 180 rpm。
      2. 第二天收获文化在 6700 x g 为10分钟在4° c。在60毫升 ice-cold 的基底介质 (100 毫米氯化钠, 50 毫米磷酸钾 pH 6, 保持在冰上) 去除清和重的每个小球。保持三悬浮颗粒 (OP50, 控制 rna 干扰细菌, 和 rna 干扰细菌为感兴趣的基因) 在4° c 直到步1.2.2 或1.2.3。
         注意: 蠕虫可以生长在 L1 阶段的 rna 干扰 (见步骤 1.2.3) 或避免发育缺陷的最后幼体阶段 L4 (见步骤 1.2.2)。
   2. 液体培养在最后幼体期开始 L4 的 rna 干扰治疗
      1. 在 Fernbach 培养瓶中添加200毫升的基底介质 (容量2800毫升)。为最后的文化容量300毫升 (参见 1.2.2.4), 添加10毫米柠檬酸钾, pH 6, 3 毫升微量金属溶液 (5 毫米乙酸酸 (EDTA), 2.5 毫米 FeSO₄, 1 mm MnCl₂, 1 mm ZnSO₄, 0.1 mm 丘索₄), 3 mm MgSO₄, 3 毫米 CaCl₂, 100 ng/毫升多菌灵, 5 µg/毫升胆固醇)。用膜螺钉盖把烧瓶关上。有关缓冲区的食谱, 请参阅表 1 。
      2. 将 L1s 从25° c (步骤 1.1 2.2. 3) 中取出, 并将其转至15毫升管。离心机在 1900 x g 为3分钟, 去除上清, 计数 L1s 每2µL 如在步骤1.1.1.8。在前一步准备的 Fernbach 培养烧瓶中加入 50万 L1s。
      3. 将 OP50 (从步骤 1.2.1) 按比例添加到蠕虫的数量。例如, 对于50万蠕虫, 添加 60 mL OP50。
      4. 完整的蠕虫培养与 S 基础, 使总体积为300毫升。孵育蠕虫文化直到 L4 阶段在25° c 在一个震动孵化器以150转每分钟。
      5. 第二天, 蠕虫应该是野生型 L4s 的大小。从 OP50 到 rna 干扰的细菌, 收集六50毫升的动物管, 让它们沉淀和清除上清。用 M9 清洗 L4s 去除残余 OP50 细菌: 离心机在 1900 x g 为3分钟, 去除上清并且转移所有 L4s 入一个50毫升管子。计算 L4s 每5µL (至少九次)。需要两倍的 L4s 5万的幼虫收集和两次 10万 L4s 是需要的老年蠕虫收集。
      6. 如1.2.2.1 所述, 准备四 Fernbach 培养烧瓶。也加入最后的浓度50µg/毫升羧和1毫米 IPTG 每瓶。
      7. 增加控制 rna 干扰的细菌和 rna 干扰细菌为兴趣基因 (从步 1.2.1) 按比例成蠕虫的数量: 增加7毫升各自细菌每瓶为幼小蠕虫和14毫升每瓶为老蠕虫。
      8. 添加5万蠕虫每瓶幼虫收集和10万蠕虫每瓶老蠕虫收集, 并完成的文化与 S 基础, 以填补高达300毫升。孵育蠕虫培养 (四在总) 在25° c 和150转每分钟。
   3. L1 期开始的 rna 干扰处理液体培养
      1. 准备四 Fernbach 培养烧瓶, 如1.2.2.1 所述, 并添加50µg/毫升羧和 1 mM IPTG 的最终浓度。
      2. 继续进行 L1s 的制备, 如1.2.2.2 所述。总共需要30万只蠕虫将它们分成四烧瓶。
      3. 添加控制 rna 干扰的细菌和 rna 干扰细菌为感兴趣的基因 (从步 1.2.1) 与蠕虫的数量成正比, 如步骤1.2.2.7 中所描述的, 也考虑 L1 和 L4 阶段之间的生长阶段: 每瓶13毫升, 为年轻 w 添加各自的细菌orm 和26毫升每瓶老年蠕虫。
      4. 按照步骤1.2.2.8 中的描述继续。
   4. 维护C. 线虫液体培养
      1. 周期性地从每个液体培养基中收集一个分, 并将其放置在玻片上 (或者在琼脂板上), 以验证没有污染物。使用解剖显微镜, 特别是在生长阶段检查细菌的食物水平在文化。预先准备 2 L 培养的控制 rna 干扰细菌和 rna 干扰细菌的基因利益的描述在步骤1.2.1。如果需要, 将这些添加到C. 线虫液体培养基中, 其余的保持在4° c。
      2. 定期检查动物是否是无菌的。大多数动物不会有性腺。根据gon-2突变的显, 有些可能已中止了性腺结构, 但不应观察到具有卵子的动物。
3. 液体培养中的幼虫和老年蠕虫的采集
   注: 所有以下步骤为一个液体培养烧瓶, 但两个相同年龄的文化与控制和 rna 干扰细菌为感兴趣的基因应该一起处理。
   1. 在2天或3天收集幼虫来测量蛋白质不的基本水平。当一半的人口死亡时, 应该收集年老的蠕虫 (最迟)。为了确定这一点, 死的和活的蠕虫计数在几滴液体培养放置在琼脂板。比率平均超过九滴。
   2. 准备以下试剂: 1 l M9, 1 升 M9 与 0.01% Octoxynol-9 (M9 + Octoxynol-9), 和40毫升60% 蔗糖在 ddH₂o. 将试剂放在冰上。
   3. 将蠕虫从一个烧瓶倒入分离漏斗, 让蠕虫在室温下沉积10分钟。打开塞, 将蠕虫滴入一个50毫升的管子中。
   4. 将该蠕虫颗粒分成两个15毫升管, 并在室温下 1900 x g 离心5分钟。要清洗的蠕虫, 清除上清和填补高达15毫升与 M9。重复离心最后转移到两个50毫升的蠕虫管和填充高达20毫升总体积与 ice-cold M9。
   5. 为了去除细菌和死的蠕虫, 添加两个20毫升稀释的蠕虫丸到两个50毫升管填充20毫升 ice-cold 60% 蔗糖。在室温下快速离心 2700 x g, 5 分钟, 加速度9和减速7。小心地去除顶部的蠕虫层与一个大吸管 (25 毫升)。采取高达15毫升 (但如果有明显的死蠕虫很多)。把它直接放入37毫升的 M9 + Octoxynol-9 (每蔗糖管3管) 准备在冰上。离心机在 2700 x g 为3分钟在室温, 加速度9和减速7。
      注意: 两者都需要 ice-cold;否则分离将不起作用。不要混!因为蔗糖对蠕虫来说是有毒的, 所以要快速执行以下步骤是很重要的。
   6. 将小球分成四15毫升管, 用 ice-cold M9+ Octoxynol-9 清洗两次: 离心机在 1900 x g 处, 室温下1分钟。取出上清液, 用 ice-cold M9+Octoxynol-9 加15毫升标记, 重复手术。
   7. 用 ice-cold M9 冲洗一次, 将四根管子与两个管子相结合。在室温下 M9 15 毫升管中的总容积为4毫升, 并在25° c 的 nutating 搅拌器上旋转40分钟。
      注意: 这有助于蠕虫消化肠道中的任何残留细菌。检查显微镜下的蠕虫, 看看有没有死的。
   8. 清洗蠕虫两次与 ice-cold M9+Octoxynol-9 如描述的1.3.5。用 M9 冲洗两次, 将蠕虫转移到一根管子。
   9. 洗涤蠕虫一次在重新组装 (盐) 无抑制剂的萃取缓冲液 (0.1 米 4-morpholineethanesulfonic 酸 (MES), 1 毫米 ethyleneglycoltetraacetic 酸 (EGTA), 0.1 毫米 EDTA, 0.5 毫米 MgSO₄, 0.75 米氯化钠, 0.02 米氟化钠 (氟))收集之前。除去上清液, 直到蠕虫颗粒上没有液体。
      注意: 此步骤和下一步应迅速完成, 以避免在缓冲区中高盐浓度引起的蠕虫中产生伪影。
   10. 估计蠕虫颗粒的体积和添加一个相同的卷与抑制剂 (2x 蛋白酶抑制剂鸡尾酒)。使用巴斯德吸管, 绘制蠕虫, 慢慢滴入50毫升管一半充满液氮放置在干冰。让液氮蒸发, 将冷冻蠕虫储存在-80 ° c, 直到进一步处理。
       注意: 液氮处于极低的温度;穿戴适当的保护。

2. 以有兴趣的基因为对象的幼小和年老动物的不溶性蛋白提取

1. 1.3 步收集的动物的破坏
   注意: 重要的是要避免任何解冻的蠕虫样品。用液氮冷却砂浆, 在干冰上进行完整的操作。
   注意: 液氮处于极低的温度;穿戴适当的保护。
   1. 将冷冻蠕虫转移到预砂浆中, 研磨2.5 分钟。
      注意: 在研磨过程中要小心: 开始时, 冰冻的蠕虫是小子弹, 很容易失去它们。
   2. 加入液氮 (约100毫升) 的粉末, 再次冷却下来, 再研磨2.5 分钟. 用显微镜检查蠕虫的身体是否坏了。将粉末转化为2毫升的管子, 并将其储存在-80 ° c。
2. 快速不溶蛋白提取物用于免疫印迹分析
   注意: 使用此方法对不同日的总蛋白含量和不溶蛋白水平进行比较, 并对感兴趣的基因进行 rna 干扰。执行所有步骤, 直到步骤2.2.3 冰!
   1. 溶解50毫克的地面蠕虫从步骤2.1 与150µL Radioimmunoprecipitation 化验 (帕) 缓冲 (50 毫米三 pH 8, 150 毫米氯化钠, 5 毫米 EDTA, 0.5% 钠十二烷基硫酸钠 (SDS), 0.5% 钠胆酸 (SDO), 1% nonylphenylpolyethylenglycol (NP40), 1 毫米磺氟化物 (PMSF), 1x 蛋白酶抑制剂鸡尾酒)。质使用1毫升注射器与灰色针 (27 G x ½ ", 0.4 毫米 x 13 毫米) 的悬浮;草拟暂停10次。
   2. 离心机在 18400 x g 为20分钟在4° c。收集上清。
   3. 重在100µL 帕缓冲和离心机在 18400 x g 20 分钟在4° c。丢弃上清, 旋转不久, 并小心去除残留上清。
   4. 为了溶解高度不溶性的蛋白质, 重75µL 尿素/sds 缓冲液 (8 米尿素, 2% sds, 50 毫米糖 (德勤), 50 毫米三, pH 8), 在室温下孵育10分钟。
   5. 为了分析总蛋白含量, 将第一帕上清液与2.2.2 和尿素/SDS 颗粒悬浮结合。为了解释提取所用的体积, 总馏分应含有三分之二的帕上清和三分之一的尿素/SDS 颗粒分数。在一个小4-12% 梯度凝胶, 检查不溶性蛋白的水平, 加载9µL 的尿素/SDS 分数和4µL 总联合蛋白。执行总蛋白印迹染色, 以监测蛋白质水平。通过使用特定抗体的西方印迹, 验证不中的个体蛋白质的变化 (见第3节)。
3. 不溶蛋白提取分离 SDS 不溶蛋白的质谱
   注意: 在冰上执行所有步骤。
   1. 在干冰中, 每一个时间点和每一个 rna 干扰细菌 (年轻和年老的蠕虫, 控制 rna 干扰细菌, 以及感兴趣的基因的 rna 干扰细菌) 将两次350毫克的地面蠕虫分为2毫升的管。
   2. 为了去除盐可溶性蛋白质, 增加二容量每重量 (700 µL) 与抑制剂, 1 毫米 PMSF, 200 U/毫升 dnasei I 和100µg/毫升核糖核酸 A 对每根管子和溶解粉末在冰。将悬浮液绘制成1毫升注射器 (灰色针, 27 克 x ½, 0.4 毫米 x 13 mm) 15 次, 并在冰上孵育10分钟离心机在 18400 x G, 20 分钟在4° c。通过脂肪层, 收集含有盐可溶性蛋白的上清液为每一个2毫升的条件 (四管总)。除去脂肪并丢弃它。分盐可溶性蛋白在-80 ° c 时凝固。
   3. 为了除去脂质, 溶解700µL 与含有1米蔗糖的抑制剂 (没有 dnasei I 和核糖核酸 A) 的颗粒。将悬浮液抽出10次, 然后在冰上孵育5分钟, 离心机在 18400 x g 处, 在4° c 处为20分钟。要小心去除所有上清和血脂, 并丢弃它们。
   4. 为了去除 SDS 可溶性蛋白, 溶解700µL 帕缓冲颗粒。将悬浮液抽出10次, 在冰上孵育10分钟。离心机在 18400 x g 为20分钟在4° c。收集含有 SDS 可溶性蛋白的上清液和分-80 ° c 的冷冻剂。
   5. 将每个条件的两个样本一起磷, 然后用500µL 的帕缓冲器。把悬浮液抽到注射器里10次离心机在 18400 x g 为20分钟在4° c。要小心去除所有上清和丢弃它。
      注: 提取的目的是分离可溶性蛋白质与不溶性蛋白质。因此, 在下一步加入甲酸之前, 必须去除所有残留的帕上清液。
   6. 溶解最后的球团含有400µL 70% 甲酸的高不溶性蛋白, 并将悬浮液抽出20次。在冰上孵育20分钟。离心机在 5万 x g 为20分钟在4° c, 加速度3和减速 5, 去除蠕虫角质层残骸。收集含有高度不溶性蛋白质的上清液, 在-80 ° c 时将其冷冻。
   7. 质谱中不溶性蛋白组分的透析
      注: 透析在4° c。
      1. 准备8升透析缓冲液 (50 毫米, 1 毫米, 0.1 毫米 PMSF, pH 7.5), 并将其划分为八 1 l 烧杯。在每个 1 L 烧杯的缓冲表面上放置三膜 (膜过滤器 = 0.025 µM)。
      2. 每膜, 小心地装载65µL 的不溶性蛋白溶解在蚁酸中获得的步骤2.3.6。每个条件被划分到六膜。
      3. 检查一个样品的 ph 值, 去除5µL, 并添加到 ph 带。如果酸碱度在7和8之间 (近似地在 2 h 以后), 收集样品由移向上和向下柔和地。最后, 用10µL 透析缓冲液冲洗每膜的沉淀。冷冻样品在-80 ° c。

3. 以兴趣基因为目标的 rna 干扰对蛋白质不的变化进行综合鉴定和量化

1. 质谱分析的制备
   1. 评估透析样品中不溶性蛋白质的数量, 通过将分到4-12% 梯度凝胶上, 连同已知浓度的参考样品一起加载。用一个图像分析软件进行总蛋白凝胶染色和量化蛋白质量。这一步是必要的, 以估计的数量, 消化所需的胰蛋白酶 (步骤 3.1.4)。
   2. 用离心式蒸发器将样品浓缩, 溶解8米尿素最终浓度的不溶性蛋白。
   3. 烷基化和还原
      1. 添加三 (2-乙) 膦盐酸盐 (TCEP) 到最后浓度4毫米的样品。孵育为1小时在57° c 以300转每分钟。把样品放到室温下。
      2. 添加碘到最后浓度为8.4 毫米。在室温下, 在黑暗中孵育45分钟 (可以孵育2小时)。
      3. 将150毫米碳酸氢铵中的样品稀释以获得最终的2米尿素浓度。
   4. 在37° c 和 400 rpm 的夜间, 5% w/w 修饰胰蛋白酶的消化蛋白。
   5. 载入 12% SDS 凝胶中的消化蛋白样品, 并进行总蛋白凝胶染色, 以分析消化是否起作用。如果仍然存在一些带, 重复步骤3.1.4 和3.1.5。
   6. 从年轻和老年控制和 rna 干扰处理的多肽线虫按照制造商的指示, 用等压标记标记为相对和绝对定量。
      注: 另外, 其他标记肽或蛋白质的方法可用于量化, 如串联质量标签。
      注: 质谱分析: 为了降低样品的复杂度, 应将强阳离子交换色谱分离成不同的组分进行质谱分析⁵。一些质谱仪能够分析等压标签的相对和绝对定量的其他地方描述¹⁷。所获得的数据应使用适当的软件进行处理。总的来说, 这种分析允许识别高度不溶性蛋白质及其在年龄和 proteostasis 调制时的变化。

4.在体内一种兴趣基因对衰老过程中聚集模式影响的评价

1. 从3节的质谱分析中, 选择一个年龄依赖性的聚集易感蛋白, 在受 rna 干扰的动物中积累到不同的程度。生成转基因的线虫线, 表达这种蛋白标记为荧光蛋白, 并在其各自的启动子或组织特异性促进剂的控制下 (见讨论为适当的促进者的选择)。用 OP50 的线虫生长 (NG) 板上的标准技术维持15° c 的应变。例如, 我们选择的蠕虫应变表达 polyadenylate 结合蛋白 (PAB-1) 融合在 N 总站到 tagRFP 控制下的咽肌启动pmyo-2.
2. 在体内对与年龄的聚合的变化的评估对兴趣基因的抑制
   1. 提前一至两天, 准备羧 (Carb)/IPTG 板与控制 (空的 rna 干扰载体 L4440) 细菌和 rna 处理细菌抑制基因的兴趣。(有关线虫中的 rna 干扰的详细协议, 请参阅朱庇特科学教育数据库。生物学精要 1: 酵母,果蝇和C. 线虫在线虫中的 rna 干扰。朱庇特, 剑桥, MA: 10.3791/5105 (2017))。
   2. 对于从 L1 的 rna 干扰处理, 将产卵的蠕虫放在几个单独的小 NG/碳水化合物/IPTG (6 厘米直径) 的板上, 并在20° c 的情况下, 用控制 rna 或抗干扰细菌为基因进行播种。2小时后取出成虫, 将子代保持在20° c。为避免发育缺陷, 可在 L4 幼虫期后启动 rna 干扰治疗。
   3. 一旦后代到达 L4 幼虫阶段, 转移这些 L4s 到新的 NG/碳水化合物/IPTG 板种子与控制 rna 或 rna 干扰细菌的基因感兴趣。设置九板与15转基因每个条件和保持他们在20° c。老化的蠕虫需要从他们的后代转移到新的盘子, 直到他们的生育期结束, 以便能够区分他们的后代。
   4. 每隔一天, 在成人的荧光立体显微镜下, 在24x 倍放大倍数的情况下, 对带有荧光标签的聚合易感蛋白的分布变化进行评估。
      注意: 在明亮的点中, 聚集易感蛋白的年龄依赖性积累被用作聚集的出。这些点应该是高度不动的结构被描绘作为聚集体。这应该是由荧光恢复后漂白 (FRAP) 使用共聚焦显微镜。对于聚合蛋白, 在至少4分钟⁵¹⁸之后, 漂白区域中不应观察到恢复。为了量化的变化与年龄, 我们在年龄同步蠕虫表达 PAB-1 的分布模式在2天, 5 天, 和7天的成年如下: 低聚集水平 (0-10 tagRFP::P AB-1 点后咽球),中度聚集水平 (咽后部10点以上), 聚集水平高 (咽前球囊内有10点以上)。

Results

我们使用这里提出的方法来评估如何长寿命的动物与减少的 IIS 调节年龄依赖性蛋白质聚集。由西部污点 (参见步骤 2.2, 快速不溶蛋白提取为西部污点分析), 我们分析了总和不溶蛋白内容的年轻人 (3 天成人) 和年龄 (18 天成人) 蠕虫在控制 rna 干扰和以 rna 干扰为目标胰岛素IGF-1-like 受体daf-2。我们观察到, 在总蛋白水平上, 年龄或控制与daf-2 rna 干扰条件 (图 2A) 之间没有大的变化。正如预期的那样, 我们检测到控制动物中高度不溶性蛋白水平的强年龄相关增加 (图 2B)。在比较长寿的动物在daf-2 rna 干扰, 聚集倾向大大减少。不溶性提取物的全蛋白染色显示, 与年龄匹配的控件相比, 在daf-2 rna 干扰中, 18 天老蠕虫提取物中的蛋白质带模式较不复杂。定量质...

Discussion

在这里, 我们报告了一种方法, 以隔离高不溶性蛋白聚合体的老化线虫受 rna 干扰分析的质谱法和西方印迹。我们表明通过减少 IIS 来改善 proteostasis 可以大大防止年龄依赖性的蛋白质聚集。通过在线虫中选择特定的聚集易过度蛋白, 可以进一步解剖调节固有蛋白质聚集的机制。

固有年龄依赖性蛋白质聚集与疾病相关蛋白聚集
目前的工作是根据先前的发现, 蛋白质聚集不限于特定的蛋白质聚合在疾病的背景。通过聚焦于内源性聚集易感蛋白而非 ectopically 表达的疾病相关蛋白, 期望能为聚集过程的生理调节提供新的洞察力。由于在不同的细胞位置⁵中发现了与年龄相关的蛋白质聚合体, 因此它们的研究也应该提供对隔室特定质量控制机制的洞察。总的来说, 控制固有蛋白质聚集的机制也可能与预防疾病蛋白聚集有关。值得注意的是, 虽然年龄依赖性蛋白质聚集类似于几个方面的疾病蛋白聚集, 但仍然不清楚这些聚合体是否含有淀粉样纤维, 这是许多疾病聚集的特征。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fernbach 培养瓶	康宁	4425-2XL	Pyrex，容量 2,800 ml，带 3 个挡板凹痕膜
螺帽	Schott	1088655	GL45
章动混合器	VWR	444-0148
分液漏斗	Nalgene	4300-1000	容量 1,000 ml
1 ml 注射器	BD Plastipak	300013
灰色针头，27 G x ½"，0.4 mm x 13 mm	BD Microlance 3	300635
膜过滤器 0.025 µM	Millipore	VSWP04700
pH 试纸	Machery-Nagel	92110	pH-fix 0-14
蛋白酶抑制剂混合物	Roche	4693132001	完全迷你无 EDTA 片剂
辛氧醇醚-9	Applichem	A1388	Triton X-100
4-吗啉乙磺酸 （MES）	Sigma-Aldrich	M1317
壬基苯基聚乙烯二醇	Applichem	A1694	Nonidet P40 （NP40）
DNaseI	Roche	04716728001	重组，不含 RNase
RNaseA	Promega	A7973	溶液
总蛋白印迹染色	Thermofisher	S11791	Sypro Ruby 蛋白质印迹染色
总蛋白凝胶染色	Thermofisher	S12001	Sypro Ruby 蛋白质凝胶染色
TCEP（三（2-羧乙基）盐酸膦）	Serva	36970
碘乙酰胺	Serva	26710
碳酸氢铵	Sigma-Aldrich	09830
测序级改良胰蛋白酶	Promega	V5111
用于相对和绝对定量的同量异位标签	Sciex	4352135	iTRAQ 试剂 多重试剂盒
离心机 Avanti J-26XP	Beckmann Coulter	393126
超速离心机 Optima Max-XP	Beckmann Coulter	393315
离心机 5424R	Eppendorf
Centrifuge 5702	Eppendorf	5702000329
Centrifuge Megafuge 40R	Thermo Scientific	75004518
浓缩仪 Plus	Eppendorf	5305000304	离心蒸发仪
荧光体视显微镜 M165 FC	配备 Planapo 2.0 倍物镜	徕卡
显微镜	徕卡		Leica S6E
高倍率显微镜 蔡司 Axio Observer Z1	司		带 PlanAPOCHROMAT 20 倍物镜和蔡司 Axio Cam MRm
Software
Image 分析软件	ImageJ
质谱数据分析	蛋白质勘探仪		http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm
大肠杆菌菌株
OP50	CGC
RNAi 细菌
L4440	Julie Ahringer RNAi 文库
秀丽隐杆线虫 突变体
CF2253	CGC，品系名称：EJ1158		基因型： gon-2（q388）
秀丽隐杆线虫转基因
DCD214	Della David 在 DZNE Tü 的实验室;bingen		基因型： N2;uqIs24[Pmyo-2：：tagrfp：:p ab-1]
DCD215	Della David 在 DZNE Tü 的实验室;bingen		基因型： daf-2（e1370） III;uqIs24[Pmyo-2：：tagrfp：:p ab-1]