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方法文章

通过同重标记、深度液相色谱、质谱分析及软件辅助定量进行深度蛋白质组分析

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DOI：

10.3791/56474

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2017年11月15日

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1St. Jude Proteomics Facility, St. Jude Children's Research Hospital, 2Departments of Structural Biology and Developmental Neurobiology, St. Jude Children's Research Hospital, 3Heilongjiang University of Chinese Medicine

本文内容

摘要

我们介绍一种结合液相色谱与高分辨质谱技术，利用同重标记、深度分级分离、生物信息学工具以及质量控制步骤，精确量化蛋白质的实验方案。

摘要

基于质谱（MS）的蛋白质组学已取得诸多卓越进展，尤其在液相色谱（LC）与串联质谱（LC-MS/MS）联用技术以及同重标记多重检测能力方面取得了显著技术突破。本文介绍一种深度蛋白质组学分析方案，该方案结合了10重串联质谱标签（TMT）标记、高通量的LC/LC-MS/MS平台以及质谱后计算干扰校正方法，以实现对全蛋白质组的精确定量。本方案包含以下主要步骤：蛋白质提取与消化、TMT标记、二维（2D）液相色谱分离、高分辨率质谱分析以及计算数据处理。方案中还设置了质量控制步骤，用于故障排查和评估实验变异。利用该方案可对哺乳动物样本中超过10,000种蛋白质进行可靠定量。通过少量修改，该方案亦可用于翻译后修饰的定量分析。这种多重化、稳健的方法为多种复杂样本（包括细胞培养物、动物组织和人类临床标本）的蛋白质组学分析提供了强有力的工具。

引言

下一代测序技术的进步为研究生物系统和人类疾病带来了全新的格局。这使得对基因组、转录组、蛋白质组、代谢组及其他分子系统的大量测量成为可能。质谱法（MS）是分析化学中最敏感的方法之一，自人类基因组测序完成以来，其在蛋白质组学中的应用迅速扩展。在蛋白质组学领域，近年来基于质谱的定量分析技术取得了重大进展，包括等重标记和多重检测能力与深度液相色谱技术的结合，以及仪器设备的进步，使得检测速度更快、准确性更高，且所需样品量更少。定量蛋白质组学已成为主流方法，可用于在高度复杂的生物样本中分析数以万计的蛋白质及其翻译后修饰1,2,3,4,5,6。

多重等重标记方法，例如用于相对和绝对定量的等重标签（i.e.，iTRAQ）和串联质谱标签（TMT）质谱技术，已显著提高了样品通量，并增加了单次实验中可分析的样品数量1,6,7,8。与其他基于质谱的定量方法（如无标记定量和细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记（i.e.，SILAC））相结合，这些技术在蛋白质组学领域具有巨大潜力9,10,11。例如，TMT方法利用10重试剂，可在一次实验中同时分析10个蛋白质样品。这些结构相同的TMT标签具有相同的总质量，但重同位素在碳或氮原子上的分布不同，导致每个标签在MS/MS碎裂过程中产生独特的报告离子，从而实现10个样品间的相对定量。TMT策略已被常规应用于研究生物通路、疾病进展和细胞过程12,13,14。

在不牺牲定量准确性的前提下，液相色谱（LC）–串联质谱（MS/MS）系统在液相色谱分离和质谱参数方面均取得了显著的技术进步，从而最大限度地提高了蛋白质鉴定能力。在此类鸟枪法蛋白质组学方法中，肽段的第一维分离需采用与第二维具有高度正交性的分离技术，这对于实现最佳分析结果至关重要20。高pH反相液相色谱（RPLC）的性能优于传统的强阳离子交换色谱20。当高pH RPLC与第二维的低pH RPLC联用时，分析动态范围和蛋白质覆盖率均得到提升，从而在进行全蛋白质组分析时能够鉴定出绝大多数表达的蛋白质15,16,17,18。其他技术进步包括使用小粒径C18填料（1.9 µm）和超长色谱柱（约1 m）19。此外，其他显著改进还包括具有更快扫描速度、更高灵敏度和分辨率的新一代质谱仪20，以及用于质谱数据挖掘的先进生物信息学分析流程21。

本文介绍了一种详细的实验方案，结合了最新的方法并进行了改进，以提高检测的灵敏度和通量，同时在整个实验过程中注重质量控制。该方案包括蛋白质提取与消化、TMT 10-plex 标记、碱性 pH 和酸性 pH 条件下的反相液相色谱（RPLC）分级分离、高分辨率质谱检测以及质谱数据处理（图1）。此外，我们引入了多个质量控制步骤，用于故障排查和评估实验变异。本详细方案旨在帮助刚进入该领域的研究人员常规性地从裂解物或组织中鉴定并准确量化数千种蛋白质。

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方案

警告：请查阅所有相关的安全数据表（SDS）即，使用前请查阅材料安全数据表（MSDS）。执行本方案时，请遵循所有适当的安全操作规范。

注意：本实验方案使用 TMT 10-plex 同重同位素标记试剂盒对 10 个样本进行蛋白质组定量。

1. 细胞/组织的制备

注意：必须在低温条件下尽快采集样品，以保持蛋白质处于其原始生物学状态。

  1. 洗涤贴壁细胞（例如，用10 mL冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS）在10 cm培养皿上洗涤HEK 293细胞两次。刮取并收集细胞（约2 x 106 在1 mL PBS中重悬细胞，转移至1.5 mL离心管中，于4 °C、600 × g离心5 min后弃去PBS。将细胞沉淀于-80 °C保存，直至裂解。
    注意：通常进行预实验以检测蛋白质得率。从10 × 106 哺乳动物细胞或来自一个汇合度为80%的15 cm培养皿。
  2. 或者，在洗涤后直接将裂解缓冲液加入培养板中，裂解贴壁细胞。收集裂解液至1.5 mL离心管中，并按照步骤2.5中的方案说明进行后续操作。
  3. 将悬浮细胞收集于15 mL离心管中，用10 mL预冷的PBS洗涤两次，转移至1.5 mL离心管中，以600 × g离心去除PBS。彻底清除洗涤步骤中的PBS，以维持裂解缓冲液组分的所需浓度。将细胞沉淀于-80 °C保存，直至裂解。
  4. 迅速收集并称量组织，解剖后立即将组织置于液氮中，并于 -80 °C 保存。
    注意：组织的蛋白得率约为组织重量的5%至10%
  5. 使用大小均一的组织样本和相同的解剖区域，共10个样本，以减少样本间的异质性。用1 mL预冷的PBS冲洗样本两次，去除血液污染，避免高丰度的血液蛋白影响蛋白质定量及后续数据分析。

2. 蛋白质提取、质量控制、Western印迹、溶液内消化及肽段脱盐

注意：在TMT标记样本混合前的任何步骤中，必须以相同方式处理全部10个样本，以减少变异。

  1. 在实验当天配制裂解缓冲液（50 mM HEPES [pH 8.5]、8 M 尿素和 0.5% 脱氧胆酸钠）。
    注意：样品裂解过程中的部分蛋白质变性会影响蛋白质消化效率。
  2. 加入裂解缓冲液，使缓冲液与样品体积比为 10:1，并加入约最终体积 20% 的玻璃珠（直径 0.5 mm）至细胞沉淀或组织中（例如，缓冲液与样品的体积比为 10:1），以获得 5 至 10 mg/mL 的最终蛋白质浓度。根据各样品所用细胞数量或组织重量，确保所有 10 个样品的浓度一致。
  3. 通过向样品中添加固体尿素维持 8 M 的尿素浓度。计算需添加的固体尿素量时，务必考虑细胞沉淀或组织所占体积。
    注意：不新鲜的尿素缓冲液可能引入人工化学修饰（即，蛋白质氨基甲酰化），并对鉴定出的肽段数量产生负面影响。尿素占据相当体积（100 mg 尿素在溶液中约占 ~73 µL）。
  4. 保留裂解液中的不溶性残渣，以便对不溶性蛋白质进行消化23。
  5. 在 4 °C 下使用搅拌器以速度 8 裂解样品 30 秒，暂停 5 秒，重复 5 次，或直至样品完全均质化。也可在室温（RT）下涡旋裂解 30 秒，随后在冰上冷却 30 秒，重复约 10 个循环。根据样品类型，必要时调整裂解条件。
  6. 充分混匀裂解液，避免离心，分装成两小份（每份约 15 µL）。取一份用于测定蛋白质浓度，另一份通过 Western 印迹分析进行阳性对照验证。剩余的大份样品用于蛋白质组学分析。
  7. 采用标准蛋白质定量方法，或使用含牛血清白蛋白（BSA）作为标准品的考马斯亮蓝染色短胶（10% 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶）测定蛋白质浓度22。使用已知浓度高度准确的 BSA 标准品。为达到最高准确性，可对 BSA 标准品进行氨基酸分析。
    注意：可能存在其他准确的标准品。蛋白质浓度也可通过细胞数量或组织重量估算。尽管推荐使用 1 mg 蛋白质（每样品 100 µg），但分析可在低至 100 µg 蛋白质（每样品 10 µg）的条件下进行。
  8. 加入 100% 乙腈（ACN）使终浓度为 10% ACN，并按酶与底物质量比 1:100（w/w）加入 LysC 蛋白酶，在高度变性条件下于室温消化 2 h1。加入二硫苏糖醇（DTT）至终浓度 1 mM，以还原蛋白质中的二硫键，孵育 1 h。在终浓度为 7.2 M 尿素的条件下进行 LysC 消化。
  9. 用 50 mM HEPES（pH 8.5）将样品稀释至 2 M 尿素，并在室温下以胰蛋白酶与蛋白质质量比 1:50（w/w）进一步消化 3 h 或过夜。每 100 µg 蛋白质使用约 2 µg 胰蛋白酶，胰蛋白酶浓度约为 10 ng/µL。
    注意：可能导致胰蛋白酶消化效率低下的因素包括 pH 问题、胰蛋白酶失活或酶与底物比例不当。
  10. 加入 DTT 至终浓度 1 mM，并在室温下进一步还原肽段 2 h。
  11. 加入碘乙酰胺（IAA）至终浓度 10 mM，在避光条件下室温孵育 30 min，以烷基化含半胱氨酸的肽段。
  12. 通过加入 DTT 至终浓度 30 mM 淬灭未反应的 IAA，并在室温下孵育 30 min。
  13. 通过检测每份样品的小量等分试样，检查胰蛋白酶消化效率。按照制造商说明书，使用死体积中嵌入色谱介质的 10 µL 移液枪头进行脱盐处理。通过 LC-MS/MS 分析各样品。LC-MS/MS 参数与步骤 5 相同，但梯度时间为 10 min23。
  14. 使用 4 次漏切作为搜索参数对 MS 原始数据进行数据库搜索（详见步骤 6）。
    注意：若漏切次数 >10%，可能表明胰蛋白酶消化不完全，这将对下游结果产生负面影响。此为关键的质量控制（QC）步骤。
  15. 若漏切率 >10%，则向样品中额外添加 10 µL 胰蛋白酶，再次进行消化。
  16. 加入三氟乙酸（TFA）使终浓度为 1%，用 pH 试纸测定 pH 值，确认 pH 在 2 至 3 之间。根据需要逐滴（1 µL）添加更多 TFA，直至达到正确 pH 值。
  17. 在室温下以 20,000 x g 离心 10 min，收集上清液。
  18. 若使用 100 µg 样品，用 0.25 mL 甲醇洗涤容量为 0.5 至 60 µg 的含 C18 反相树脂的离心柱；若使用 10 µg 样品，用 0.25 mL 60% ACN/0.1% TFA 洗涤容量为 0.03 至 30 µg 的离心柱。将离心柱在 500 x g 下离心 30 s。
  19. 用 0.5 mL 0.1% TFA 平衡柱子，并在 500 x g 下离心 30 s 去除。
  20. 将样品上样至柱子，并在 100 x g 下离心 3 min 或直至所有样品完全通过柱子，使样品结合到柱子上。
  21. 向柱子中加入 0.5 mL 0.1% TFA，并在 500 x g 下离心 30 s。
  22. 向每个柱子中加入 125 µL 60% ACN/0.1% TFA，并在 100 x g 下离心 3 min 进行洗脱。确保所有溶液均已通过柱子。
  23. 在真空浓缩仪中干燥洗脱液。确保样品完全干燥，管中无残留液体。储存于 -80 °C，待后续分析使用。

3. 肽段的 TMT 标记

注意：必须确保所有样品均被 TMT 试剂完全标记。多个因素（例如，所用 TMT 试剂的量、pH 值以及蛋白质定量的准确性）会影响 TMT 标记效率，进而对所有下游结果产生负面影响。

  1. 将每种脱盐后的肽样品重悬于 50 µL 的 50 mM HEPES 缓冲液（pH 8.5）中。检测 pH 值，确保其在 7 至 8 之间。
    注意：若脱盐步骤后样品未完全干燥，可能导致样品呈酸性，从而影响标记效率。
  2. 保留每种未标记样品约 1 µg，用于后续的 TMT 标记效率检测，具体操作见步骤 3.3。
  3. 将 TMT 试剂溶解于无水乙腈（ACN）中，并按照制造商说明书对肽样品进行标记。在室温下孵育 1 小时。
  4. 通过脱盐约 1 µg 的每种 TMT 标记和未标记样品进行 TMT 标记效率质控检测，使用嵌入色谱介质的 10 µL 吸头，按照制造商方案操作。通过 LC-MS/MS 分析 TMT 标记和未标记样品。
    注意：LC-MS/MS 参数与第 5 节相同，但梯度时间为 10 分钟。
  5. 检查原始数据，确保在标记样品中未检测到未标记肽，以确认标记完全（图 2）。对 6 至 10 个不同肽段进行此分析，以验证标记效率。
  6. 加入 4 µL 的 5% 羟胺以终止反应，并孵育 15 分钟。
  7. 取每种 TMT 标记样品少量且等体积（2 µL）混合。使用嵌入色谱介质的 10 µL 吸头进行脱盐。按照步骤 3.4 所述方法通过 LC-MS/MS 分析样品。使用 JUMP 软件程序（一种开源数据库搜索算法，可将串联质谱原始文件转换为肽段和蛋白质列表），根据所有鉴定肽段的 TMT 标签强度，确定全部 10 个样品的相对浓度比。
    注意：该预混比例质控检测有助于在最终合并前确定正确的等量混合比例，因为移液误差可能导致浓度变化，而蛋白质定量步骤并不总是准确。这也是确保最终混合所用的 10 个样品均处于相同比例的最佳方法，具体见步骤 3.5。
  8. 根据需要重复多次，直至实现所有 10 个样品间 1:1 的比例。
  9. 根据预混比例检测结果，等比例混合 10 个样品。以浓度最低的样品为基准，调整其余 9 个样品的体积。
  10. 通过脱盐去除合并后的 TMT 标记样品中淬灭反应产生的副产物。
  11. 若使用 100 µg 样品，用 1 mL/0.25 mL 甲醇洗涤含 50 mg 吸附剂的 1 mL 固相萃取柱；若使用 10 µg 样品，用 1 mL/0.25 mL 的 60% ACN/0.1% TFA 洗涤 0.5 至 60 µg 容量的 C18 离心柱。在 500 × g 下离心 30 秒。
  12. 用 0.5 mL 的 0.1% TFA 平衡色谱柱，并在 500 × g 下离心 30 秒去除。
  13. 将样品加载至色谱柱，并在 100 × g 下离心 3 分钟，或直至所有样品完全通过色谱柱。
  14. 向色谱柱中加入 0.5 mL 的 0.1% TFA，并在 500 × g 下离心 30 秒。
  15. 向每个色谱柱中加入 125 µL 的 60% ACN/0.1% TFA，并在 100 × g 下离心 3 分钟进行洗脱。确保所有溶液均已通过色谱柱。
  16. 在真空浓缩仪中干燥洗脱液。确保样品完全干燥，管中无残留液体。储存于 -80 °C，待后续分析使用。

4. 广泛的高分辨率碱性 pH 液相色谱预分级

  1. 安装两根串联的C18色谱柱，内含桥联亚乙基杂化颗粒（4.6 mm × 25 cm，总长50 cm；粒径3.5 µm），并使用微升流速的高效液相色谱泵进行分级分离。
    注意：使用两根色谱柱可增加肽段载样量，但不一定改善色谱分离效果。对于含肽量 ≤200 µg 的样品，使用一根色谱柱即可。
  2. 用甲醇、水和缓冲液A（10 mM 甲酸铵，pH 8.0）各300 µL依次冲洗100 µL的进样环。
  3. 用等体积混合的异丙醇、甲醇、乙腈（ACN）和水共100 µL冲洗色谱柱，并用95%缓冲液A平衡色谱柱2小时。
  4. 将脱盐后合并的TMT标记肽段样品溶解于65 µL缓冲液A中。确认样品pH约为8.0。若仍呈酸性，可用氢氧化铵调节pH至8.0。
  5. 采用以下梯度程序进行样品分级（缓冲液B为缓冲液A中添加90%乙腈）：15%至20% B相持续15分钟，20%至35% B相持续100分钟，35%至50% B相持续30分钟。设置馏分收集器每2分钟收集一次馏分（包括上样时间）。流速设定为0.4 mL/min。代表性色谱图参见参考文献29及图1。
  6. 共收集80个馏分，并使用真空浓缩仪将其中40个馏分（每隔一个馏分收集一次）完全干燥。
  7. 将40个干燥样品用于LC-MS/MS分析。
  8. 对全部80个馏分进行LC-MS/MS分析，以实现超深度蛋白质组覆盖。

5. LC-MS/MS 样品制备与参数设置

注意：在基于 TMT 的定量分析中，肽离子具有同量异序性质，在 MS1 扫描中表现为单一质量峰。然而，它们的定量是根据肽离子经高能碰撞解离（HCD）碎裂后，在 MS/MS 扫描中产生的报告离子（10 种独特的报告离子）的强度来进行的。TMT 报告离子的比值可能因标记离子的共洗脱而受到抑制24。缩小离子隔离窗口25、气相纯化26、MultiNotch MS3 方法27 或采用多维液相色谱结合长梯度（4–8 小时）进行广泛分级28 是可选的替代策略。

  1. 使用1.9 µm的C18填料填充内径为75 µm的空柱，柱床长度为30至40 cm（约1.3 µL柱床体积）。
  2. 使用蝶形加热器在65 °C下加热色谱柱，以降低反压并防止超高效液相色谱（UPLC）系统压力过高。将色谱柱在蝶形加热器内盘绕2至3圈，确保整个柱床长度均被加热。将色谱柱用胶带固定在加热器内部，注意不要遮盖加热器内部的温度传感器。
    注意：蝶形加热器已安装并用胶带固定在连接至仪器XYZ阶段的定制有机玻璃部件上。
  3. 配制缓冲液A（3%二甲基亚砜和0.2%甲酸）和缓冲液B（缓冲液A加67%乙腈），并用95%缓冲液B彻底清洗色谱柱。然后，用95%缓冲液A充分平衡色谱柱（至少3个柱体积）。流速约为0.25 µL/min，反压为280至320 bar。
  4. 在分析TMT标记样品之前，重复两次进样100 ng大鼠脑肽段（或选用的其他标准品），以评估LC-MS/MS系统的性能。需频繁检查以下参数以确保高质量的数据采集：一级质谱信号强度（基峰强度在e8至e9之间）、MS/MS谱图质量（应包含丰富的y离子和b离子）、峰宽（12–22 s）、整体保留时间、液相系统压力（压力上升>50 bar提示柱子污染或喷针堵塞）以及运行间重复性（相同峰在不同运行间的保留时间差异应<30 s）。
    注意：为分辨10-plex TMT试剂中近似同量异位的报告离子（质量差6.32 mDa），MS/MS分辨率必须设置为在400 m/z时至少30,000。通常使用HCD进行TMT10-plex报告离子的碎裂，因其不受离子阱仪器中碰撞诱导解离（CID）所遵循的“三分之一规则”限制。
  5. 定期清洁和校准质谱仪，并使用新鲜的液相缓冲液以提高系统性能。
  6. 用5%三氟乙酸（TFA）重新溶解在碱性pH分离后干燥的肽段。
  7. 在5%缓冲液A流动条件下，上样约0.2 µg肽段至色谱柱。
  8. 在150分钟内使用15%至45%的缓冲液B进行洗脱。初始梯度设置如下：0分钟时缓冲液B为5%；2分钟时为15%；135分钟时为45%；145分钟时为70%；150分钟时为95%。根据基峰色谱图分析结果，对早期和晚期碱性pH RPLC组分的梯度进行微调。
  9. 将质谱仪设置为数据依赖采集模式，一级扫描在离子阱质谱分析器中进行（扫描范围400–1600 m/z；分辨率60,000；自动增益控制（AGC）目标值1 × 106；最大离子时间50 ms；质心模式）。进行20次高分辨率MS/MS扫描（分辨率60,000，AGC目标值1 × 105，最大离子时间约100 ms，HCD归一化碰撞能量35，隔离窗口0.4 m/z，动态排除时间20 s）。
    注意：不推荐对TMT10-plex试剂使用电子转移解离（ETD），因为ETD的断裂位点与HCD不同，会导致报告离子信号重叠。此外，ETD的效率不如HCD，因为胰蛋白酶消化产生的肽段通常带+2电荷，而ETD在更高电荷态下效率更高。

6. 质谱数据分析

注意：我们以 JUMP 软件程序为例介绍数据分析。然而，数据分析也可使用其他商业或免费软件程序完成。

  1. 使用基于标签的混合搜索引擎 JUMP 处理质谱仪的原始文件21，该方法结合了基于图谱的数据库搜索和基于标签的搜索 从头合成 测序以提高灵敏度和特异性。
  2. 将原始数据转换为 mzXML 格式，并将 MS2 谱图与目标-诱饵 UniProt 人类数据库（或其他适当的物种特异性数据库）进行比对，以计算错误发现率（FDR）。
  3. 使用10 ppm的质量容差对前体离子和碎片离子进行搜索。设置其他搜索参数如下：完全胰蛋白酶酶解限制，最多允许2次漏切，每条肽段最多允许3个修饰位点，以及指定的 a, b，以及 y 设置固定修饰为赖氨酸残基和N端的TMT标签（+229.162 Da）以及半胱氨酸残基的羧氨甲基化（+57.021 Da）。设置可变修饰为甲硫氨酸氧化（+15.994 Da），这是由样品处理过程中常见的肽段人工产物所致。
  4. 按以下标准筛选数据：最少7个氨基酸的肽段长度， m/z 准确性例如，5 ppm）以及匹配得分（J 分数和 deltaCn）。根据肽段长度、胰蛋白酶特异性及电荷状态对肽段进行分组。
  5. 通过匹配得分进行额外层级的过滤，将蛋白质错误发现率（FDR）降低至1%以下。仅由单一谱图计数鉴定的蛋白质需要更高的匹配得分。
  6. 对于由蛋白质家族多个成员共有的肽段，将匹配的蛋白质成员聚类为一组。
    注意：根据简约性原则，该组由被指派肽段数量最多的蛋白质代表，其余蛋白质则由其特有肽段匹配确定1.
  7. 使用 JUMP 软件套件内置的程序，通过汇总所有匹配的肽谱匹配（PSM）中的报告离子计数来定量蛋白质。
  8. 针对每个被接受的 PSM，根据标记试剂的同位素分布和由全局 PSM 定量数据计算得到的上样偏差，提取并校正 TMT 报告离子强度。在定量过程中，使用用户自定义的阈值过滤掉强度低且噪声水平高的 PSM。
  9. 计算每个报告离子相对于10个报告离子平均值的相对信号。对已鉴定蛋白质的肽谱匹配（PSMs）的相对信号进行加和。通过将相应蛋白质中前3个PSMs的报告离子平均强度乘以该相对信号，将其转换为绝对信号。
  10. 使用一种在质谱后进行的计算方法来校正干扰。假设 y1 离子强度与报告离子强度成正比，从干净扫描中计算线性关系，并根据噪声扫描中受污染的 y1 离子强度推导干扰水平23.
    注意：对于TMT标记的胰蛋白酶肽段，K-TMT和R残基是两种类型 y1 离子（分别为 376.27574 Da 和 175.11895 Da）在 MS2 扫描中。如果仅有 1 个 y1 离子被检测到，并且与鉴定出的肽段一致，则该MS2被判定为干净扫描（图3A）。如果同时检测到两个 y1 离子，则判定该 MS2 为噪声扫描。
  11. 将蛋白质定量值导出至电子表格软件进行进一步分析。采用成对比较或方差分析来鉴定差异表达的蛋白质。

7. 质谱数据验证

注意：在进行耗时的生物学实验之前，应至少采用1种方法对质谱数据的质量进行评估验证。

  1. 手动检查目标蛋白质的 MS/MS 谱图，以验证肽段序列和 TMT 报告离子的定量结果。
  2. 利用已知的蛋白质定量数据确认质谱结果。
  3. 采用基于抗体的方法（例如，Western 印迹和免疫组织化学分析）验证蛋白质的变化。
  4. 化学合成目标肽段，并将其用作内标，以确认天然肽段的鉴定结果。
    注意：其在 LC-MS/MS 分析中的 MS/MS 图谱和保留时间应完全一致。
  5. 使用靶向质谱方法验证蛋白质的变化。

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结果

我们采用了一种先前报道过的跨物种肽段混合物，系统分析在3个主要实验步骤中比例压缩效应，包括质谱前的组分分离、质谱参数设置以及质谱后的校正23。质谱前的组分分离通过碱性pH RPLC与酸性pH RPLC联用进行评估与优化。在质谱后的分析中，仅考虑物种特异性的肽段。我们利用该干扰模型考察了LC/LC-MS/MS中的多个参数，包括MS2隔离窗口、在线LC分辨率、在线酸性pH RPLC的上样量以及离线高pH RPLC的分辨率（参见参考文献29中的图3）。

为了在离线液相色谱（LC）过程中调整分辨率，我们将等压标记的肽段分离成320个组分，然后将选定的组分合并，以调节分离能力。通过收集不同数量的组分子集（1、5、10、20、40、80和320）来测试离线LC的分辨率，同时监测干扰水平。我们发现干扰水平从16....

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讨论

我们描述了一种基于10重等重标记策略的高通量蛋白质定量方案，该方法已在多项研究中成功应用12,13,14,32。在此方案中，我们可在一次实验中同时分析多达10个不同的生物学蛋白质样本。通常可高置信度地鉴定并定量超过10,000种蛋白质。尽管等重标记技术是一种有效的蛋白质定量方法，但其定量准确性受限于比值压缩效应。本方案通过多种策略，如优化液相色谱/液相色谱（LC/LC）和串联质谱（MS/MS）参数，并结合基于y1离子的质谱后校正方法，有效消除了大部分干扰效应，从而显著提高了蛋白质定量的精确度。

在蛋白质定量中，JUMP 程序套件可通过多种方式实现。我们对每批购买的试剂均测量了同位素杂质，其值与供应商提供的证书中报告的数值略有差异。在 JUMP 软件中，使用实测的同位素杂质对报告离子的强度进行校正。一种蛋白质...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢实验室和设施的其他所有成员提供的有益讨论。本研究部分由NIH基金R01GM114260、R01AG047928、R01AG053987以及ALSAC资助。质谱分析在圣犹大儿童研究医院蛋白质组学设施完成，该设施部分由NIH癌症中心支持基金P30CA021765资助。作者感谢Nisha Badders在稿件编辑方面提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1220 LC 系统AgilentG4288B
50% 盐酸羟胺Thermo Scientific90115
乙腈Burdick & JacksonAH015-4
Bullet Blender 匀浆仪Next AdvanceBB24-AU
Butterfly Portfolio 加热器Phoenix S&TPST-BPH-20
C18 小柱Harvard Apparatus74-4607
二硫苏糖醇（DTT）SigmaD5545
二甲基亚砜（DMSO）Sigma41648
甲酸Sigma94318
馏分收集器GilsonFC203B
玻璃珠Next AdvanceGB05
HEPESSigmaH3375
碘乙酰胺（IAA）SigmaI6125
Lys-CWako125-05061
甲醇Burdick & JacksonAH230-4
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒Thermo Scientific23225
质谱仪Thermo ScientificQ Exactive HF
纳流 UPLCThermo ScientificUltimate 3000
ReproSil-Pur C18 树脂，1.9 μmDr. Maisch GmbHr119.aq.0003
自制填充柱New ObjectivePF360-75-15-N-5
脱氧胆酸钠Sigma30970
SpeedVac 真空浓缩仪Thermo ScientificSPD11V
TMT 10plex 同重同位素标记试剂Thermo Scientific90110
三氟乙酸（TFA）Applied Biosystems400003
胰蛋白酶PromegaV511C
尿素SigmaU5378
Xbridge C18 柱Waters186003943
Ziptips C18 小柱MilliporeZTC18S096
SepPak 1 cc 50 mg 小柱WatersWAT054960

参考文献

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