用等压标记、广泛的液相色谱法、质谱法和软件辅助定量技术进行深层蛋白质组分析

Anthony A. High; Haiyan Tan; Vishwajeeth R. Pagala; Mingming Niu; Ji-Hoon Cho; Xusheng Wang; Bing Bai; Junmin Peng

doi:10.3791/56474

Method Article

用等压标记、广泛的液相色谱法、质谱法和软件辅助定量技术进行深层蛋白质组分析

DOI:

10.3791/56474

⸱

November 15th, 2017

Anthony A. High¹ , Haiyan Tan¹ , Vishwajeeth R. Pagala¹ , Mingming Niu²^,³ , Ji-Hoon Cho¹ , Xusheng Wang¹ , Bing Bai² , Junmin Peng¹^,²

¹St. Jude Proteomics Facility, St. Jude Children's Research Hospital, ²Departments of Structural Biology and Developmental Neurobiology, St. Jude Children's Research Hospital, ³Heilongjiang University of Chinese Medicine

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们提出了一个协议, 以准确定量蛋白质与等压标签, 广泛的分馏, 生物信息学工具, 和质量控制步骤, 结合液相色谱与高分辨率质谱仪接口。

Abstract

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在质谱 (ms) 的蛋白质组学中, 有许多特殊的进展, 特别是在液相色谱 (lc) 与串联质谱 (lc-ms) 和等压标记复用能力的技术进展。在这里, 我们引入了一个 deep-proteomics 的分析协议, 结合10丛串联质量标签 (TMT) 标签与广泛的 lc/lc/ms 平台, 和后 MS 计算干扰校正, 以准确定量整个蛋白质。该协议包括以下主要步骤: 蛋白质提取和消化, TMT 标签, 2 维 (2D) LC, 高分辨率质谱, 和计算数据处理。质量控制步骤包括在故障排除和评估实验变化。在哺乳动物样本中, 有超过1万的蛋白质可以自信地定量这个协议。这一协议也可以应用于量化的后平移修改与小的变化。这种多路复用、健壮的方法为蛋白质组分析提供了强有力的工具, 包括细胞培养、动物组织和人体临床标本。

Introduction

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下一代测序技术的进步已经为研究生物系统和人类疾病带来了新的前景。这使得大量的基因组、转录、蛋白质、代谢和其他分子系统的测量变得有形。质谱 (MS) 是分析化学中最敏感的方法之一, 其在蛋白质组学中的应用在人类基因组测序之后迅速扩大。在蛋白质组学领域, 在过去的几年中取得了重大的技术进步 MS-based 定量分析, 包括等压标记和复用能力结合广泛的液相色谱法, 除了仪器仪表进展, 允许更快, 更准确的测量, 并要求较少的样品材料。定量蛋白质组学已经成为在高度复杂的生物样品中分析数以万计的蛋白质和后修饰的主流方法¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶。

多路等压标记方法, 如等压标签的相对和绝对定量 (即, iTRAQ) 和串联质量标签 (TMT) MS 大大提高了样本吞吐量, 并增加了样本数, 可以分析在一个单一的实验¹^,⁶^,

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Protocol

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警告: 请在使用前查阅所有相关的安全数据表 ( 即、MSDS)。执行此协议时, 请使用所有适当的安全做法.

注意: 在本协议中, 一个 TMT 10 丛等压标签试剂集用于10样本的蛋白质组定量.

1. 细胞/组织的制备

注意: 在低温下收集样品以保持蛋白质的原始状态是至关重要的.

在 10 cm 板上两次用10毫升冰冷磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 清洗附着细胞 (如、HEK 293 细胞)。在1毫升 PBS 中, 刮和收集细胞 (~ 2 x 10 ⁶ 细胞)。转移到1.5 毫升管和删除 PBS 后, 离心在 600 x g 为5分钟, 在4和 #176; c. 在-80 和 #176 处储存细胞颗粒, 直到溶解为止.
注: 通常进行试验研究蛋白质的产量。大约1毫克的蛋白质可以提取从 10 x 10 ⁶ 哺乳动物细胞或从15厘米板块与80% 汇合.
或者, 在其板上溶解附着的细胞, 在洗涤后直接加入裂解缓冲液。将裂解收集到1.5 毫升的管子中, 并在步骤2.5 中使用协议描述.
收集15毫升管中的悬浮细胞, 用10毫升的冰冷 pbs 冲洗两次, 将其转换为1.5 毫升管, 并在 600 ....

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Results

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我们使用先前描述的物种肽组合系统地分析了比压缩在3主要协议步骤中的影响, 包括前 ms 分馏、ms 设置和后 ms 校正²³。采用碱性 ph 色和酸性 ph 色结合的方法对预 MS 分馏进行了评价和优化。对于后质谱分析, 只考虑 species-specific 肽。我们使用此干涉模型检查 lc/lc-ms/毫秒中的多个参数, 包括 MS2 隔离窗口、在线 lc 分辨率、在线酸性 pH 色的加载量以及脱机 high-pH 色的分辨率 (参见图 3参考²⁹)。

为了改变在离线 LC 中的分辨率, 我们将等压标记的多肽分成320部分, 然后将选定的分数组合在一起来调整分离功率。通过使用大量收集的分数子集 (1、5、10、20、40、80和 320) 测试脱机 LC 分辨率, 同时监视干扰级别。我们发现,.......

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Discussion

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我们描述了一个高通量协议的蛋白质定量与10丛等压标记策略, 已经成功地实现了在几个出版物¹²^,¹³^,¹⁴^,³².在本协议中, 我们可以在1实验中分析多达10种不同的生物蛋白样本。我们可以定期识别和定量超过1万的蛋白质, 并有很高的信心。虽然等压标记是一种有效的定量蛋白质的技术, 但它受比率压缩的限制, 可能导致定量的不精确性。我们的协议使用各种策略, 如优化 lc/lc 和 ms/ms 设置, 结合 y₁ ion-based 后 ms 校正, 有效地消除了大多数干扰效果, 从而大大提高了蛋白质定量。

对于蛋白质的定量, 跳跃套件的程序功能在许多方面。我们测量了每批购买的试剂的同位素杂质, 这与供应商提供的证书中的报告值稍有不同。测量的同位素杂质用于修正跳跃软件中的报告离子强度。蛋白质通常是定量的许多 psm.......

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Disclosures

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作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

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作者感谢所有其他实验室和设施成员进行有益的讨论。这项工作得到了 R01GM114260、R01AG047928、R01AG053987 和 ALSAC 的部分支持。MS 分析是在 St. 裘德儿童的研究医院蛋白质组学, 部分支持的 NIH 癌症中心支持补助金 P30CA021765。作者感谢莎 Badders 对编辑手稿的帮助。

....

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Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number
1220 液相色谱系统	，Agilent	G4288B
50% 羟胺	，Thermo Scientific	90115
乙腈	，Burdick 和Jackson	AH015-4
子弹搅拌机	Next Advance	BB24-AU
Butterfly Portfolio 加热器	Phoenix S&T	PST-BPH-20
C18 提示	哈佛仪器	74-4607
二硫苏糖醇（DTT）	Sigma	D5545
DMSO	Sigma	41648
甲酸	Sigma	94318
馏分收集器	Gilson	FC203B
玻璃珠	Next Advance	GB05
HEPES	Sigma	H3375
碘乙酰胺（IAA）	Sigma	I6125
Lys-C	Wako	125-05061
甲醇	Burdick &Jackson	AH230-4
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒	Thermo Scientific	23225
质谱仪	Thermo Scientific	Q Exactive HF
纳流 UPLC	Thermo Scientific	Ultimate 3000
ReproSil-Pur C18 树脂，1.9 um	Dr. Maisch GmbH	r119.aq.0003
Self Pck 色谱柱	新物镜	PF360-75-15-N-5
脱氧胆酸盐钠	Sigma	30970
Speedva	Thermo Scientific	SPD11V
TMT 10plex 同量异位标记试剂	Thermo Scientific	90110
三氟乙酸（TFA）	Applied Biosystems	400003
蛋白酶	Promega	V511C
尿素	Sigma	U5378
Xbridge 色谱柱 C18 色谱柱	Waters	186003943
Ziptips C18	Millipore	ZTC18S096
SepPak 1cc 50mg	Waters	WAT054960

胰

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pagala, V. R., et al. Quantitative protein analysis by mass spectrometry. Methods Mol Biol. 1278, 281-305 (2015).
Altelaar, A. F., Munoz, J., Heck, A. J. Next-generation proteomics: towards an integrative view of proteome dynamics. Nat Rev Genet. 14

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用等压标记、广泛的液相色谱法、质谱法和软件辅助定量技术进行深层蛋白质组分析

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