我们介绍一种结合液相色谱与高分辨质谱技术，利用同重标记、深度分级分离、生物信息学工具以及质量控制步骤，精确量化蛋白质的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
基于质谱（MS）的蛋白质组学已取得诸多卓越进展，尤其在液相色谱（LC）与串联质谱（LC-MS/MS）联用技术以及同重标记多重检测能力方面取得了显著技术突破。本文介绍一种深度蛋白质组学分析方案，该方案结合了10重串联质谱标签（TMT）标记、高通量的LC/LC-MS/MS平台以及质谱后计算干扰校正方法，以实现对全蛋白质组的精确定量。本方案包含以下主要步骤：蛋白质提取与消化、TMT标记、二维（2D）液相色谱分离、高分辨率质谱分析以及计算数据处理。方案中还设置了质量控制步骤，用于故障排查和评估实验变异。利用该方案可对哺乳动物样本中超过10,000种蛋白质进行可靠定量。通过少量修改，该方案亦可用于翻译后修饰的定量分析。这种多重化、稳健的方法为多种复杂样本（包括细胞培养物、动物组织和人类临床标本）的蛋白质组学分析提供了强有力的工具。
引言
下一代测序技术的进步为研究生物系统和人类疾病带来了全新的格局。这使得对基因组、转录组、蛋白质组、代谢组及其他分子系统的大量测量成为可能。质谱法（MS）是分析化学中最敏感的方法之一，自人类基因组测序完成以来，其在蛋白质组学中的应用迅速扩展。在蛋白质组学领域，近年来基于质谱的定量分析技术取得了重大进展，包括等重标记和多重检测能力与深度液相色谱技术的结合，以及仪器设备的进步，使得检测速度更快、准确性更高，且所需样品量更少。定量蛋白质组学已成为主流方法，可用于在高度复杂的生物样本中分析数以万计的蛋白质及其翻译后修饰1,2,3,4,5,6。
多重等重标记方法，例如用于相对和绝对定量的等重标签（i.e.，iTRAQ）和串联质谱标签（TMT）质谱技术，已显著提高了样品通量，并增加了单次实验中可分析的样品数量1,6,
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方案
警告：请查阅所有相关的安全数据表（SDS）即，使用前请查阅材料安全数据表（MSDS）。执行本方案时，请遵循所有适当的安全操作规范。
注意：本实验方案使用 TMT 10-plex 同重同位素标记试剂盒对 10 个样本进行蛋白质组定量。
1. 细胞/组织的制备
注意：必须在低温条件下尽快采集样品，以保持蛋白质处于其原始生物学状态。
- 洗涤贴壁细胞（例如，用10 mL冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS）在10 cm培养皿上洗涤HEK 293细胞两次。刮取并收集细胞（约2 x 106 在1 mL PBS中重悬细胞，转移至1.5 mL离心管中，于4 °C、600 × g离心5 min后弃去PBS。将细胞沉淀于-80 °C保存，直至裂解。
注意：通常进行预实验以检测蛋白质得率。从10 × 106 哺乳动物细胞或来自一个汇合度为80%的15 cm培养皿。 - 或者，在洗涤后直接将裂解缓冲液加入培养板中，裂解贴壁细胞。收集裂解液至1.5 mL离心管中，并按照步骤2.5中的方案说明进行后续操作。
- 将悬浮细胞收集于15 mL离心管中，用10 mL预冷的PBS洗涤两次，转移至1.5 mL离心管中，以600 × g离心去除PBS。彻底清除洗涤步骤中....
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结果
我们采用了一种先前报道过的跨物种肽段混合物，系统分析在3个主要实验步骤中比例压缩效应，包括质谱前的组分分离、质谱参数设置以及质谱后的校正23。质谱前的组分分离通过碱性pH RPLC与酸性pH RPLC联用进行评估与优化。在质谱后的分析中，仅考虑物种特异性的肽段。我们利用该干扰模型考察了LC/LC-MS/MS中的多个参数，包括MS2隔离窗口、在线LC分辨率、在线酸性pH RPLC的上样量以及离线高pH RPLC的分辨率（参见参考文献29中的图3）。
为了在离线液相色谱（LC）过程中调整分辨率，我们将等压标记的肽段分离成320个组分，然后将选定的组分合并，以调节分离能力。通过收集不同数量的组分子集（1、5、10、20、40、80和320）来测试离线LC的分辨率，同时监测干扰水平。我们发现干扰水平从16........
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讨论
我们描述了一种基于10重等重标记策略的高通量蛋白质定量方案，该方法已在多项研究中成功应用12,13,14,32。在此方案中，我们可在一次实验中同时分析多达10个不同的生物学蛋白质样本。通常可高置信度地鉴定并定量超过10,000种蛋白质。尽管等重标记技术是一种有效的蛋白质定量方法，但其定量准确性受限于比值压缩效应。本方案通过多种策略，如优化液相色谱/液相色谱（LC/LC）和串联质谱（MS/MS）参数，并结合基于y1离子的质谱后校正方法，有效消除了大部分干扰效应，从而显著提高了蛋白质定量的精确度。
在蛋白质定量中，JUMP 程序套件可通过多种方式实现。我们对每批购买的试剂均测量了同位素杂质，其值与供应商提供的证书中报告的数值略有差异。在 JUMP 软件中，使用实测的同位素杂质对报告离子的强度进行校正。一种蛋白质.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢实验室和设施的其他所有成员提供的有益讨论。本研究部分由NIH基金R01GM114260、R01AG047928、R01AG053987以及ALSAC资助。质谱分析在圣犹大儿童研究医院蛋白质组学设施完成，该设施部分由NIH癌症中心支持基金P30CA021765资助。作者感谢Nisha Badders在稿件编辑方面提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1220 LC 系统 | Agilent | G4288B | |
| 50% 盐酸羟胺 | Thermo Scientific | 90115 | |
| 乙腈 | Burdick & Jackson | AH015-4 | |
| Bullet Blender 匀浆仪 | Next Advance | BB24-AU | |
| Butterfly Portfolio 加热器 | Phoenix S&T | PST-BPH-20 | |
| C18 小柱 | Harvard Apparatus | 74-4607 | |
| 二硫苏糖醇（DTT） | Sigma | D5545 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma | 41648 | |
| 甲酸 | Sigma | 94318 | |
| 馏分收集器 | Gilson | FC203B | |
| 玻璃珠 | Next Advance | GB05 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| 碘乙酰胺（IAA） | Sigma | I6125 | |
| Lys-C | Wako | 125-05061 | |
| 甲醇 | Burdick & Jackson | AH230-4 | |
| Pierce BCA 蛋白检测试剂盒 | Thermo Scientific | 23225 | |
| 质谱仪 | Thermo Scientific | Q Exactive HF | |
| 纳流 UPLC | Thermo Scientific | Ultimate 3000 | |
| ReproSil-Pur C18 树脂，1.9 μm | Dr. Maisch GmbH | r119.aq.0003 | |
| 自制填充柱 | New Objective | PF360-75-15-N-5 | |
| 脱氧胆酸钠 | Sigma | 30970 | |
| SpeedVac 真空浓缩仪 | Thermo Scientific | SPD11V | |
| TMT 10plex 同重同位素标记试剂 | Thermo Scientific | 90110 | |
| 三氟乙酸（TFA） | Applied Biosystems | 400003 | |
| 胰蛋白酶 | Promega | V511C | |
| 尿素 | Sigma | U5378 | |
| Xbridge C18 柱 | Waters | 186003943 | |
| Ziptips C18 小柱 | Millipore | ZTC18S096 | |
| SepPak 1 cc 50 mg 小柱 | Waters | WAT054960 |
参考文献
- Pagala, V. R., et al. Quantitative protein analysis by mass spectrometry. Methods Mol Biol. 1278, 281-305 (2015).
- Altelaar, A. F., Munoz, J., Heck, A. J. Next-generation proteomics: towards an integrative view of proteome dynamics. Nat Rev Genet. 14
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重印与许可
