本文介绍了一种在小鼠中建立寨卡病毒诱导的小头畸形模型的方法。该方案包括在胚胎期、新生期和成年期对小鼠进行脑内接种寨卡病毒的技术。
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方法文章
建立寨卡病毒诱导的神经系统疾病小鼠模型：采用脑内注射策略的胚胎期、新生期及成年期研究 胚胎期、新生期、成年期、脑内注射、寨卡病毒、神经系统疾病、小鼠模型
本文内容
摘要
摘要
寨卡病毒（ZIKV）是一种黄病毒，目前在北美、中美和南美洲呈地方性流行。现已明确，ZIKV 可导致小头畸形及其他脑部异常。然而，ZIKV 在发育中脑组织中致病机制仍不明确。在神经科学研究中，颅内手术方法常用于探讨正常与异常脑发育及脑功能相关的问题。本实验方案采用经典外科技术，描述了可在小鼠神经系统中模拟 ZIKV 相关人类神经系统疾病的方法。虽然直接脑内接种并不能模拟病毒的自然传播途径，但该方法可使研究人员针对 ZIKV 感染发育中脑组织后的后果提出特定科学问题。本方案详细阐述了在胚胎期、新生期和成年期进行脑室内接种 ZIKV 的操作步骤。一旦掌握，该方法将成为一种简便且可重复的技术，操作时间仅需数小时。
引言
小头症是一种由于大脑发育缺陷导致的疾病，表现为新生儿头部尺寸小于平均水平。小头症患儿的症状表现多样，可能包括发育迟缓、癫痫发作、智力障碍、听力损失、视力问题以及运动和平衡障碍等，具体表现取决于疾病的严重程度和病因。1,2,3该疾病具有多因素病因，遗传因素、病原体以及环境因素均与小头症的发生相关。4,5,6,7,8,9在2015至2016年寨卡病毒（ZIKV）疫情暴发之前，根据美国疾病控制与预防中心（CDC）的数据，美国每10,000名新生儿中有8名被诊断为小头症102月1日st 2016年，世界卫生组织宣布寨卡病毒为国际关注的公共卫生紧急事件，原因是感染寨卡病毒（ZIKV）的孕妇所分娩的婴儿中，小头症诊断病例显著增加，令人担忧11....
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方案
所有动物使用方案均遵循南加州大学和佐治亚大学的动物护理指南。 对妊娠母鼠和成年鼠实施安乐死的方法依据批准的方案进行：先使用二氧化碳窒息法，随后以颈椎脱位作为辅助方法以确保安乐死完成。新生幼鼠通过断头法实施安乐死。
警告：以下实验方案涉及病原性病毒的操作。操作病毒时必须采取适当的预防措施。所有实验方案在实施前必须获得相应机构委员会的批准。
1. 寨卡病毒胚胎颅内接种
- 对于定时妊娠交配，将交配后当天的中午定为E0.5。在一天结束时将小鼠配对，并于次日清晨检查阴栓 以减少交配时间的变异性。
- 手术前准备玻璃针。拉制针头并在适当位置切断 其长度的1/3，然后使用带有水滴的微管拉针仪以45°角进行打磨，直至尖端孔径达到50–70 µm。在体视显微镜下检查针尖质量及是否有断裂。
- 将病毒分装物置于冰上。手术前，将ZIKV注射混合液装入已准备好的玻璃注射针中。组装无漏气注射器（50 µL容量）、鲁尔锁接头和管路，并用矿物油充分填充注射器及管路。填充完成后，安装针头，并吸取约6–7 µL的ZIKV至针头中（约1 µL相当于1.7 × 106 TCID50/mL
- 向妊娠的 C57BL/6J 或 129S1/SvImJ 小鼠注射盐酸氯胺酮（80–100 mg/kg）和赛拉嗪（5–10 mg/kg），胚胎注射时间....
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结果
图中展示了我们用于寨卡病毒（ZIKV）胚胎脑部接种的注射方法示意图，包括脑内注射（图1A）以及子宫内和胎盘内注射（图1B），说明了手术过程中应如何观察和定位妊娠母鼠及其胚胎（胚胎接种方案）。图2A 显示了E18.5脑皮层中ZIKV（MEX1-44）感染情况（使用黄病毒属群特异性抗原抗体进行免疫染色，绿色），Pax6（红色）标记发育中皮层的神经前体细胞（NPCs）。ZIKV于E14.5胚胎脑内接种。通过对组织样本进行TCID50检测7，我们的病毒增殖曲线分析表明，ZIKV可在发育中的脑组织中高效复制和增殖（图2B、2C），结果与已发表文献一致7。图2D.......
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讨论
本文介绍了一种在胚胎期、新生期和成年期对脑内接种寨卡病毒（ZIKV）的方法，用于研究ZIKV对脑发育造成的损伤。该方法虽然简单直接，但研究者需注意若干事项，以确保研究质量以及相关人员的安全。
DENV 与黄病毒属中的 ZIKV 密切相关。目前尚未发现 DENV 与人类儿童脑部疾病存在因果关联。采用胚胎接种法（约 1 µL 的 3.4 x 10⁷ PFU/mL DENV2 病毒液），DENV2 可成功感染并在发育中的脑组织中复制。5 TCID50/mL) (图 2D）。因此，除了使用未感染的Vero细胞培养基（模拟处理）外，还可以利用登革病毒（DENV）感染作为阴性对照，以研究寨卡病毒（ZIKV）在发育中大脑中的特异性致病机制。必须注意避免病毒泄漏 在子宫内这可能导致其他胚胎受到意外污染。因此，有必要通过分离每个胚胎的脑组织，随后进行qRT-PCR或TCID50检测，以确认感染与非感染个体。可在病毒溶液中添加染料以直观确认注射过程，但需验证染料本身是否会造成损伤。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨此感谢罗切斯特大学的 Abdellatif Benraiss 博士在学习成年动物和新生动物手术技术过程中提供的指导与讨论。作者还感谢佐治亚大学的 James Lauderdale 博士提供立体定位仪器设备，以及在建立本技术方法过程中所进行的有益讨论；同时感谢 ARCS（Advancement for Research College Scientists）基金会提供的支持，以及美国国立卫生研究院（NIH）的资助（NINDS 资助号 R01NS096176-02、R01NS097231-01）。 & F99NS105187-01)
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 柔性传动轴钻机悬挂电机 | Leica | 39416001 | |
| 小鼠立体定位仪 | Kopf | 04557R | |
| Micro4 微量注射泵控制器 | WPI | SYS-MICRO4 | |
| UMP3 超微量泵 | WPI | UMP3 | |
| Modulamp | Schott | - | |
| 鲁尔锁紧接头管路（19 号规格） | Hamilton | 90619 | |
| 熔点毛细管 | Kimble | 34500-99 | 玻璃针头 |
| Fluoro-Max：红色荧光微球 | Thermo Scientific | R25 | 无需稀释；用于练习注射 |
| 10 µL，型号 1701 LT SYR | Hamilton | 80001 | 用于胚胎接种 |
| 10 µL，型号 1701 RN SYR，小型可拆卸针头，26s 规格，2 英寸，2 型尖端 | Hamilton | 80030 | 用于新生鼠/成年鼠 |
| 4-0 Ethilon 尼龙缝线 | Ethicon | - | |
| 矿物油 | VWR | - | |
| 微量移液器拉制仪 | Sutter Instruments | P-1000 | |
| 微量移液器研磨仪 | Narishige | EG-44 | |
| 快绿 FCF 染料 | Sigma | F7252 | 与 0.5% 染料一同注射 |
| 抗体 | |||
| 黄病毒属群特异性抗原抗体 | Millipore | MAB10216 | 小鼠 IgG2a，1:400（图 2，图 3） |
| Pax6 | DBHB | Pax6-s | 小鼠 IgG1，1:20 |
参考文献
- Dreher, A. M., et al. Spectrum of Disease and Outcome in Children with Symptomatic Congenital Cytomegalovirus Infection. J of Pediatr. 164 (4), 855-859 (2014).
- Lanzieri, T. M., et al. Long-term outcomes of children wit....
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重印与许可
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