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方法文章

多重免疫荧光分析与肿瘤内 PD-1+ Tim-3+ CD8+ T 细胞的定量

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DOI：

10.3791/56606

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2018年2月8日

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1PARCC-INSERM U970, Université Paris Descartes, 2INSERM U970, Université Paris Descartes, 3Equipe Labellisée Ligue Contre le Cancer, 4Department of Immunology, Hopital Européen Georges Pompidou, 5Department of Medical Urology, Hopital Européen Georges Pompidou, 6Department of Pathology, Hopital Européen Georges Pompidou, 7Université Paris Diderot Paris 7, 8Department of medical oncology, Hopital Européen Georges Pompidou

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

研究肿瘤微环境可能发现用于预测免疫治疗临床反应的预后或预测性生物标志物。本文介绍了一种基于 原位 荧光多光谱成像用于自动分析和计数CD8的不同亚群+ T细胞。这种可重复且可靠的技術適用於大隊列分析。

摘要

免疫细胞是肿瘤微环境的重要组成部分，在肿瘤发生的各个阶段均影响肿瘤的生长与演化。值得注意的是，目前已有充分证据表明，人类肿瘤中的免疫细胞浸润与患者的预后及治疗反应密切相关。对肿瘤微环境中免疫细胞浸润的分析已成为患者分类及治疗反应评估的主要挑战之一。

程序性细胞死亡蛋白1（PD1；也称为CD279）、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）、含T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域的蛋白3（Tim-3；也称为CD366）以及淋巴细胞活化基因3（Lag-3；也称为CD223）等抑制性受体的共表达，是T细胞耗竭的典型特征。我们开发了一种多参数 原位 免疫荧光染色用于在细胞水平上鉴定并定量这些抑制性受体的共表达。在一项回顾性的肾细胞癌（RCC）冷冻组织系列中，结合使用荧光多光谱成像技术与图像分析软件，发现肿瘤浸润CD8⁺ T细胞上PD-1与Tim-3存在共表达。+ T细胞与肾细胞癌（RCC）预后不良相关。据我们所知，本研究是首次证明该自动化多重检测方法 原位 技术可能具有一定的临床相关性。

引言

近年来，免疫治疗已成为多种癌症（包括肾细胞癌）的一种极具前景的治疗方法。特别是基于抑制PD-1和CTLA-4等抑制性免疫检查点的免疫治疗，已被报道在临床上具有显著疗效。1,2,3,4,5,6抗CTLA-4、PD-1或程序性死亡配体1（PD-L1）的单克隆抗体已在多种癌症中获批，可使超过20%的患者产生持久的临床应答。7然而，并非所有患者都会产生应答，且这些治疗成本高昂并具有毒性，可能导致严重的类自身免疫副作用。因此，目前的挑战在于识别可用于预测这些新型免疫疗法疗效的生物标志物。肿瘤突变频率、PD-L1的表达水平或肿瘤内CD8的含量+ T细胞浸润已被报道与临床应答相关。然而，这种关联性仍然较弱，尚不足以推荐在临床实践中常规使用这些生物标志物，除非是在非小细胞肺癌（NSCLC）患者中使用帕博利珠单抗（Pembrolizumab）前进行PD-L1伴随诊断检测8,9,1011,12已证明，多种抑制性受体（如 PD-1、Tim-3、Lag-3 和 CTLA-4）的共表达会诱导细胞耗竭表型并导致治疗抵抗。13,14,15由于外周血不能代表肿瘤微环境，因此分析这些细胞的表型特征具有重要意义 原位共表达 PD-1 和 Tim-3 的 T 细胞在多种情况下已被证实功能受损13,16,17在本研究中，PD-1和Tim-3这两种抑制性受体在CD8⁺ T细胞上的共表达对预后的影响+ T细胞被评估。

迄今为止，对肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）上多种标志物共表达的研究主要依赖流式细胞术分析，这要求使用新鲜肿瘤组织，因而无法进行回顾性分析。采用传统方法 原位 染色时，每次只能进行一种染色，因此无法对共表达标记物的细胞类型进行表征。例如，PD-L1 在肿瘤微环境的多种细胞类型中均有表达，这使得通过传统的免疫组织化学分析难以确定哪些表达 PD-L1 的细胞在相关性研究中更具意义。在本研究中，我们开发了一种创新的 原位 一种多参数免疫荧光方法结合计算机计数，用于分析肿瘤浸润性CD8细胞中PD-1与Tim-3共表达的相关性+ T细胞与RCC临床结局的关系。该技术具有多项优势，包括能够利用多光谱相机在单细胞水平同时分析多个标志物，该相机可捕获特定波长区间 >10 nm 通过液晶滤光片18此外，该操作流程具有自动化特点，与手动方法相比，可提高操作者间的可重复性并缩短分析时间19在癌症研究领域，多项研究报道了在 Merkel 细胞癌、肺癌和头颈部癌中对 PD-1、PD-L1 和 CD8 等免疫分子进行的可靠多重染色结果20,21,22,23通过用户训练（表型鉴定步骤）可实现自动细胞计数。在不同的细胞区室（细胞核、细胞质和细胞膜）中测量荧光。

本研究对一大型肾细胞癌（RCC）队列中表达PD-1和/或Tim-3的不同肿瘤浸润性CD8+ T细胞亚群进行了计数，并将结果与临床严重程度评分及生存参数进行了关联分析。此外，还可通过平均荧光强度（MFI）数据以单细胞分辨率分析膜荧光强度，类似于流式细胞术中的分析方法。据我们所知，这是首项报道采用这种基于多光谱成像的计数技术获得预后结果的研究。

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方案

本研究遵循赫尔辛基宣言进行，并获得了当地伦理委员会（CPP Ile de France 编号 2012-05-04）的批准。已从纳入队列的参与者处获得知情同意。

1. 组织材料

  1. 在手术当天收集肾细胞癌（RCC）组织样本。在室温下（病理科）处理手术标本。
  2. 取约 0.5 cm × 0.5 cm × 0.5 cm 大小的肿瘤组织样本置于无菌管中。用液氮速冻后，于 -80 °C 保存。
  3. 将样本包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂中，在 -20 °C 下用恒冷切片机切取 4–6 µm 厚的切片。将切片在载玻片上室温晾干 12 小时，随后立即于 -80 °C 保存，以防脱水。
  4. 通过观察苏木精-伊红（Hematoxylin and Eosin）染色切片评估样本质量。

2. 原位 肿瘤浸润淋巴细胞的免疫荧光染色

  1. 操作指南
    1. 所有实验步骤均在室温下进行。
    2. 所有步骤中的稀释均使用Tris缓冲盐水（TBS；参见材料表）。
    3. 除一抗孵育后外，其余所有步骤均使用TBS洗涤。一抗孵育后的洗涤应使用含Tween20的Tris缓冲盐水（TBST，参见材料表）。缓冲液的组成与配制方法详见补充表1。
    4. 抗体孵育时使用湿盒，洗涤时使用染色缸。
    5. 操作过程中切勿让组织切片干燥。
  2. 预处理
    1. 将载有组织样本的玻片解冻，并用纸巾小心擦干样本周围的区域。使用疏水屏障笔标记包含组织的反应区域（参见材料表），室温干燥2分钟。
    2. 用100%丙酮固定样本5分钟，干燥2分钟，再用TBS洗涤10分钟。
  3. 封闭与阻断
    1. 用3滴0.1%的亲和素溶液预处理玻片10分钟，轻敲和/或轻弹玻片以均匀分布亲和素并去除气泡；随后用3滴0.01%的生物素溶液处理10分钟（参见材料表），轻敲和/或轻弹。用TBS洗涤。
    2. 进行Fc受体阻断：加入100 µL用TBS稀释的5%（体积比）正常血清。血清应与标记的二抗或三抗的宿主物种相同（参见材料表）；本实验中使用驴血清。孵育30分钟。
    3. 在孵育期间，短暂离心抗CD8、PD-1和Tim-3抗体（参见材料表）。按照补充表2所述，在TBS中配制一抗混合液。
  4. CD8、PD-1和Tim-3的免疫染色
    1. 配制一抗混合液。参见材料表和补充表2获取所用抗体（抗CD8、PD-1、Tim-3及其对应的二抗）及其浓度信息。
    2. 轻敲和/或轻弹去除步骤2.3.2中残留的驴血清。在湿盒中加入100 µL未标记的一抗混合液，孵育1小时。
    3. 在孵育期间，短暂离心Cy5标记的抗兔抗体、AF488标记的抗山羊抗体以及生物素化的抗小鼠抗体，并按照补充表2所述配制二抗混合液。
    4. 用TBST洗涤玻片5分钟，然后干燥。
    5. 在湿盒中加入100 µL二抗混合液，孵育30分钟。
    6. 按照补充表2所述配制含Cy3标记链霉亲和素的三抗混合液。
    7. 用TBS洗涤玻片10分钟，然后干燥。
    8. 加入100 µL三抗混合液，孵育30分钟。
    9. 用TBS洗涤玻片10分钟，然后干燥。
  5. 封片
    1. 使用含4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）的封片剂（DAPI浓度为1.5 µg/mL）进行封片，并加盖适用于荧光显微镜观察的盖玻片（参见材料表）。
      注：每项实验均设阴性对照，使用与实验抗体相同浓度的同型对照抗体。本染色实验中使用小鼠IgG1、兔IgG和山羊IgG作为阴性对照抗体（参见材料表）。阳性对照使用已知对检测标志物呈阳性的组织——人增生性扁桃体，每项实验均设置。典型的染色结果见结果部分（图1）。CD8、PD-1和Tim-3的单染应分别单独进行（每张玻片仅染一种抗体），预处理条件相同，但不使用DAPI。另需设置一组在相同实验条件下不加任何抗体、仅使用含DAPI封片剂的玻片。还应设置一组在相同实验条件下不加任何抗体且不使用DAPI的玻片用于成像。

3. 荧光分析与自动细胞计数

  1. 使用自动显微镜进行图像采集
    1. 创建一个实验方案。
      1. 打开自动显微镜软件和荧光照明器。
      2. 在菜单栏中，单击 "文件，“创建方案”，选择 "DAPI，FITC" 和“TRITC”。"
      3. 点击 "接下来，“组织切片”，然后单击 "接下来，“协议名称。” 输入一个名称，例如， "CD8-PD-1-Tim-3，“点击” "接下来，" "保存。"
      4. 手动将载玻片放置在载物台上。
      5. 在菜单栏中，单击 "设置，“设置。” 点击 "设置Z轴原点" 在新窗口中。
      6. 使用阳性对照切片调整曝光时间 即 DAPI复染的CD8、PD-1和Tim-3三重染色样本
      7. 在控制栏中点击“set exposure”。
      8. 调整每个滤光片的曝光时间，直至获得足够但未达到饱和的信号。
      9. 对于单色成像，请执行以下步骤：
      10. 选择采集，然后在“自动对焦”中选择 DAPI 滤光片。
      11. 在 "扫描区域限制"，将物镜移至载玻片的左上角。点击 "马克"对右下角进行相同操作。
        注意：此步骤用于确定4倍镜下低倍成像（LP成像）的范围；标记时需注意确保所标记区域完整包围该系列所有样本。
      12. 对于高倍镜（HP）成像，请执行以下操作：
      13. 在“自动对焦”下，选择 "DAPI".
      14. 在“采集”波段中选择 "DAPI", "FITC", "Cy3"，以及 "Cy5". 点击 "好的"在菜单栏上单击 "文件", "保存实验方案".
    2. 扫描载玻片。
      1. 点击加载协议 "文件", "加载方案" 从菜单栏中。单击 "开始".
      2. 输入“实验室编号”（图像存储的文件夹位置）。输入玻片编号以识别玻片。点击 "下一步".
      3. 点击 "单色成像" （在明场光下扫描整个载玻片，并使用4x物镜获取连续图像）。
        注意：这将生成一张幻灯片的灰度概览图像。
      4. 点击 "查找样本". 在低分辨率（4x）下选择要扫描的组织区域：按住“Ctrl”键，使用光标单击视野以选择或取消选择视野图2A).
      5. 点击 "LP成像" （4倍成像）用于每个视野的红色、蓝色、绿色荧光图像采集。
      6. 对于高倍视野选择，按住“Ctrl”键并使用光标单击相应区域，以选择或取消选择将在高分辨率（20倍）下扫描的组织区域。选择5个视野（图2B).
      7. 点击 "HP成像" （20倍成像）以进行每个视野的多光谱图像采集（图2C).
      8. 点击 "数据存储" 将图像存储至在 LabID 中最初选定的文件夹。
        注意：该过程已在下文进行总结并配图说明 图2对于每个步骤（组织检测、视野选择），用户均可逐步优化并训练算法，以实现全自动扫描流程。
  2. 荧光图像分析与使用耦合分析软件的自动细胞计数
    1. 构建谱图库。
      1. 打开图像分析软件。
      2. 在左侧面板中，打开 "构建文库"在“加载图像”下，单击 "浏览" 并选择一张单染图像（例如，CD8/花青素5
      3. 选择荧光染料，（例如，Cy5）。点击 "提取". 点击 "保存" 存入文库。点击 "保存".
      4. 对 PD-1、Tim-3 和 DAPI 单染玻片重复相同步骤，以整合各目标荧光染料的光谱。
        注意：构建光谱库需整合用于特定组织（此处为肾脏）的每种荧光染料的光谱， "合成的" 可使用已有的光谱库。由于自发荧光光谱严格依赖于组织类型，因此每个项目都必须单独进行一次自发荧光检测并建立相应的光谱库。
    2. 创建一个新项目。
      1. 从菜单栏中，单击 "文件", "新项目"在“查找功能”选项卡中，选择 "细胞分割"在“表型分析”选项卡中，选择 "表型分析". 点击 "创建".
      2. 将代表性图像整合到项目中。
        1. 在“文件”选项卡中，单击 "打开图像"选择整个系列中具有代表性的10至30张图像。添加未染色切片以消除自发荧光。在右侧面板中：选择光谱库来源，选择荧光染料，并选中与先前构建的光谱库相对应的染料。
      3. 为去除组织自发荧光，点击 "AF 按钮" 然后在空白载玻片上选择自发荧光区域。
      4. 图像处理与复合图像生成
        1. 点击 "准备所有" 将荧光文库与自发荧光光谱整合以生成复合图像（图3)。单击“眼睛”图标以打开“视图编辑器”面板并选择要显示的数据：选择标记物 CD8、PD-1、Tim-3 和 DAPI。去除自发荧光。按照软件提示的步骤操作。
      5. 对细胞进行分选。
        1. 为了分割细胞，在“Compartment”中选择 "细胞核" 和 "膜". 在 "细胞核" 标签，设置 DAPI 为细胞核复染剂。
        2. 在“最大和最小尺寸（像素）”选项卡中输入 "40" 和 "176" 分别为最小和最大尺寸。对于“最小”信号，设置 "0.13"。在 "分离" 标签，设置 "2.60"在 "细胞核" 标签，设置 "0.81"选择 "利用膜信号辅助分割".
        3. 点击 "分割细胞" 在屏幕底部检查细胞核和细胞膜的分割情况；若分割结果与细胞的DAPI和膜荧光信号不符，请尝试使用不同参数重新处理。
          注意：软件通过细胞核DAPI染色及细胞大小识别细胞。根据具体项目调整细胞参数（大小、分割、像素）。
      6. 对细胞进行表型分析。
        1. 在“表型”标签页中，点击 "添加". 创建细胞表型分类：CD8（蓝色点）/CD8-PD-1（红色点）/CD8-PD-1-Tim-3（绿色点）/其他（黑色点）图4).
        2. 选择每个类别的细胞超过5个示例。点击 "训练分类器".
          注意：此步骤将由软件生成一个统计分类算法。
        3. 点击 "表型分析" 以获得每个细胞的表型。
          注意：该软件可提供单个细胞表型的预测结果，并附带准确性的置信区间（CI）。
        4. 通过训练软件来优化算法，直至人工计数与自动计数之间的差异达到一致（误差 < 5%）。为感兴趣的细胞选择一个可接受的置信区间。
          注意：我们选择以 55% 置信区间作为可接受的训练基础。
      7. 保存算法和项目。
      8. 在“文件”下选择 "项目"命名并点击 "保存".
    3. 对系列样本进行批量分析。
      1. 选择 "批量分析"选择项目。添加待分析的图像。选择数据存储文件夹。点击 "运行"检查复合图像的质量，验证该系列所有图像的表型分析结果。
        注意：耦合的图像分析软件整合了所有细胞区室（膜/细胞质/细胞核）的信号。表型分析步骤至关重要，尽管算法的训练可能较为耗时。每幅图像的所有数据均存储于一个 .txt 文件中，每个细胞的所有数据（特别是其表型及其细胞指数 CI）位于同一行。对于每张切片，图像采集及后续计数均在 5 个视野中进行。
  3. 原始数据的整合与自动细胞计数的生成
    1. 使用统计学软件对数据进行计算。
      1. 计算1名患者5个视野对应的5张图像中的所有数据。使用统计分析平台，并由经验丰富的统计学家、数据管理员或数据科学家进行分析。编写一个脚本，根据细胞表型自动计数细胞，并选择CI > 55%.
      2. 将该系列的所有 .txt 文件放入同一文件夹中。
    2. 提取数据。
      1. 将所有 .txt 文件放入同一文件夹中。运行步骤 3.3.1 中构建的自动脚本。打开 R 脚本生成的输出 .csv 文件，另存为 .xl 格式。输出结果汇总了每种表型的细胞数量（即每位患者分别检测 CD8、CD8-PD-1、CD8-PD-1-Tim-3。
      2. 计算每位患者每视野的平均细胞数：将细胞总数除以视野数（即，5）以标准化每位患者每视野的细胞数量。
      3. 计算PD-1的百分比+ 总CD8细胞中的细胞+ T 细胞和 PD-1+ Tim-3+ 总CD8细胞中的细胞+ T细胞。参见 图5 此步骤的总结。
        注意：需要使用 R 语言（或其他选定的编程软件）正确创建和执行命令，因此必须由有经验的用户或统计学家/数据科学家完成。R 程序可计算同一患者的数据，但一名患者的 5 个 .txt 文件的文件名应具有相同的前缀，以对应唯一的患者标识符。
  4. 统计分析
    1. 使用统计软件对结果进行统计分析。
    2. 在统计学家的帮助下进行适当的统计分析。
      1. 使用非参数的 Wilcoxon 符号秩检验比较两种细胞表型间 PD-1 MFI 的差异图6）。使用 Pearson 卡方检验将协变量与组织学特征进行相关性分析。
      2. 使用Kaplan-Meier法估计无进展生存期，并采用Cox回归模型估计协变量对事件发生时间结局（如总生存期和无病生存期）的影响。
      3. 考虑 p将小于 0.05 的值视为具有显著性。

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结果

根据上述通用方案，我们旨在定量分析肾细胞癌（RCC）患者冷冻组织中共同表达抑制性受体 PD-1 和 Tim-3 的瘤内 CD8+ T 细胞，并将结果与临床结局进行关联分析25。

CD8/PD-1/Tim-3 染色的优化：

选择不同物种的抗体（小鼠、兔和山羊，参见材料表），以避免不同抗体之间的交叉反应。该方案已在扁桃体组织上进行了验证，扁桃体是一种结构化的淋巴组织。PD-1染色可见于生发中心（图1），而CD8和Tim-3染色则位于生发中心周围。这种典型染色模式的观察证实了本方案的有效性。该染色方法也在目标组织（肾脏）上进行了验证。

...

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讨论

修改与故障排除：

组织质量是一个重要参数；可通过苏木精和伊红染色轻松检测。

该技术的一个优势在于可进行多重染色，但为了避免荧光染料的信号溢出，建议选择发射波长至少相差10 nm的染料。本实验中，由于包含DAPI在内共有4种染色，因此我们选择将波长尽可能分散（DAPI：460 nm，AF488：519 nm，Cyanine 3：570 nm，Cyanine 5：670 nm）。通过软件从混合发射信号中计算出每种荧光染料的纯光谱，并结合自动图像分析，可避免不同荧光染料间信号重叠的风险。单染切片还可验证荧光染料之间无信号重叠，并借助光谱库实现补偿作用。

当某种标志物在单个细胞中的染色或荧光信号较弱时，有时难以判断其是否为阳性。每个实验中包含的阴性对照是确定阳性阈值的有效方法。

在用于分析图像的耦合软件中，存在一个用于确定细胞阳性的评分步骤，但该步骤仅能同时分析两种标记物。由于我们可以在同一...

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披露

所有作者均无利益冲突需要声明。

致谢

本工作获得了法国国家癌症研究院（INCA）（ET）、法国抗癌联盟（ET）、索邦巴黎西岱大学（ET）、法国国家科研署（ANR）（Selectimmunco）（ET）、免疫肿瘤学卓越实验室（Labex Immuno-Oncology）（ET）以及SIRIC CARPEM（CG, ET）的资助。EdG获得了ARC基金会博士后奖学金的资助。EV和CD获得了APHP（研究年奖学金）的资助。ChB获得了索邦巴黎西岱大学（博士合同）的资助。作者感谢百时美施贵宝公司对本项目的资金支持。作者感谢欧洲乔治·蓬皮杜医院和内克尔医院病理科（Laurianne Chambolle、Elodie Michel 和 Gisèle Legall）的协助。作者感谢PARCC、欧洲乔治·蓬皮杜医院组织学平台（Corinne Lesaffre）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Vectra 3 自动化定量病理成像系统 Perkin ElmerCLS142338
inForm 细胞分析软件 2.1Perkin ElmerCLS135781
R 软件https://www.r-project.org
Dakopen 划界笔DakoS2002
Tris 缓冲盐水 TBS 片剂Takara, Bio Inc.TAKT9141ZpH 7.6，100 片
含 Tween 20 的 Tris 缓冲盐水 TBS(+Tween20)Takara, Bio Inc.TAKT9142ZpH 7.6，100 片
生物素阻断系统DakoX0590含 0.1% 亲和素和 0.01% 生物素
正常驴血清Jackson Immunoresearch017-000-001体积分数 5% 浓度
含 DAPI 的 Fluoroshield 封片剂Sigma-aldrichF6057浓度 1.5 µg/mL
Knittel 玻璃盖玻片Knittel Gläser,10003924×60 mm，100 片
兔抗 CD8 单克隆抗体 P17-VnovusNBP1-79055使用浓度为 4µg/mL
小鼠抗 PD-1 单克隆抗体 NATabcamab52587使用浓度为 2 µg/mL
山羊抗 Tim-3 抗体R&DAF2365使用浓度为 3 µg/mL
兔抗 PD-L1 单克隆抗体 SP142Roche7309457001使用浓度为 1 µg/mL
AF647 标记的小鼠抗泛角蛋白单克隆抗体 C11Cell Signalling4528使用浓度为 0.5 µg/mL
山羊抗人 galectin-9 抗体R&DAF2045使用浓度为 0.3 µg/mL
Cy5 标记的驴抗兔 IgG 抗体Jackson Immunoresearch711-175-152使用浓度为 5 µg/mL
生物素标记的 F(ab’2) 片段驴抗小鼠 IgG 抗体Jackson Immunoresearch715-066-150使用浓度为 3 µg/mL
Alexa Fluor 488 标记的驴抗山羊 IgG 抗体abcamab150133使用浓度为 5 µg/mL
Cy3 标记的链霉亲和素AmershamPA43001使用浓度为 3 µg/mL
阴性对照小鼠 IgG1 抗体DakoX0931使用浓度为 2 µg/mL
山羊血清来源的 IgGSigma-aldrichI5256使用浓度为 3 µg/mL
兔血清来源的 IgGSigma-aldrichI5006使用浓度为 4µg/mL

参考文献

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PD 1 Tim 3 CD8 T
多重免疫荧光分析与肿瘤内 PD-1+ Tim-3+ CD8+ T 细胞的定量
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