痰液诱导及实验室处理方法

摘要

本文介绍了痰液诱导技术。该方案还详细说明了痰液处理方法，以进行细胞分类计数，并收集痰液上清液和细胞用于后续分析。

摘要

诱导痰液及其处理技术是一种公认的非侵入性方法，可用于采集和分析气道细胞，在哮喘、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、慢性咳嗽或特发性肺纤维化等多种呼吸系统疾病中具有重要意义。该技术耐受性良好、安全且无创，但由于技术要求高、耗时较长且需要经过培训的专业人员操作，目前仅限于科研机构和临床实践中的专科中心使用。痰液诱导与分析的成功率约为80%。

本文介绍了痰液样本的诱导及实验室处理方法。通过吸入高渗或等渗盐水联合沙丁胺醇来诱导痰液。在样本处理过程中，我们采用全痰法。使用二硫苏糖醇（DTT）对痰液样本进行黏液溶解。痰液处理的主要目的是获得细胞分类计数，以研究气道腔内存在的各类细胞。此外，还可对痰液上清液和痰液细胞进行其他分析，有助于进一步探讨炎症过程和免疫机制。例如，检测痰液上清液中的炎性介质，或对痰液细胞进行流式细胞术、基因组学或蛋白质组学等多种分析。

最后，展示了健康对照者、哮喘患者和慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者痰液分析的代表性结果。

引言

有多种方法可用于研究气道炎症：直接测量法（如支气管活检或支气管肺泡灌洗）和间接方法（如症状评估、血液样本分析和肺功能测试）¹。直接技术的优势在于能够可靠地评估气道炎症，但因其具有侵入性，且会给患者带来不适和风险，难以大规模应用¹。至于间接方法，其与气道炎症的直接评估相关性较差¹。

痰液采集是获取气道细胞的另一种方法，可直接评估气道炎症。然而，自发咳痰可能导致样本质量较差，并非所有患者都能完成。²该问题已通过使用超声雾化高渗盐水诱导痰液产生而得以解决²该方法最初用于人类免疫缺陷病毒（HIV）感染患者的诊断 Pneumocystis carinii 肺炎³ 并于1992年针对健康受试者和哮喘患者进行了调整⁴痰液诱导在较严重的患者中也可行，可使用等渗盐水进行⁵尽管通常耐受性良好，但吸入盐水可能在气道高反应性患者中引发支气管痉挛⁵因此，建议在操作前给予短效β受体激动剂¹此外，我们先前已证实，在超声波雾化器的生理盐水中加入沙丁胺醇可进一步降低该风险⁶痰液诱导的优点在于其为非侵入性方法² 在采取适当预防措施的情况下是安全的⁵.

痰液样本处理目前在文献中采用两种方法：全痰法和痰栓筛选法⁷在本实验室，采用全痰法进行处理。痰液处理的主要目的是获得差异细胞计数，以研究存在于气道管腔内的炎症类型。此外，还可通过分析痰液上清中的炎性介质，进一步开展多种其他检测，以深入探究炎症过程及免疫机制⁸ 或通过对痰液细胞进行详细检查（例如，流式细胞术⁹细胞培养¹⁰，基因组学¹⁰，蛋白质组学¹⁰免疫细胞化学⁷, 原位 杂交⁷, 等等。)

痰液诱导与分析技术目前仅限于临床实践中的研究机构和专业中心使用，因为该技术操作复杂、耗时较长，且需要经过专门培训的人员¹。该方法可用于研究哮喘、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、慢性咳嗽或特发性肺纤维化等多种呼吸系统疾病中的气道炎症¹¹。

方案

本节所述所有方法均经列日大学医院伦理委员会批准，所有健康受试者均已签署书面知情同意书，同意参与研究。

1. 痰液诱导

1. 支气管扩张剂使用前后的肺量测定
   1. 进行肺量测定（1秒用力呼气量 [FEV₁] 以及根据美国胸科学会（ATS）/欧洲呼吸学会（ERS）标准准则进行的用力肺活量（FVC）操作¹².
   2. 通过定量吸入器（MDI）和储雾罐装置给予400 µg吸入型沙丁胺醇。
      注意：在成人中，吸入型沙丁胺醇的不良事件包括震颤和心动过速¹³.
   3. 重复肺量测定（FEV₁ 以及15分钟后进行FVC操作，依据ATS/ERS标准标准¹².
2. 超声雾化器的制备
   注意：每次使用前，必须根据制造商的说明对雾化器进行彻底清洁和消毒。
   1. 将蒸馏水加入雾化器室，直至达到推荐水位。
   2. 将一个洁净的杯子放入雾化室中。
   3. 用合适的盖子盖住杯子。
   4. 使用50 mL高渗盐水（5%）填充杯子，适用于支气管扩张剂使用后FEV的患者₁ >65% 预计值或 50 mL 等渗盐水（0.9%），适用于支气管扩张剂使用后 FEV 的患者₁≤65% 预测值。
   5. 加入1.75 mL硫酸沙丁胺醇溶液（5 mg/mL）至杯中。
   6. 根据制造商的说明连接管路和阀门。
3. 雾化与痰液采集
   注意：该技术操作须在医疗监护下进行。
   1. 向患者解释操作步骤。
   2. 请患者使用鼻夹。
   3. 打开雾化器，并选择最低的气溶胶和风扇档位。
   4. 让患者通过咬嘴以平静呼吸方式吸入气溶胶，持续5分钟。
      注意：可根据患者的耐受程度适当增加气溶胶和风扇的设置。
      1. 若出现难以忍受的咳嗽或恶心，应立即停止操作并进入步骤 1.3.5。
      2. 若出现胸闷或呼吸不适，请前往步骤 1.3.8。
   5. 关闭雾化器。
   6. 让患者取下鼻夹，用水漱口并漱喉两次，然后将水吐入水槽中。
      注意：唾液细胞可能污染痰液样本，导致样本无法使用。
   7. 让患者将痰咳入一个塑料容器中。
   8. 进行肺量测定（用力呼气动作）以测量FEV₁.
   9. 评估 FEV₁ 下降如下：（FEV₁ 在步骤 3.8 测得的值 [mL] - 支气管扩张剂后 FEV₁ 测得的第1.3步数值 [mL] / 支气管扩张后FEV₁ 在步骤1.3中测得的数值 [mL]）*100
      1. 如果 FEV₁ 若较支气管扩张剂使用后的值下降20%或以上，则终止操作。测量FEV₁ 10 分钟后再次进行。如果 FEV₁ 若下降20%或以上，请医师给予雾化吸入异丙托溴铵（0.25 mg/2 mL），并继续对患者进行医学观察。进入步骤1.3.10。
      2. 如果 FEV₁ 若较支气管扩张剂使用后的数值下降不足20%或以上，则重复步骤3.2至3.9，共进行一至三次，使雾化总时间达到10至20分钟。
         注意：总雾化时间取决于痰液样本的质量（是否存在凝块或黏稠部分）和样本量。若雾化10分钟后样本质量和/或样本量仍不理想，应延长雾化时间，使总雾化时间达到15至20分钟。
   10. 将痰液样本冷藏保存直至处理。

2. 痰液处理

注意：为了获得最佳的细胞活性，应在采样后3小时内处理痰液样本。

注意：请穿戴实验服、防护手套和护目镜。

1. 初步准备
   1. 根据制造商说明，用无菌蒸馏水将浓缩的二硫苏糖醇溶液（黏液溶解剂）稀释10倍，制备10 mL的6.5 mM溶液。
      注意：为防止浓缩的二硫苏糖醇溶液与空气接触，应使用无菌注射器和针头从安瓿中抽取溶液。一旦开启，浓缩溶液必须在室温下保存，并在5天内使用完毕。稀释液需每日新鲜配制。
      注意：由于可能引起眼睛和皮肤刺激，需佩戴防护装备（防护服、手套和护目镜）。
   2. 用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）将台盼蓝溶液（0.4%）稀释5倍，得到0.08%的溶液。将稀释后的溶液在室温下保存，并在2周内使用。
      注意：由于存在致癌风险，需佩戴防护装备（防护服、手套和护目镜）。
2. 痰液上清液的收集
   1. 将全部痰液转移至50 mL锥底塑料管中，并称量样品重量。
   2. 加入相当于痰液重量3倍的DPBS溶液。
   3. 缓慢涡旋混合样品30秒。
   4. 在800 × g、4 °C条件下离心10分钟。
   5. 用两层无菌纱布过滤样品，并将滤液收集至50 mL锥底塑料管中。
   6. 将上清液分装至2 mL塑料管中，并在-80 °C保存。
      注意：上清液样品可用于检测痰液液体相成分。
3. 痰液黏液溶解处理
   1. 如有必要，加入DPBS至细胞沉淀中，使细胞悬液总体积达到5 mL。
   2. 用1体积的6.5 mM二硫苏糖醇稀释细胞悬液。使用摇床在室温下振荡细胞悬液20分钟。
      1. 用DPBS重复此步骤至少3次。
   3. 将稀释后的细胞悬液在550 × g、4 °C条件下离心10分钟，弃去上清液。
   4. 用约1 mL的DPBS重悬细胞沉淀。
4. 通过血细胞计数板计数评估痰液样本的定性特性（细胞浓度、鳞状细胞污染程度及台盼蓝排斥法测定的细胞活力）
   1. 测定并记录细胞悬液的准确体积。
   2. 将50 µL细胞悬液与50 µL的0.08%台盼蓝溶液混合，并混匀。
   3. 将样品置于血细胞计数板（Thoma计数室）盖玻片下，并置于光学显微镜（400X）下观察。
   4. 计数鳞状细胞、活的非鳞状细胞（未着色细胞）和死亡的非鳞状细胞（蓝色着色细胞）。
      注意：若细胞密度过低或过高，应浓缩或稀释细胞悬液，并重复步骤2.4.1–2.4.3。
   5. 评估细胞悬液的细胞浓度、鳞状细胞百分比以及非鳞状细胞的活力百分比。
      注意：计算每克痰液中非鳞状细胞总数：细胞悬液浓度（步骤5.4）× 细胞悬液体积（步骤4.8）× 非鳞状细胞百分比 / 痰液样品重量（步骤2.2.1）。
5. 使用细胞悬液制备染色的细胞涂片，并在需要时保存剩余细胞
   注意：若细胞悬液中鳞状细胞比例超过80%，则认为样本质量差，不适合制备细胞涂片¹⁴。此时应停止处理，并视为该样本失败。
   1. 用DPBS稀释一份细胞悬液，使其最终体积至少为350 µL，细胞浓度达到500,000个细胞/mL。
   2. 按照制造商说明组装细胞浓缩装置。
   3. 将上述细胞悬液各100 µL分别加入细胞浓缩装置的3个腔室中。
   4. 在细胞离心机中以150 × g、室温离心2分钟，弃去上清液。
   5. 按照制造商说明拆卸细胞浓缩装置。
   6. 让载玻片自然风干。
      注意：在此阶段，如有需要，可将剩余细胞保存在适当的缓冲液中用于后续实验。
   7. 按照制造商说明，使用商用染色试剂盒对载玻片进行染色（参见材料表）。
   8. 使用合适的封片介质和盖玻片封固载玻片。
   9. 将载玻片置于光学显微镜（600X）下，使用油镜观察。
   10. 至少计数500个非鳞状细胞：中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和上皮细胞。
       注意：分类细胞计数通常由一名或两名经过专门培训的观察者完成，以减少观察者间差异。
   11. 记录每种细胞类型的绝对值和百分比。

结果

血细胞计数板
使用血细胞计数板在显微镜下观察时，典型的图像如图1所示。鳞状细胞很容易被识别，因为它们比非鳞状细胞大得多。这些鳞状细胞是来自口腔的上皮细胞。当细胞死亡时，两类细胞均会被台盼蓝染色。计数时必须注意避免将酵母、细菌和碎屑计入。

图1：血细胞计数板图像，显示（A）一个活的非鳞状细胞，（B）一个死亡的非鳞状细胞，以及（C）一个鳞状细胞。比例尺 = 50 µm。请点击此处查看此图的放大版本。

细胞离心涂片： 图2 展示了痰液处理后获得的代表性细胞离心涂片图像。不同类型的细胞（中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和上皮细胞）可根据其形态和染色特征进行区分。在某些情况下，可能存在较多鳞状细胞污染，若鳞状细胞比例超过80%，则认为样本不合格（图3）。

图 2：细胞涂片图像显示（A）中性粒细胞，（B）巨噬细胞，（C）嗜酸性粒细胞，（D）淋巴细胞，以及（E）上皮细胞。比例尺 = 20 µm。请点击此处查看此图的放大版本。

图3：质量较差的细胞涂片示例，其中>80%为鳞状细胞。比例尺 = 20 µm。请点击此处查看此图的放大版本。

成功率
在本部门，基于1,129例受试者（健康人群、哮喘患者或慢性阻塞性肺疾病患者）的样本数据，该操作的成功率（包括诱导成功且获得可读的细胞离心涂片）为82%（924/1,129）。根据患者类型进行的亚组分析显示，健康人群的成功率为75%（57/76），哮喘患者为82%（827/1,004），慢性阻塞性肺疾病患者为82%（40/49）。

健康受试者中的结果
在我科对289名健康受试者进行的回顾性分析中，痰液重量的中位数（四分位间距）为3.72 g（四分位间距为2.46 g - 5.54 g），每克痰液中非鳞状上皮细胞总数的中位数为0.59 × 10⁶（四分位间距为0.37 × 10⁶ - 1.29 × 10⁶）。

在这些健康受试者中，鳞状细胞的比例较低，为19%（10%-34%），而细胞活力较高，达66%（54%-78%）。关于不同类型细胞所占百分比，结果总结于图4A。可以看出，巨噬细胞的比例（49% [31%-68%]）高于中性粒细胞的比例（34% [14%-60%]），而淋巴细胞（2% [1%-3%]）、嗜酸性粒细胞（0% [0%-0%]）和上皮细胞（4% [2%-11%]）的比例较低。当数据以绝对数值表示时，结果相似（图4B）。

图 4：健康受试者中观察到的差异性细胞计数的代表性结果，以（A）百分比或（B）绝对值表示。结果以中位数（四分位距）显示。请点击此处查看该图的放大版本。

还必须考虑患者的年龄。事实上，患者年龄与痰液样本中中性粒细胞比例之间存在显著相关性（图5）。同样，当根据10岁为一组的年龄段对患者进行分类时（图6），我们观察到随着年龄组的增加，中性粒细胞百分比显著上升。因此，在比较不同队列的研究结果时，必须考虑这一变量，并在受试者匹配时格外谨慎。

图5： 年龄与痰液中性粒细胞百分比的相关性。相关性采用Spearman检验进行计算。请点击此处查看该图的放大版本。

图6： 不同年龄类别中性粒细胞百分比的变化趋势。 各年龄组间中性粒细胞百分比比较的ANOVA检验p值为 <0.0001。采用Dunn多重比较检验进行多组间比较。p值表示如下：* p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001。结果以中位数（四分位距）表示。请点击此处查看该图的放大版本。

呼吸系统疾病患者的检测结果
诱导痰技术常用于评估哮喘患者的炎症细胞谱型。该技术也可应用于慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者，这是一种同样具有炎症特征的呼吸系统疾病。在年龄、性别和吸烟习惯相匹配的健康受试者、哮喘患者和COPD患者（三组人群）之间进行比较时，我们发现这些群体的炎症细胞谱型存在显著差异（图7）。事实上，哮喘患者通常表现为痰液嗜酸性粒细胞升高，而COPD患者的痰液中性粒细胞比例通常高于健康对照组，且与疾病的严重程度相关。

图7： 健康受试者（n = 45）、哮喘患者（n = 108）和慢性阻塞性肺病（COPD）患者（n = 54）的痰液炎症细胞谱型。三组在性别、年龄和吸烟习惯方面相匹配。通过单因素方差分析（ANOVA）比较中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和巨噬细胞在各组间的差异，其 p 值分别为 <0.05、<0.0001 和 <0.0001。组间多重比较采用邓恩（Dunn's）多重比较检验。p 值表示方式如下：* p <0.05，*** p <0.001。结果以中位数（四分位距）表示。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

诱导痰法是一种研究气道区室的有用工具。该技术具有多种可能的应用。首先，它可增进对参与各种呼吸系统疾病免疫细胞及机制的认识。例如，该技术已用于对大量患者进行气道炎症的研究，并已表明约一半的哮喘患者具有异常的气道嗜酸性粒细胞炎症^15,16,17，而慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者通常表现为痰液中中性粒细胞计数升高¹⁸。该技术还促进了对特发性肺纤维化患者气道炎症的更准确表征，并揭示了可能参与该疾病的介质¹⁹。其次，诱导痰技术可能有助于预测治疗反应。例如，痰液中嗜酸性粒细胞比例异常已被证明是糖皮质激素治疗反应的预测标志物^11,18。在哮喘和COPD中，根据痰液嗜酸性粒细胞比例调整糖皮质激素剂量以使其恢复正常，已被证明在减少急性加重次数方面比依据现行临床指南调整治疗更为有效^11,20,21。第三，痰液分析可能有助于开发靶向治疗。例如，COPD及部分哮喘患者痰液中中性粒细胞数量异常，已推动了抗中性粒细胞性治疗的发展¹¹。第四，该技术可能在诊断中发挥作用。例如，痰液嗜酸性粒细胞增多是诊断非哮喘性嗜酸性粒细胞性支气管炎的必要条件¹¹。

除了获取差异细胞计数外，诱导痰技术还可通过对痰上清液或痰细胞进行研究，开展多种其他分析。利用痰上清液的分析示例包括对介质分子的检测^8,19,22 以及样本对嗜酸性粒细胞趋化活性的评估²²从痰液细胞中可提取RNA，并用于microRNA或基因表达分析^19,23 也可通过流式细胞术分析痰液细胞^9,23 可用于免疫表型分析和细胞分选。此外，痰液细胞还可进行培养¹⁰，可测量其介导物质的产生 体外²⁴值得注意的是，在这种情况下，中介物的成分与痰液上清液中的成分不同。实际上，痰液上清液中的中介物可能受到气道定居细胞分泌物及血浆渗出的影响，而痰液细胞培养模型则不受这些因素干扰。²⁴最后，免疫细胞化学和 原位 也可使用痰液细胞进行杂交⁷.

诱导痰技术存在一些局限性。该操作必须在医疗监护下进行，操作者向患者提供详尽的指导也至关重要。其他局限性还包括患者的配合程度和健康状况，因为该过程需要患者进行呼吸努力。关于该技术在儿童中的可行性，已有若干研究报道，在6岁以上儿童中该技术是成功且安全的²⁵。目前缺乏针对<6岁儿童的数据²⁵，但诱导痰在这些儿童中可能较难实施¹⁴。由于该技术操作要求高、耗时较长且需要经过培训的专业人员，目前仅限于研究机构和专业中心使用¹。另一项局限性在于，痰液诱导和分析技术并非总能成功，即并非每次都能获得可读的细胞涂片²⁶。然而，在不同患者队列中，成功率通常约为80%^{4,26,27,28,29}。最后，在比较不同患者队列时，应注意年龄匹配问题，因为年龄已被证明会影响痰液细胞计数^30,31。同样，性别和吸烟习惯等其他参数也需匹配，因为它们也可能干扰痰液细胞计数^29,32。当无法实现患者匹配时，另一种考虑年龄、性别或吸烟状况的方法是在统计分析中对这些特征进行校正。

与其他可从气道收集细胞的技术（如活检和支气管肺泡灌洗）相比，诱导痰法具有操作简便、耐受性好、安全性高、可重复性强、成本效益好以及无创等优势。这些优势使得诱导痰技术能够大规模实施，并可长期重复进行，因而成为气道采样的首选替代方法。支气管吸液法是另一种可用于采集黏膜衬液以评估气道介质的技术³³。尽管该技术（需支气管镜检查）比诱导痰更具侵入性，但其优势在于可避免唾液污染，并能获得比支气管肺泡灌洗更高的介质浓度³³。

在实验方案中，有几个关键步骤需要特别注意。首先，必须谨慎控制盐水浓度和诱导时间，因为这两个参数可能影响实验结果，因此需要进行标准化^34,35。其次，使用二硫苏糖醇（DTT）进行黏液溶解是样本处理中的重要步骤。与磷酸盐缓冲液（PBS）相比，DTT能更有效地分散痰液中的细胞⁷，从而提高细胞涂片质量，并对获得可重复的细胞计数至关重要²。然而，黏液溶解剂可能干扰生化成分的测定，因此在检测新的生化物质时应进行加标实验³⁶。最后，另一个关键步骤是细胞计数，该步骤必须由经过培训的技术人员操作，以确保结果的可靠性和可解释性。

文献中还描述了一种使用痰栓（黏稠或较致密的部分）而非全痰样本的替代方法⁷。这两种技术各有优缺点。全痰法处理速度较快⁷，但常被唾液污染，从而稀释样本并可能降低细胞涂片的质量^2,7。而痰栓筛选法可减少唾液污染，因此样本通常更适合用于液相介质因子的定量分析以及制备细胞涂片⁷。然而，该方法处理时间较长⁷，且所选痰栓可能无法代表整个样本³⁷。此外，并非所有样本都含有痰栓，这在实际应用中可能具有局限性。目前两种方法均已得到验证且可重复，尚无证据表明这两种方法所得的白细胞分类计数存在差异^14,38。

未来，诱导痰可作为一种临床工具，为各类炎症性呼吸系统疾病的调查、诊断和管理提供生物标志物。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
肺量计 - Spirobank	MIR France
沙丁胺醇 MDI - Ventolin	GLAXOSMITHKLINE	CNK：0135-913	参见该国可获得的药物
超声雾化器 UltraNeb	DeVilbiss Healthcare USA	UltraNeb U3000
Devilbiss UltraNeb 一次性雾化杯 && Lids	DeVilbiss Healthcare USA	100HD-647
DeVilbiss UltraNeb 雾化器用细菌过滤器	DeVilbiss Healthcare USA	1001005879
单向阀	Hudson RCI USA	41664
单向阀	Hudson RCI USA	41665
气溶胶T型连接器	Hudson RCI USA	41077
单分支波纹通气回路	Int'Air Medical France	TA30A
5 % NaCl	/	/	由我院药房制备
Mini-Plasco NaCl 0.9%	B.Braun Medical  比利时迪埃日
硫酸沙丁胺醇 5 mg/mL - Ventolin	GLAXOSMITHKLINE	CNK：0094-987	见该国可获得的药物
异丙托溴铵 0.25 mg/2 mL - Atrovent	Boehringer Ingelheim Germany	CNK: 1543-305	见该国可获得的药物
Dulbecco's 磷酸盐缓冲液	LONZA 比利时	BE17512F
Sputolysin 试剂	Calbiochem	56000
0.4% 台盼蓝溶液 100 mL	LONZA Bio Whittaker 比利时	17-942E
血细胞计数板 - 托马计数室	Labor Optik Lancing 英国	1500000
Hemacolor 染色试剂盒	默克比利时	1116610001	替代产品  Diff Quik 染色试剂盒  Medion Diagnostic
封片剂 - Entellan	默克比利时	107960
Statspin Cytofuge 12	Beckman Coulter Belgium	X00-003066-001