Method Article

基于神经网络的发育能力或不称职小鼠全生长卵母细胞的识别

DOI:

10.3791/56668

⸱

March 3rd, 2018

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1Laboratorio di Biologia dello Sviluppo, Dipartimento di Biologia e Biotecnologie "Lazzaro Spallanzani", University of Pavia, 2Institute of Biotechnology, University of Helsinki, 3Department of Reproductive Medicine, University of California San Diego, 4Dipartimento di Ingegneria Industriale e dell'Informazione, University of Pavia

In This Article

Summary

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在这里, 我们提出了一个非侵入性评估的卵母细胞发育能力在他们的体外成熟从生发泡到中期 II 阶段。该方法将时间推移成像与粒子图像测速 (PIV) 和神经网络分析相结合。

Abstract

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不孕诊所将受益于选择发育能力的vs不称职的卵母细胞使用非侵入性程序, 从而改善整体妊娠结局。我们最近开发了一种基于显微活体观察的小鼠卵母细胞在他们的体外成熟从胚泡 (问) 到中期 II 阶段, 然后分析的细胞质运动在这段时间内发生。在这里, 我们提出了这个程序的详细协议。卵母细胞从完全生长的窦卵泡中分离出来, 在15小时内培养为37摄氏度和 5% CO2的时间失效分析显微镜。图片以8分钟的间隔拍摄。利用粒子图像测速 (PIV) 方法对图像进行分析, 计算每个卵母细胞在整个培养期内的细胞质运动速度 (CMVs) 剖面。最后, 通过一个数学分类工具 (前馈人工神经网络, 文芳) 来喂养每个卵母细胞的 CMVs, 预测配子发育能力或不称职的概率, 精度为91.03%。该协议, 为鼠标设置, 现在可以测试其他物种的卵母细胞, 包括人类。

Introduction

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女性不孕症是一种影响越来越多的妇女的病理学。根据世界卫生组织的数据, 大约20% 的夫妇是不孕, 40% 是由于女性不孕。此外, 在美国或意大利接受癌症治疗的妇女中, 有三人 (分别为30万年和3万岁) 发育过早卵巢衰竭。

预防癌症患者不孕症的策略是在肿瘤治疗前, 卵巢卵泡的分离和冷冻保存, 其次是 "体外" 成熟 (病媒) 在细胞产业部的阶段 (即对产业部的转变)。无创性的卵母细胞发育能力标志物的提供将改善受精和发育过程, 以及整个妊娠成功1,2。

根据 supravital fluorochrome 赫斯特33342的染色后观察到的染色质构型, 哺乳动物完全生长的卵母细胞被归类为被包围的核仁 (SN) 或未被包围的核仁 (诺基亚)3。除了不同的染色质组织, 这两种类型的卵母细胞显示许多形态学和功能差异3,4,5,6,7

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Protocol

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所有涉及动物的程序均由帕维亚大学的机构动物保育和使用及伦理委员会批准。动物在22°c 的情况下被维护了, 60% 空气湿气和一个光/黑暗的周期 12:12 h。

1.Ovary 隔离

  1. 注射腹腔2四-十一周老 CD1 雌性小鼠与 10 U 卵泡刺激激素与无菌1毫升胰岛素注射器。
  2. 等46-48 小时。
  3. 用肌肉注射50毫克/千克的 Zoletil (Tiletamina 和 Zolazepan cloridrate) 来称量老鼠和麻醉。弄死颈椎脱位。
  4. 用一对解剖钳抓住腹壁覆盖的皮肤。用剪刀切开皮肤和身体壁, 用镊子拉开切口。
  5. 用一双镊子, 将内脏移到一旁, 精确定位子宫角, 并将卵巢放在肢体上。
  6. 用钟表匠钳轻轻握住卵巢, 用剪刀把韧带剪到子宫。重复与其他卵巢。
  7. 将收集到的卵巢移植到35毫米细胞培养皿中, 其中含有1毫升的 M2 隔离培养基, 在37摄氏度、5% CO2的空气中预热。
  8. 用细剪刀在显微镜下取出脂肪和输卵管。

2. 卵丘卵母细胞复合物的分离

  1. 使用无菌镊子和1G 无菌胰岛素针穿刺卵巢表面, 直到窦性卵母细胞复合物 (COCs) 被动释放。
  2. 用嘴控制的手拉巴斯德微 (直径200µm) 收集 ....

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Results

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图 2显示了一个代表性的发育能力和不称职的卵母细胞, 分别在开始 (在) 和在病媒治疗过程的末尾 (产业部)。全生长小鼠卵母细胞的病媒在 15 h 培养期间发生。时间推移观察记录减数分裂的进展, 检测主要的减数分裂事件, 包括 GVBD 和第一极性体的挤压。

200多名发育能力的vs不称职的卵母细胞的分析和比较显示减数分裂进展的时间差异。具体地说, 在 GVBD 的卵母细胞中, 1-2 个时间推移帧的延迟很大, 而 PB1 挤出则发生15帧延迟。尽管有这些差异, 变异率太高, 不能让单卵母细胞分类。因此, 该程序是用数学分类工具实现的。

图 3显示了使用的数学分类工具的方案, 称为前馈人工神经网络.......

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Discussion

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有几个关键步骤, 你应该照顾, 同时执行此协议与鼠标卵母细胞以及其他物种。一旦从卵泡中分离出来, 卵母细胞就应该立即转移到记录滴中, 因为与伴卵丘细胞的分离触发了对产业转移的开始。对本议定书可能的修改可能是将 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 (IBMX) 添加到用于 COCs 隔离的 M2 介质中。IBMX 防止了即时触发的问-产业转移, 并允许同步的整个实验组的卵母细胞。

在我们的实验中使用的活体细胞筛选系统 (参见材料表) 将成熟度下降的数量限制为 4, 每滴卵母细胞4个, 因此每个实验总共有16个卵母细胞。这一限制可以用其他时间失效的活细胞筛查系统来克服, 商业上可以使用, 并配备了几个文化室。

根据我们的经验, 帧与下面的记录间隔是一个关键点。经过一些初步的实验, 我们每8分钟拍摄一次图像, 因为这是最短的时间窗口, 允许清晰地观察在 vescicle 的转变过程中发生的重大事件, 如生发的破裂和挤压第一个极性的身体。当观察其他物种的卵母细胞时, 这个时间窗可能需要重估。

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Disclosures

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作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

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这项工作使成为可能多亏了支持: 帕维亚大学悬浮角速度陀螺仪 2016;帕尔马大学 2014, 2016;并运动提供必要的 plasticware 进行这项研究。我们感谢夏恩温莎博士 (英国布里斯托尔大学工程学院) 提供 Cell_PIV 软件。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
FolligonIntervetA201A02荷尔蒙治疗
Hoechst 33342 Sigma-AldrichB2261用于卵母细胞异染色质
细胞培养皿 35 mm x 10 mm 康宁 430165用于 COCs 分离
EmbryoMax M2 培养基 （1X），液体，含酚红Merck-MilliporeMR-015-D用于 COCs 分离
MEM Alpha 培养基 （1X） + Glutamax Sigma-AldrichM4526用于卵母细胞体外成熟
细胞培养皿 35 mm 玻璃底 威尔公司 GWSt-3522用于成像实验
BioStation IM-LM NikonMFA91001活细胞筛选系统 
巴斯德移液器Delchimica Scientific 玻璃器皿6709230用于毛囊作
矿物油Sigma-AldrichM8410防止污染和介质蒸发
青霉素/链霉素Life Technologies15070063防止介质污染 
胎牛血清 （FBS）Sigma-AldrichML16141079用于化妆和 α;MEM 培养基 
L-谷氨酰胺 Life Technologies25030用于化妆和 alpha;MEM 培养基 
牛磺酸Sigma-AldrichT0625用于化妆 &MEM 培养基 
牛血清白蛋白 （BSA）Sigma-AldrichA3310用于化妆和 α;MEM 培养基
丙酮酸钠 Sigma-Aldrich P4562用于编造 &MEM 培养基
Zoletil （Tiletamina 和 Zolazepan cloridrate）Virbac SrlQN01AX9用于小鼠麻醉
Cell_PIV软件 由英国布里斯托大学的 Shane Windsor 博士友情提供               -               -
MATLABThe MathWorks，马萨诸塞州内蒂克郡                -用于多范式数值计算

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Patrizio, P., Fragouli, E., Bianchi, V., Borini, A., Wells, D. Molecular methods for selection of the ideal oocyte. Reprod. Biomed. Online. 15 (3), 346-353 (2007).
  2. Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a syst....

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