基于神经网络的小鼠完全生长期卵母细胞发育潜能识别

摘要

在此，我们介绍一种在卵母细胞发育过程中进行非侵入性评估其发育潜能的实验方案 体外 从生发泡期到第二次减数分裂中期的成熟过程。该方法结合了延时成像、粒子图像测速技术（PIV）和神经网络分析。

摘要

不孕症诊所将受益于选择具有发育潜能的胚胎的能力 与 使用非侵入性方法筛选无发育潜能的卵母细胞，从而提高整体妊娠结局。我们近期开发了一种分类方法，基于对小鼠卵母细胞在发育过程中进行显微活体观察 体外 从生发泡（GV）期到第二次减数分裂中期（metaphase II）的成熟过程，随后分析此时间推移期间发生的细胞质运动。本文提供了该实验方法的详细操作流程。卵母细胞从完全成熟的有腔卵泡中分离后，置于配备时间推移成像系统的显微镜中，在37 °C、5% CO₂条件下培养15小时。₂每隔8分钟拍摄一次图像。采用粒子图像测速法（Particle Image Velocimetry, PIV）对图像进行分析，计算每个卵母细胞在整个培养期间的胞质流动速度（Cytoplasmic Movement Velocities, CMVs）分布曲线。随后，将每个卵母细胞的CMVs数据输入一种数学分类工具（前馈型人工神经网络，Feed-forward Artificial Neural Network, FANN），该工具可预测配子是否具有发育潜能，预测准确率达91.03%。本方案虽建立于小鼠模型，但未来可应用于其他物种（包括人类）卵母细胞的检测。

引言

女性不孕症是一种影响越来越多女性的病理状态。根据世界卫生组织的数据，大约20%的夫妇存在不孕问题，其中40%是由于女性不孕所致。此外，接受癌症治疗的女性中有三分之一（美国每年约30万名，意大利每年约3万名）会发生早发性卵巢功能衰竭。

一种预防癌症患者不孕的策略是在肿瘤治疗前分离并冷冻保存卵巢卵泡，随后 体外 卵母细胞由生发泡期（GV期）体外成熟至第二次减数分裂中期（MII期）的过程（GV-to-MII转变）。无创性卵母细胞发育潜能标志物的可及性将有助于改善受精与胚胎发育过程，并提高整体妊娠成功率^1,2.

根据活体荧光染料Hoechst 33342染色后观察到的染色质构型，哺乳动物完全生长期的卵母细胞可分为核仁周围型（SN）和非核仁周围型（NSN）。³除了染色质组织不同外，这两种卵母细胞在形态和功能上也存在诸多差异^{3,4,5,6,7....}

方案

所有涉及动物的实验程序均经帕维亚大学机构动物护理与使用及伦理委员会批准。动物饲养环境条件为22 °C、60%空气湿度，光照/黑暗循环周期为12:12 h。

1. 卵巢分离

1. 使用无菌的1 mL胰岛素注射器，向2只4至11周龄的CD1雌性小鼠腹腔内注射10 U促卵泡激素。
2. 等待46–48小时。
3. 称量小鼠体重，并通过肌肉注射50 mg/kg Zoletil（替来他明和盐酸唑拉西泮）进行麻醉，随后通过颈椎脱臼法处死小鼠。
4. 用解剖镊夹住覆盖腹壁的皮肤，用剪刀剪开皮肤和体壁，并用镊子将切口拉开。
5. 用镊子将肠道移至一侧，找到子宫角，并在其末端定位卵巢。
6. 用钟表镊轻轻夹住卵巢，用剪刀剪断其与子宫相连的韧带，另一侧卵巢重复相同操作。
7. 将收集的卵巢转移至一个含有1 mL预热至37 °C、5% CO₂空气环境下的M2分离培养基的35 mm细胞培养培养皿中。
8. 在体视显微镜下，使用精细剪刀去除脂肪组织和输卵管。

2. 放射冠-卵母细胞复合体的分离

1. 使用无菌镊子和1G无菌胰岛素针头刺破卵巢表面，直至窦腔卵丘-卵母细胞复合体（COCs）被动释放。
2. 用口控自制的巴斯德微量移液管（直径200 µm）收集具有三层以上....

结果

图2 分别展示了体外成熟（IVM）过程开始阶段（GV期）和结束阶段（MII期）具有代表性的发展成熟能力和不具发展成熟能力的卵母细胞。完全生长的小鼠卵母细胞的体外成熟过程在15小时的培养期间完成。时间推移观察记录了减数分裂的进程，并检测到主要的减数分裂事件，包括生发泡破裂（GVBD）和第一极体的排出。

对两百多个具有发育潜能的样本进行分析与比较 与 发育能力差的卵母细胞在减数分裂进程上表现出时间差异。具体而言，在NSN型卵母细胞中，生发泡破裂（GVBD）显著延迟了1-2个时间间隔帧，而第一极体（PB1）排出则延迟约15帧。尽管存在这些差异，但个体变异度过高，无法实现单个卵母细胞的准确分类。因此，本研究引入了一种数学分类工具来优化该分析流程。

讨论

在对小鼠卵母细胞以及其他物种卵母细胞执行本方案时，有几个关键步骤需要特别注意。一旦从卵泡中分离出来，应立即将卵母细胞转移至记录液滴中，因为与伴随之卵丘细胞分离会启动核膜破裂（GV）至第二次减数分裂中期（MII）的转变过程。本方案的一个可能改进措施是在用于卵母细胞复合体（COCs）分离的M2培养基中添加3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）。IBMX可防止GV-to-MII转变的即时启动，从而实现整个实验组卵母细胞的同步化。

我们实验中使用的活细胞筛选系统（见材料表）将成熟液滴数量限制为每滴4个卵母细胞，共4滴，即每次实验最多16个卵母细胞。通过使用其他 commercially available 且配备多个培养腔室的延时活细胞筛选系统，可克服这一限制。

根据我们的经验，每帧图像与其后续帧之间的记录间隔是一个关键因素。经过多次预实验，我们确定每8分钟拍摄一次图像，因为这是能够清晰观察生发泡破裂和第一极体排出等GV至MII期转变过程中主要事件的最短时间窗口。在观察其他物种的卵母细胞时，该时间窗口.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Folligon	Intervet	A201A02	激素处理
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	B2261	用于卵母细胞异染色质染色
细胞培养培养皿 35 mm x 10 mm	Corning	430165	用于COCs分离
EmbryoMax M2培养基（1X），液体，含酚红	Merck-Millipore	MR-015-D	用于COCs分离
MEM Alpha培养基（1X）+ Glutamax	Sigma-Aldrich	M4526	用于卵母细胞体外成熟
35 mm玻璃底细胞培养培养皿	WillCo	GWSt-3522	用于成像实验
BioStation IM-LM	Nikon	MFA91001	活细胞筛选系统
巴斯德吸管	Delchimica Scientific Glassware	6709230	用于卵泡操作
矿物油	Sigma-Aldrich	M8410	防止污染和培养基蒸发
青霉素/链霉素	Life Technologies	15070063	防止培养基污染
胎牛血清（FBS）	Sigma-Aldrich	ML16141079	用于配制αMEM培养基
L-谷氨酰胺	Life Technologies	25030	用于配制αMEM培养基
牛磺酸	Sigma-Aldrich	T0625	用于配制αMEM培养基
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	A3310	用于配制αMEM培养基
丙酮酸钠	Sigma-Aldrich	P4562	用于配制αMEM培养基
Zoletil（替来他明和盐酸唑拉西泮）	Virbac Srl	QN01AX9	用于小鼠麻醉
Cell_PIV软件	由英国布里斯托大学Shane Windsor博士惠赠	-	-
MATLAB	The MathWorks, Natick, MA	-	用于多范式数值计算