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方法文章

基于神经网络的小鼠完全生长期卵母细胞发育潜能识别

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DOI：

10.3791/56668

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2018年3月3日

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1Laboratorio di Biologia dello Sviluppo, Dipartimento di Biologia e Biotecnologie "Lazzaro Spallanzani", University of Pavia, 2Institute of Biotechnology, University of Helsinki, 3Department of Reproductive Medicine, University of California San Diego, 4Dipartimento di Ingegneria Industriale e dell'Informazione, University of Pavia

本文内容

摘要

在此，我们介绍一种在卵母细胞发育过程中进行非侵入性评估其发育潜能的实验方案 体外 从生发泡期到第二次减数分裂中期的成熟过程。该方法结合了延时成像、粒子图像测速技术（PIV）和神经网络分析。

摘要

不孕症诊所将受益于选择具有发育潜能的胚胎的能力 与 使用非侵入性方法筛选无发育潜能的卵母细胞，从而提高整体妊娠结局。我们近期开发了一种分类方法，基于对小鼠卵母细胞在发育过程中进行显微活体观察 体外 从生发泡（GV）期到第二次减数分裂中期（metaphase II）的成熟过程，随后分析此时间推移期间发生的细胞质运动。本文提供了该实验方法的详细操作流程。卵母细胞从完全成熟的有腔卵泡中分离后，置于配备时间推移成像系统的显微镜中，在37 °C、5% CO₂条件下培养15小时。2每隔8分钟拍摄一次图像。采用粒子图像测速法（Particle Image Velocimetry, PIV）对图像进行分析，计算每个卵母细胞在整个培养期间的胞质流动速度（Cytoplasmic Movement Velocities, CMVs）分布曲线。随后，将每个卵母细胞的CMVs数据输入一种数学分类工具（前馈型人工神经网络，Feed-forward Artificial Neural Network, FANN），该工具可预测配子是否具有发育潜能，预测准确率达91.03%。本方案虽建立于小鼠模型，但未来可应用于其他物种（包括人类）卵母细胞的检测。

引言

女性不孕症是一种影响越来越多女性的病理状态。根据世界卫生组织的数据，大约20%的夫妇存在不孕问题，其中40%是由于女性不孕所致。此外，接受癌症治疗的女性中有三分之一（美国每年约30万名，意大利每年约3万名）会发生早发性卵巢功能衰竭。

一种预防癌症患者不孕的策略是在肿瘤治疗前分离并冷冻保存卵巢卵泡，随后 体外 卵母细胞由生发泡期（GV期）体外成熟至第二次减数分裂中期（MII期）的过程（GV-to-MII转变）。无创性卵母细胞发育潜能标志物的可及性将有助于改善受精与胚胎发育过程，并提高整体妊娠成功率1,2.

根据活体荧光染料Hoechst 33342染色后观察到的染色质构型，哺乳动物完全生长期的卵母细胞可分为核仁周围型（SN）和非核仁周围型（NSN）。3除了染色质组织不同外，这两种卵母细胞在形态和功能上也存在诸多差异3,4,5,6,7,8,9，包括其减数分裂能力和发育潜能。当从卵巢中分离并进行成熟培养时 体外, 两种类型的卵母细胞均可达到MII期，受精后均能发育至2细胞期，但只有具有SN型染色质结构的卵母细胞才能发育至足月9尽管作为一种选择胜任者的分类方法效果良好 与 非成熟卵母细胞的主要缺点是荧光染料本身以及尤其用于其检测的紫外光可能对细胞产生的诱变效应。

基于上述所有原因，我们致力于寻找其他与SN或NSN染色质构型相关的非侵入性标志物，以替代Hoechst染料的使用，同时保持相同的高分类准确率。胞质运动速度（CMV）的延时观察正逐渐成为反映细胞状态的独特特征。例如，近期研究表明，在受精时记录的CMV与小鼠和人类合子完成着床前及足月发育的能力之间存在关联10,11。

基于这些早期研究，本文描述了一种用于识别具有发育能力或无发育能力的小鼠完全生长期卵母细胞的平台5,6,7,8。该平台包括三个主要步骤：1）从窦状卵泡中分离卵母细胞，并根据其染色质构型将其分类为核仁周围型（SN）或非核仁周围型（NSN）；2）利用粒子图像测速技术（PIV）采集并分析单个卵母细胞在GV至MII期转变过程中皮质肌动蛋白流动（CMV）的时间推移图像；3）将PIV获得的数据输入前馈型人工神经网络（FANN）进行盲分类分析12,13。我们详细阐述了该方法中针对小鼠设计的关键步骤，以便其可被进一步测试并应用于其他哺乳动物物种（e.g., 牛、猴和人类）。

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方案

所有涉及动物的实验程序均经帕维亚大学机构动物护理与使用及伦理委员会批准。动物饲养环境条件为22 °C、60%空气湿度，光照/黑暗循环周期为12:12 h。

1. 卵巢分离

  1. 使用无菌的1 mL胰岛素注射器，向2只4至11周龄的CD1雌性小鼠腹腔内注射10 U促卵泡激素。
  2. 等待46–48小时。
  3. 称量小鼠体重，并通过肌肉注射50 mg/kg Zoletil（替来他明和盐酸唑拉西泮）进行麻醉，随后通过颈椎脱臼法处死小鼠。
  4. 用解剖镊夹住覆盖腹壁的皮肤，用剪刀剪开皮肤和体壁，并用镊子将切口拉开。
  5. 用镊子将肠道移至一侧，找到子宫角，并在其末端定位卵巢。
  6. 用钟表镊轻轻夹住卵巢，用剪刀剪断其与子宫相连的韧带，另一侧卵巢重复相同操作。
  7. 将收集的卵巢转移至一个含有1 mL预热至37 °C、5% CO2空气环境下的M2分离培养基的35 mm细胞培养培养皿中。
  8. 在体视显微镜下，使用精细剪刀去除脂肪组织和输卵管。

2. 放射冠-卵母细胞复合体的分离

  1. 使用无菌镊子和1G无菌胰岛素针头刺破卵巢表面，直至窦腔卵丘-卵母细胞复合体（COCs）被动释放。
  2. 用口控自制的巴斯德微量移液管（直径200 µm）收集具有三层以上卵丘细胞的COCs，并将其转移至300 µL新鲜M2培养基液滴中。
  3. 使用自制的巴斯德微量移液管（直径80 µm）轻轻吹打数秒，去除包围卵母细胞的卵丘细胞。
  4. 将卵母细胞在20 µL M2培养基液滴之间反复转移，直至卵丘细胞被完全清除。

3. 基于染色质组织的卵母细胞分类

  1. 从5 mg/mL的母液（溶于1×PBS）开始，用M2培养基将Hoechst 33342染色液稀释至终浓度为0.05 µg/mL。
  2. 在35 mm培养皿盖底部放置3.5 µL的Hoechst染色液微滴。
  3. 将每个单独的卵母细胞转移至一滴Hoechst染色液中，将培养皿置于预热（37 °C）的加热板上，并用避光盖子覆盖，避免光照暴露。
  4. 室温孵育10分钟后，在荧光显微镜下用UV光（330–385 nm）以10倍放大观察卵母细胞，观察时间不超过1–2秒。
  5. 若卵母细胞的核仁周围出现一圈Hoechst染色阳性的染色质，则将其归类为核仁被包围型（SN）（图1A）。
  6. 若卵母细胞的核仁未被Hoechst染色阳性的染色质包围，且在细胞核内呈现弥散的异染色质斑点，则将其归类为核仁未被包围型（NSN）（图1B）。

4. 基于神经网络的卵母细胞分类

  1. 在35 mm玻璃底培养皿中制备四滴2 µL的α-MEM培养基，培养基中添加5%热灭活胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、5 mM牛磺酸、100 U/mL青霉素、75 µg/mL链霉素和23.5 µg/µL丙酮酸钠，然后覆盖预热（37 °C）并预先平衡的矿物油，以防止培养基蒸发。
    注：若使用活细胞筛选系统，可使用7 mm × 7 mm的网格作为参考，保持各液滴之间的特定距离。
  2. 将3–4个卵母细胞转移至每滴培养基中。
  3. 将玻璃底培养皿放入配备延时成像记录软件的活细胞筛选系统（见材料表），在温度稳定（37 °C）和CO2浓度恒定（5%）的环境中观察卵母细胞成熟过程。
  4. 打开延时成像记录软件，屏幕左侧显示卵母细胞的实时图像，右侧显示所有设置按钮。
  5. 选择卵母细胞中心，将其定位在屏幕中央；必要时调整焦距。
  6. 选择Ph按钮，并将DIA Lamp设置为192；曝光时间设置为1/125 s；增益设置为1.99；分辨率设置为1600 × 1200。
  7. 选择FL2，并将DIA Lamp设置为5；曝光时间设置为3 s；增益设置为2.37；分辨率设置为1600 × 1200。
  8. 点击新建点按钮，以记录卵母细胞在培养液滴中的位置。对液滴内的每个卵母细胞重复相同操作。
  9. 选择时间，并将采集周期设置为8 min，总时间设置为15 h。
  10. 点击开始延时成像以启动记录循环。
  11. 打开MATLAB软件，输入>>cell_piv，然后选择PIV工具。
  12. 选择包含录制视频的文件夹，并加载任意一个.jpeg文件以导入整个图像序列。对每个卵母细胞，通过点击选择区域工具选定感兴趣区域（ROI）。
  13. 在文件菜单中选择处理PIV，然后点击查看器工具按钮。
    注：程序将计算ROI内的速度矢量，并自动生成一个以.mat格式保存的数据文件。
  14. 打开.mat文件，点击选择ROI工具按钮，在卵母细胞轮廓周围绘制一个圆形，然后在文件菜单下点击保存。
    注：该区域内的矢量将被显示，图形窗口中的平均幅值数据也将更新为该新ROI的结果。
  15. 将整个延时成像序列中收集的平均幅值数据导入电子表格，行表示帧序列，列表示每个被分析的单个卵母细胞。
  16. 将NSN和SN卵母细胞的数据分别组织为10个子组。
  17. 使用9个子组迭代训练前馈人工神经网络（FANN），1个子组用于盲法测试。
    1. 重复上述过程9次，每次更换盲法测试样本（10折交叉验证）。
  18. 打开MATLAB，运行自定义脚本main，根据提示输入训练数据文件名（train.txt）、用于训练的NSN和SN卵母细胞数量，以及待分析的延时成像时间区间（通常为第1–2帧至第112–113帧）。
  19. 按回车键开始训练。
  20. 输入测试数据文件名（test.txt）。
  21. 在MATLAB工作区中打开向量test_outputs_cyt。
    注：屏幕上将出现一个窗口，第一行显示NSN和SN卵母细胞获得真阳性（TP或真NSN）和假阳性（FP或假NSN）的概率；第二行显示获得假阴性（FN或假SN）和真阴性（TN或真SN）的概率。
  22. 使用公式：(TP+TN)/(TP+FP+FN+TN)，计算FANN的准确率，以百分比表示。

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结果

图2 分别展示了体外成熟（IVM）过程开始阶段（GV期）和结束阶段（MII期）具有代表性的发展成熟能力和不具发展成熟能力的卵母细胞。完全生长的小鼠卵母细胞的体外成熟过程在15小时的培养期间完成。时间推移观察记录了减数分裂的进程，并检测到主要的减数分裂事件，包括生发泡破裂（GVBD）和第一极体的排出。

对两百多个具有发育潜能的样本进行分析与比较 与 发育能力差的卵母细胞在减数分裂进程上表现出时间差异。具体而言，在NSN型卵母细胞中，生发泡破裂（GVBD）显著延迟了1-2个时间间隔帧，而第一极体（PB1）排出则延迟约15帧。尽管存在这些差异，但个体变异度过高，无法实现单个卵母细胞的准确分类。因此，本研究引入了一种数学分类工具来优化该分析流程。

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讨论

在对小鼠卵母细胞以及其他物种卵母细胞执行本方案时，有几个关键步骤需要特别注意。一旦从卵泡中分离出来，应立即将卵母细胞转移至记录液滴中，因为与伴随之卵丘细胞分离会启动核膜破裂（GV）至第二次减数分裂中期（MII）的转变过程。本方案的一个可能改进措施是在用于卵母细胞复合体（COCs）分离的M2培养基中添加3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）。IBMX可防止GV-to-MII转变的即时启动，从而实现整个实验组卵母细胞的同步化。

我们实验中使用的活细胞筛选系统（见材料表）将成熟液滴数量限制为每滴4个卵母细胞，共4滴，即每次实验最多16个卵母细胞。通过使用其他 commercially available 且配备多个培养腔室的延时活细胞筛选系统，可克服这一限制。

根据我们的经验，每帧图像与其后续帧之间的记录间隔是一个关键因素。经过多次预实验，我们确定每8分钟拍摄一次图像，因为这是能够清晰观察生发泡破裂和第一极体排出等GV至MII期转变过程中主要事件的最短时间窗口。在观察其他物种的卵母细胞时，该时间窗口...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究得以完成，得益于以下支持：帕维亚大学FRG 2016项目；帕尔马大学FIL 2014、2016项目；以及Kinesis公司为开展本研究所提供的必要塑料实验耗材。我们感谢英国布里斯托大学工程学院Shane Windsor博士提供Cell_PIV软件。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
FolligonIntervetA201A02激素处理
Hoechst 33342 Sigma-AldrichB2261用于卵母细胞异染色质染色
细胞培养培养皿 35 mm x 10 mm Corning 430165用于COCs分离
EmbryoMax M2培养基（1X），液体，含酚红Merck-MilliporeMR-015-D用于COCs分离
MEM Alpha培养基（1X）+ Glutamax Sigma-AldrichM4526用于卵母细胞体外成熟
35 mm玻璃底细胞培养培养皿 WillCo GWSt-3522用于成像实验
BioStation IM-LM NikonMFA91001活细胞筛选系统 
巴斯德吸管Delchimica Scientific Glassware6709230用于卵泡操作
矿物油Sigma-AldrichM8410防止污染和培养基蒸发
青霉素/链霉素Life Technologies15070063防止培养基污染 
胎牛血清（FBS）Sigma-AldrichML16141079用于配制αMEM培养基 
L-谷氨酰胺 Life Technologies25030用于配制αMEM培养基 
牛磺酸Sigma-AldrichT0625用于配制αMEM培养基 
牛血清白蛋白（BSA）Sigma-AldrichA3310用于配制αMEM培养基
丙酮酸钠 Sigma-Aldrich P4562用于配制αMEM培养基
Zoletil（替来他明和盐酸唑拉西泮）Virbac SrlQN01AX9用于小鼠麻醉
Cell_PIV软件 由英国布里斯托大学Shane Windsor博士惠赠                -                -
MATLABThe MathWorks, Natick, MA                 -用于多范式数值计算

参考文献

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