Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

摘要

The present study describes a simple method of detecting endogenous levels of Rab10 phosphorylation by leucine-rich repeat kinase 2.

摘要

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson's disease (FPD). Since abnormal activation of the kinase activity of LRRK2 has been implicated in the pathogenesis of PD, it is essential to establish a method to evaluate the physiological levels of the kinase activity of LRRK2. Recent studies revealed that LRRK2 phosphorylates members of the Rab GTPase family, including Rab10, under physiological conditions. Although the phosphorylation of endogenous Rab10 by LRRK2 in cultured cells could be detected by mass spectrometry, it has been difficult to detect it by immunoblotting due to the poor sensitivity of currently available phosphorylation-specific antibodies for Rab10. Here, we describe a simple method of detecting the endogenous levels of Rab10 phosphorylation by LRRK2 based on immunoblotting utilizing sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) combined with a phosphate-binding tag (P-tag), which is N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl)-N,N',N'-tris(pyridin-2-yl-methyl)-1,3-diaminopropan-2-ol. The present protocol not only provides an example of the methodology utilizing the P-tag but also enables the assessment of how mutations as well as inhibitor treatment/administration or any other factors alter the downstream signaling of LRRK2 in cells and tissues.

引言

PD is one of the most common neurodegenerative diseases, predominantly affecting dopaminergic neurons in the midbrain, resulting in dysfunction of the motor systems in elderly people¹. While most patients develop PD in a sporadic manner, there are families inheriting the disease. Mutations in several genes have been found to be linked with FPD². One of the causative genes for FPD is LRRK2, in which eight missense mutations (N1437H, R1441C/G/H/S, Y1699C, G2019S, and I2020T) linked to a dominantly inherited FPD called PARK8 have so far been reported^3,4,<....

方案

1. Sample Preparation for the P-tag SDS–PAGE

1. Remove and discard the media from 10 cm dishes in which cells are grown using a suction and wash cells with 5 mL Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) by first adding DPBS to the side of the dishes to avoid disturbing the cell layer, and manually rock the dishes back and forth several times.
2. Remove and discard the DPBS using a suction and add 2 mL of 0.25% (w/v) trypsin diluted in DPBS, and gently rock the dishes to cover the cell layer. Put the dishes into a CO₂ incubator (37 °C, humidified air, 5% CO₂) for 5 min.
3. After pipetting up and down using a....

结果

Overexpression System: Phosphorylation of HA-Rab10 by 3×FLAG-LRRK2 in HEK293 Cells:

HEK293 cells were transfected with 0.266 µg of HA-Rab10 wild-type and 1.066 µg of 3×FLAG-LRRK2 (wild-type, kinase-inactive mutant (K1906M), or FPD mutants). Rab10 phosphorylation was examined by P-tag SDS-PAGE followed by immunoblotting using an anti-HA antibody (Figure 2). 10 µg of proteins were run on a 10% gel (80 x .......

讨论

Here, we describe a facile and robust method of detecting Rab10 phosphorylation by LRRK2 at endogenous levels based on the P-tag methodology. Because the currently available antibody against phosphorylated Rab10 works only with overexpressed proteins¹⁵, the present method utilizing P-tag SDS-PAGE is the only way to assess endogenous levels of Rab10 phosphorylation. Moreover, the present method allows the estimation of the stoichiometry of Rab10 phosphorylation in cells. Because the P-tag methodolo.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>试剂
Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）	自制		150 mM NaCl、8 mM Na2HPO4-12H2O、2.7 mM KCl、1.5 mM KH2PO4 MilliQ水中，并通过高压灭菌
钠	Nacalai灭菌Tesque	31320-34
磷酸氢二钠钠 12-水	和光	196-02835
氯化钾	和光	163-03545
磷酸二氢钾	和光	169-04245
2.5% 胰蛋白酶 （10X）	Sigma-Aldrich	T4549	用无菌 DPBS 稀释 10 倍，用于制备工作溶液
Dulbecco 改良的 Eagle 培养基 （DMEM）	Wako	044-29765
胎牛血清	BioWest	S1560	在 56 °C 下热灭活;C 30 分钟
青霉素-链霉素 （100X）	Wako	168-23191
HEPES	Wako	342-01375
氢氧化钠	Wako	198-13765
聚乙亚胺盐酸盐 MAX，线性，分子量 40,000 （PEI MAX 40000）	PolySciences， Inc.	在 20 mM HEPES-NaOH （pH 7.0） 中制备 1 mg/mL 的储备液	24765-1
二甲基亚砜	Wako	045-28335
Tris	STAR	RSP-THA500G
盐酸	Wako	080-01066
聚氧乙烯 （10） 辛基苯醚	Wako	160-24751	相当于 Triton X-100
乙二醇-双（2-氨基乙基醚）-N，N，N'，N'-四乙酸 （EGTA）	和光	346-01312
原钒酸钠（V）	和光	198-09752
氟化钠	关东化学	37174-20
&β;-甘油磷酸二钠盐 五水合	Nacalai Tesque	17103-82
钠焦磷酸盐十水合	国产化学	2113899
微囊藻毒素-LR	Wako	136-12241
蔗糖	Wako	196-00015
完全不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物	罗氏	11873580001	一片溶解在 1 mL 水中，可在 -20 °C 下储存;C 的一个月。以 1：50 稀释度用于细胞裂解
Pierce 考马斯 （Bradford） 蛋白质检测试剂盒	Thermo Fisher Scientific	23200
十二烷基硫酸钠	Nacalai Tesque	31607-65
甘油	Wako	075-00616
溴酚蓝	Wako	021-02911
&β;-巯基乙醇	关东化学	25099-00
乙醇	Wako	056-06967
甲醇	Wako	136-01837
磷酸盐结合标签丙烯酰胺	Wako	AAL-107	P 标签丙烯酰胺
40% （w/v） 丙烯酰胺溶液	Nacalai Tesque	06119-45	丙烯酰胺：Bis = 29：1
四甲基乙二胺 （TEMED）	Nacalai Tesque	33401-72
过硫酸铵粉末溶解在 MilliQ 水中来制备	硫酸铵 （APS）	Wako	016-08021
2-丙醇	和光	166-04831
氯化锰四水合物	Sigma-Aldrich	M3634
Precision Plus 蛋白质预染标准	Bio-Rad	1610374、1610373 1610377	方案中使用的分子量标记
WIDE-VIEW 预染蛋白大小标记物 III	Wako	230-02461
甘氨酸	Nacalai Tesque	17109-64
Amersham Protran NC 0.45	GE Healthcare	10600007	硝酸纤维素膜
Durapore 膜过滤器	EMD Millipore	GVHP00010	PVDF 膜
滤纸 No.1	Advantec	00013600
Ponceau S	Nacalai Tesque	28322-72
乙酸	Wako	017-00251
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379	聚氧乙烯脱水水梨醇单月桂酸
乙二胺四乙酸酯 （EDTA）	Wako	345-01865
脱脂奶粉	Difco Laboratories	232100
Immunostar	Wako	291-55203	ECL 溶液（正常灵敏度）
Immunostar LD	Wako	290-69904	ECL 溶液（高灵敏度）
CBB 染色溶液自制			1 g CBB R-250、50% （v/v） 甲醇、10% （v/v） 乙酸，溶于 1 L MilliQ 水中
CBB R-250	Wako	031-17922
CBB 脱色			的 12% （v/v） 甲醇、7% （v/v） 乙酸的 1 L MilliQ 水
溶液名称	Company	目录号	评论
抗体
抗 HA 抗体	Sigma-Aldrich	11583816001	在 0.2 &mu 使用;g/mL，用于免疫印迹。
抗 Rab10 抗体	Cell Signaling Technology	#8127	以 1：1000 的比例用于免疫印迹. 特异性已在 Ito 等人中通过 CRISPR KO 确认，Biochem J，2016 年。
抗 pSer935 抗体	Abcam	ab133450	用于 1 μg/mL，用于免疫印迹。
抗 LRRK2 抗体	Abcam	ab133518	用于 1 μg/mL，用于免疫印迹。
抗 α;-微管蛋白抗体	Sigma-Aldrich	T9026	在 1 &mu 使用;g/mL，用于免疫印迹。
抗 GAPDH 抗体	Santa-Cruz	sc-32233	用于 0.02 μg/mL，用于免疫印迹。
过氧化物酶 AffiniPure 绵羊抗小鼠 IgG （H+L）	Jackson ImmunoResearch	515-035-003	在 0.16 &μ 使用;g/mL，用于免疫印迹。
过氧化物酶 AffiniPure 山羊抗兔 IgG （H+L）	Jackson ImmunoResearch	111-035-003	用于 0.16 &μ;g/mL，用于免疫印迹。
名称	>公司	目录号	注释
抑制剂
GSK2578215A	MedChem Express	HY-13237	储备液在 DMSO 中制备 10 mM 并储存在 -80 °C;C
MLi-2	由 Dario Alessi 博士（邓迪大学）提供储备		液在 DMSO 中制备 10 mM 并储存在 -80 °C;C
名称	>公司<	strong>目录号	评论
质粒
Rab10/pcDNA5 FRT 到 HA	由 Dario Alessi 博士提供 （邓迪大学）		该质粒表达氨基末端 HA 标记的人 Rab10。
LRRK2 WT/p3xFLAG-CMV-10	由 Takeshi Iwatsubo 博士（东京大学）提供Ito		等人，生物化学，46：1380–1388 (2007).该质粒表达氨基末端 3xFLAG 标记的野生型人 LRRK2。
LRRK2 K1906M/p3xFLAG-CMV-10	由 Takeshi Iwatsubo 博士（东京大学）提供，		生物化学，46：1380–1388 (2007).该质粒表达人 LRRK2 的氨基末端 3xFLAG 标记的 K1906M 激酶失活突变体。
LRRK2 N1437H/p3xFLAG-CMV-10			本文。该质粒表达人 LRRK2 的氨基末端 3xFLAG 标记的 N1437H FPD 突变体。
LRRK2 R1441C/p3xFLAG-CMV-10	由 Takeshi Iwatsubo 博士（东京大学）		Kamikawaji 等人提供，生物化学，48：10963–10975 (2013).该质粒表达人 LRRK2 的氨基末端 3xFLAG 标记的 R1441C FPD 突变体。
LRRK2 R1441G/p3xFLAG-CMV-10	由 Takeshi Iwatsubo 博士（东京大学）		Kamikawaji 等人提供，生物化学，48：10963–10975 (2013).该质粒表达人 LRRK2 的氨基末端 3xFLAG 标记的 R1441G FPD 突变体。
LRRK2 R1441H/p3xFLAG-CMV-10	由 Takeshi Iwatsubo 博士（东京大学）		Kamikawaji 等人提供，生物化学，48：10963–10975 (2013).该质粒表达人 LRRK2 的氨基末端 3xFLAG 标记的 R1441H FPD 突变体。
LRRK2 R1441S/p3xFLAG-CMV-10			本文。该质粒表达人 LRRK2 的氨基末端 3xFLAG 标记的 R1441S FPD 突变体。
LRRK2 Y1699C/p3xFLAG-CMV-10	由 Takeshi Iwatsubo 博士（东京大学）		Kamikawaji 等人提供，生物化学，48：10963–10975 (2013).该质粒表达人 LRRK2 的氨基末端 3xFLAG 标记的 Y1699C FPD 突变体。
LRRK2 G2019S/p3xFLAG-CMV-10	由 Takeshi Iwatsubo 博士（东京大学）		Kamikawaji 等人提供，生物化学，48：10963–10975 (2013).该质粒表达人 LRRK2 的氨基末端 3xFLAG 标记的 G2019S FPD 突变体。
LRRK2 I2020T/p3xFLAG-CMV-10	由 Takeshi Iwatsubo 博士（东京大学）		Kamikawaji 等人提供，生物化学，48：10963–10975 (2013).该质粒表达人 LRRK2 的氨基末端 3xFLAG 标记的 I2020T FPD 突变体。
名称	公司	目录号	评论
设备
CO2 培养箱	Thermo Fisher Scientific	Forma Series II 3110水套
式自动移液器	Drummond	Pipet-Aid PA-400
微量移液器 P10	Nichiryo	00-NPX2-10	0.5–10 μL
微量移液器 P200	Nichiryo	00-NPX2-200	20–200 亩;L
微量移液器 P1000	Nichiryo	00-NPX2-1000	100–1000 μL
微量移液器吸头 P10	STAR	RST-481LCRST
微量移液器无菌吸头 P200	FUKAEKASEI	1201-705YS
微量移液器无菌吸头 P1000	STAR	RST-4810BRST	无菌
5 mL 可分散移液器	Greiner	606180	无菌
10 mL 可分散移液器	Greiner	607180	无菌
25 mL 可散孢移液器	Falcon	357535	无菌
血细胞计数器	Sunlead Glass	A126	改进的 Neubeuer
显微镜	Olympus	CKX53
10 cm 培养皿	Falcon	353003	用于组织培养
6 孔板	AGC Techno Glass	3810-006	用于组织培养
涡旋混合器	Scientific Industries	Vortex-Genie 2
细胞刮刀	住友电木	MS-93100
1.5 mL 管	STAR	RSV-MTT1.5
15 mL 管	AGC Techno Glass	2323-015
50 mL 管	AGC Techno Glass	2343-050
离心机	TOMY	MX-307
96 孔板	Greiner	655061	不适用于组织培养
读板器	Molecular Devices	SpectraMax M2e
SDS–PAGE 储液槽	Nihon Eido	NA-1010
转运储液槽	Nihon Eido	NA-1510B
凝胶板（缺口）	Nihon Eido	NA-1000-1
凝胶板（普通）	Nihon Eido	NA-1000-2
硅垫片	Nihon Eido	NA-1000-16
17 孔梳	Nihon Eido	定制
活页夹	Nihon Eido	NA-1000-15
5 mL 注射器	Terumo	SS-05SZ
21G	Terumo	NN-2138R
发电站 1000 VC	ATTO	AE-8450	SDS 电源–页面和转移
大型称重船	Ina Optika	AS-DL
塑料容器	AS ONE	PS CASE No.4	10 x 80 x 50 毫米
摇床	Titech	NR-10
苯乙烯泡沫箱	通用		内部尺寸应适合一个转运罐（200 x 250 x 250 毫米）。
ImageQuant LAS-4000	GE Healthcare		配备制冷型 CCD 相机的成像仪，用于检测 ECL