本研究描述了一种检测富含亮氨酸重复序列激酶2对Rab10内源性磷酸化水平的简单方法。
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摘要
摘要
富含亮氨酸重复序列的激酶2（LRRK2）的突变已被证实与家族性帕金森病（FPD）相关。由于LRRK2激酶活性的异常激活参与了帕金森病（PD）的发病机制，因此建立一种评估LRRK2激酶活性生理水平的方法至关重要。近期研究表明，在生理条件下，LRRK2可磷酸化Rab GTP酶家族成员，包括Rab10。尽管通过质谱法可在培养细胞中检测到LRRK2对内源性Rab10的磷酸化，但由于目前可用的针对Rab10磷酸化位点特异性抗体灵敏度较低，免疫印迹法难以实现有效检测。本文介绍了一种基于免疫印迹法检测内源性Rab10被LRRK2磷酸化水平的简便方法，该方法结合了十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和磷酸结合标签（P-tag），其中P-tag的化学结构为N-(5-(2-氨乙基氨基甲酰)吡啶-2-基甲基)-N,N',N'-三(吡啶-2-基甲基)-1,3-二氨基丙-2-醇。本实验方案不仅提供了利用P-tag技术方法的一个范例，还可用于评估突变、抑制剂处理/给药或其他因素如何影响LRRK2在细胞和组织中的下游信号传导。
引言
帕金森病（PD）是最常见的神经退行性疾病之一，主要影响中脑中的多巴胺能神经元，导致老年人运动系统功能障碍1。尽管大多数患者为散发性发病，但也存在家族性遗传病例。已发现多个基因突变与家族性帕金森病（FPD）相关2。其中，LRRK2 是 FPD 的致病基因之一，目前已报道了 8 个与常染色体显性遗传的 PARK8 型 FPD 相关的错义突变（N1437H、R1441C/G/H/S、Y1699C、G2019S 和 I2020T）3,4,5。多项针对散发性 PD 患者的全基因组关联研究（GWAS）也发现 LRRK2 基因位点的基因组变异是 PD 的风险因素，提示 LRRK2 功能异常可能是散发性 PD 和 PARK8 型 FPD 神经退行性变的共同病因6,7,8。
LRRK2 是一种大型蛋白（2,527 个氨基酸），包含富含亮氨酸重复序列结构域、复杂蛋白 Ras 的 GTP 结合（ROC）结构域、ROC 的 C 末端（COR）结构域、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域以及 WD40 重复结构域98个家族性帕金森病（FPD）突变位于这些功能域中：ROC域中的N1437H和R1441C/G/H/S，COR域中的Y1699C，激酶域中的G2019S和I2020T。由于G2019S突变是帕金森病（PD）患者中最常见的突变10,11,12，使 LRRK2 的激酶活性增加 2 - 3 倍 体外13因此推测，LRRK2底物的磷酸化水平异常升高对神经元具有毒性。然而，由于缺乏可用于评估患者来源样本中生理相关LRRK2底物磷酸化水平的方法，目前尚无法研究家族性或散发性帕金森病患者体内此类底物的磷酸化状态是否发生改变。
蛋白质磷酸化通常通过使用特异性识别蛋白质磷酸化状态的抗体进行免疫印迹或酶联免疫吸附测定（ELISA），或通过质谱分析来检测。然而，由于制备磷酸化特异性抗体存在困难，前述方法有时无法应用。当磷酸化特异性抗体不易获得时，使用放射性磷酸盐对细胞进行代谢标记是另一种可用于检测磷酸化生理水平的方法。但该方法需要大量放射性材料，因而涉及放射防护所需的专用设备14。与这些免疫化学方法相比，质谱分析更为灵敏，现已成为分析蛋白质磷酸化的常用方法。然而，样品制备过程耗时，且分析需要昂贵的仪器。
最近的一项大规模磷酸化蛋白质组学分析表明，包括 Rab10 和 Rab8 在内的 Rab GTP 酶家族的一个亚群是 LRRK2 的直接生理底物15。随后，我们证实了在携带家族性帕金森病（FPD）突变的小鼠胚胎成纤维细胞以及基因敲入小鼠的肺组织中，Rab10 的磷酸化水平升高16。在本报告中，我们选择采用一种基于十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）的方法，即将磷酸结合标签（P-tag）分子共聚到 SDS-PAGE 凝胶中（P-tag SDS-PAGE），用于检测内源性 Rab10 磷酸化水平，原因是目前仍缺乏高灵敏度的、特异性识别磷酸化 Rab10 的抗体。由于现有针对总 Rab8 的抗体选择性较差，我们未能检测到内源性 Rab8 的磷酸化。因此，我们决定专注于 Rab10 磷酸化的研究。LRRK2 在 Rab10 高度保守的“switch II”区域中部的 Thr73 位点对其进行磷酸化。Rab 蛋白中磷酸化位点的高度保守性可能是难以制备出能够区分不同 Rab 蛋白的磷酸特异性抗体的原因之一。
LRRK2 对 Rab8A 的磷酸化会抑制 Rabin8（一种鸟嘌呤核苷酸交换因子，GEF）的结合，而 Rabin8 通过将 Rab8A 结合的 GDP 交换为 GTP 来激活 Rab8A15。LRRK2 对 Rab10 和 Rab8A 的磷酸化还会抑制 GDP 解离抑制因子（GDI）的结合，GDI 对 Rab 蛋白的活化至关重要，其作用是将结合 GDP 的 Rab 蛋白从膜上提取出来15。综上所述，目前推测 LRRK2 对 Rab 蛋白的磷酸化可阻止其活化，但该磷酸化作用的具体分子机制及其生理后果仍不明确。
P-tag SDS-PAGE 由 Kinoshita 发明 等人 2006年：该方法中，丙烯酰胺与P-tag（一种高亲和力结合磷酸基团的分子）共价偶联，并共聚进入SDS-PAGE凝胶17由于 SDS-PAGE 凝胶中的 P-tag 分子可选择性地延缓磷酸化蛋白的电泳迁移，因此 P-tag SDS-PAGE 能够将磷酸化蛋白与非磷酸化蛋白分离开来（图1）。如果目标蛋白在多个位点发生磷酸化，则会观察到对应于不同磷酸化形式的梯形条带。对于Rab10，我们仅观察到一条发生迁移的条带，表明Rab10仅在Thr73位点被磷酸化。与使用磷酸化特异性抗体进行免疫印迹相比，P-tag SDS-PAGE的主要优势在于，可利用非磷酸化特异性抗体通过免疫印迹检测磷酸化的Rab10。即在膜转移后使用识别总Rab10的抗体进行检测，该方法通常具有更高的特异性、灵敏度，并可从商业或学术来源获得。使用P-tag SDS-PAGE的另一个优势在于，能够近似估算磷酸化的化学计量比，而这是使用磷酸化特异性抗体进行免疫印迹或通过放射性磷酸盐代谢标记细胞所无法实现的。
除了使用低成本的P-tag丙烯酰胺及其相关的某些微小修改外，本方法中检测LRRK2对Rab10的磷酸化遵循常规的免疫印迹（immunoblotting）通用操作流程。因此，对于任何常规开展免疫印迹实验的实验室而言，该方法应具有操作简便、易于实施的特点，适用于包括纯化蛋白、细胞裂解液和组织匀浆在内的各类样本。
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方案
1. P-tag SDS–PAGE 样品制备
- 从培养细胞的10 cm培养皿中用吸管吸除并弃去培养基，加入5 mL杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS），沿培养皿侧边加入以避免扰动细胞层，手动前后摇晃培养皿数次以洗涤细胞。
- 用吸管吸除并弃去 DPBS，加入 2 mL 用 DPBS 稀释的 0.25% (w/v) 胰蛋白酶，轻轻摇晃培养皿使细胞层充分覆盖。将培养皿放入 CO2 培养箱（37 °C，加湿空气，5% CO₂25 分钟
- 使用一次性移液器反复吹打以分散悬浮的脱落细胞后，将细胞悬液收集至15 mL离心管中，并在显微镜下使用血细胞计数板测定细胞密度。18.
- 将细胞稀释至2.5 × 105 细胞/mL，使用添加10%（v/v）胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） 100 µg/mL 链霉素。加入 2 mL（5 × 105 将稀释后的细胞悬液各100 μL加入6孔板的每个孔中。
- 在 CO₂ 培养箱中过夜培养细胞2 培养箱（37 °C，加湿空气，5% CO2).
- 转染至 HEK293 细胞
注意：若需检测内源性 Rab10 的磷酸化，请继续执行步骤 1.7。本实验方案所用质粒可应要求向作者索取。参见 材料表 简要信息及 图S1 因其DNA序列。- 分装 200 µL 将DMEM加入1.5 mL离心管中。
- 向每支试管中加入两者 0.266 µg （终浓度 1.33 µg/mL编码HA-Rab10的质粒的） 1.066 µg （终浓度为 5.33 µg/mL编码3的质粒的）×FLAG-LRRK2 来自 500 µg/mL 质粒储备液。然后加入 4 µL 1 mg/mL 聚乙烯亚胺溶液（溶于 20 mM HEPES-NaOH，pH 7.0）并立即涡旋混匀 5 秒。
- 将离心管于室温静置10分钟，使用移液器将其中一管的内容物逐滴加入一个孔中。轻轻手动来回摇动培养板数次，使转染混合物在孔内均匀扩散。
- 让细胞在CO₂培养箱中继续培养24–36小时。2 培养箱（37 °C，加湿空气，5% CO₂2).
- 若需检测内源性Rab10的磷酸化水平，应在细胞裂解前使用或不使用LRRK2抑制剂处理细胞1小时。
- 通过将 LRRK2 抑制剂溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，配制浓度为 10 mM 的储备液。推荐使用高度特异且高效的 LRRK2 抑制剂 MLi-2 和 GSK2578215A。将储备液保存于 -80 °C.
- 使用 DMSO 稀释储备液来配制抑制剂的工作液：对于 MLi-2，配制 10 µM 和 30 µM 分别用于内源性和过表达的 LRRK2。对于 GSK2578215A，分别配制 1 mM 和 3 mM 的溶液，用于内源性和过表达的 LRRK2。
- 添加 2 µL 使用移液器将 MLi-2 或 GSK2578215A 工作液的适量加入到孔板中某一孔的中央，然后手动轻轻前后摇晃孔板数次，使抑制剂在孔内均匀扩散。
- 添加 2 µL 将DMSO加入另一个孔中作为阴性对照，操作方式与步骤1.8.3中的抑制剂处理类似。
- 将培养板放回培养箱，继续培养细胞1小时。
- 裂解细胞。
- 将培养板置于冰上。移除并弃去培养基。沿培养皿侧壁加入 2 mL DPBS，避免扰动细胞层，手动轻轻左右摇晃培养皿数次，以洗涤细胞。
- 移除并弃去 DPBS，然后向细胞中加入 100 µL 裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5，1% (v/v) 聚氧乙烯(10)辛基苯基醚，1 mM EGTA（乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸），1 mM 原钒酸钠，50 mM 氟化钠，10 mM β-甘油磷酸，5 mM 焦磷酸钠 0.1 µg/mL 微囊藻素-LR，270 mM 蔗糖，蛋白酶抑制剂混合物
- 将培养板倾斜置于冰上，使用细胞刮棒刮取细胞，以收集尽可能多的细胞裂解液。用移液器将裂解液收集至预冷的1.5 mL离心管中（冰上预冷）。
注意：微囊藻毒素-LR 若被吞食或接触皮肤，可能致命。
- 将离心管置于冰上静置10分钟，以确保充分裂解。通过离心（20,000 ×g，4 °C，10分钟）澄清细胞裂解液。 × g，10 分钟 4 °C）并将上清液转移至预冷于冰上的新1.5 mL离心管中。
- 测定蛋白浓度µg/µL通过Bradford法测定澄清裂解液的蛋白浓度。
- 用蒸馏水将牛血清白蛋白（BSA）储备液稀释，配制 BSA 标准品（0.2、0.4、0.6、0.8 和 1 mg/mL）。用蒸馏水将澄清的细胞裂解液稀释 20 倍。
- 将 5 µL/well 将BSA标准品、空白对照（蒸馏水）及各稀释细胞裂解液分别设三个复孔，加入96孔板中。
- 添加 150 µL/well 使用12通道微量移液器加入Bradford测定试剂，室温静置5分钟。
- 在酶标仪上测定595 nm处的吸光度，并与BSA标准品进行比较。
- 准备 100 µL 用于 SDS-PAGE 的样品。样品的蛋白质浓度为 1 µg/µL 用于过表达的 HA-Rab10 及 2 µg/µL 内源性 Rab10。
- 根据步骤 1.11.4 中量化的浓度，计算体积（µL细胞裂解液的等量部分 100 µg （过表达的 HA-Rab10）或 200 µg （内源性 Rab10）通过将蛋白量（100 µg 或 200 µg)除以裂解液的蛋白浓度（µg/µL).
- 添加 25 µL 4 分之 1× Laemmli SDS-PAGE 上样缓冲液（62.5 mM Tris-HCl，pH 6.8，8% (w/v) SDS，40% (v/v) 甘油，0.02% (w/v) 溴酚蓝，4% (v/v) β-巯基乙醇）转移至室温下放置的新的1.5 mL离心管中。
- 加入计算好的细胞裂解物体积至各离心管中，室温下涡旋混匀5秒。
- 将总体积调至 100 µL 用裂解缓冲液重悬，并在室温下涡旋振荡5秒。
- 补充 10 mM MnCl2 以淬灭螯合剂。加入 1 µL 500 mM MnCl₂2. 室温下涡旋振荡混匀5秒。
注意：含有 MnCl₂ 的样本2 可能不适用于常规SDS-PAGE。此步骤是必需的，因为存在螯合剂（如乙二胺四乙酸（EDTA）、EGTA）。 等等。)于裂解缓冲液中。否则，Mn2+ 与P-tag丙烯酰胺偶联的金属离子会被螯合剂解离，导致P-tag SDS-PAGE无法正常工作。 - 将所有样品煮沸 100 °C 5 分钟，并将样品保存在 -20 °C 直至使用。煮沸后的样品可保存至少6个月。
2. 制备用于P-tag SDS-PAGE的凝胶
注意：凝胶应在与电泳同一天制备。制胶过程可在常光条件下进行。
- 首先将10 mg P-tag丙烯酰胺粉末/固体完全溶解于100 µL甲醇中，然后加入重蒸水定容至3.3 mL，配制5 mM P-tag丙烯酰胺储备液。
注意：P-tag丙烯酰胺对光敏感。配制好的溶液应避光保存于4 °C，直至使用。 - 用70%乙醇喷洒玻璃板（平板和带缺口板），并用纸巾擦拭清洁。组装凝胶板。本方案所用凝胶板尺寸为长80或100 mm、宽100 mm。将洁净的硅胶垫片置于平板与带缺口板之间，并用文件夹夹紧组装好的凝胶板。
注意：任何适用于常规SDS-PAGE的凝胶板均可使用。 - 将待用的梳子（17孔塑料梳）插入已组装的凝胶板中，并用永久性记号笔在凝胶板上标记梳齿底部对应的位置。
- 在15 mL离心管中配制10 mL 10%丙烯酰胺凝胶混合液（10% (w/v) 丙烯酰胺（丙烯酰胺:双丙烯酰胺 = 29:1），375 mM Tris-HCl (pH 8.8)，0.1% (w/v) SDS）。
注意：丙烯酰胺的最佳浓度可能因所用试剂不同而有所变化。此时不应加入四甲基乙二胺（TEMED）和过硫酸铵（APS）。 - 加入100 µL 5 mM P-tag丙烯酰胺溶液和10 µL 1 M MnCl2溶液，使其终浓度分别为50 µM和100 µM。
注意：P-tag丙烯酰胺和MnCl2的最佳浓度也可能因所用试剂不同而有所变化。 - 向凝胶混合液中加入15 µL TEMED（终浓度0.15% (v/v)），然后加入50 µL 10% (w/v) APS（终浓度0.05% (w/v)）。轻轻旋转混匀5秒，立即倒入已组装的凝胶板中，液面高度应低于第2.3步标记位置2 mm。
- 轻轻在凝胶溶液上层覆盖异丙醇，以使分离胶表面平整。
- 室温静置30分钟使凝胶聚合。此步骤无需避光。
注意：在低温环境下，凝胶聚合时间可能延长。在加入TEMED和APS前对凝胶混合液进行脱气处理有助于加快聚合速度。为此，可将凝胶混合液置于100–200 mL锥形瓶中并连接抽滤装置，抽气脱气10分钟。 - 用纸巾吸除上层覆盖的异丙醇。
- 用洗瓶向凝胶上层空间加满蒸馏水清洗，然后倾倒至废液盆中弃去。重复清洗3次。
- 用纸巾吸除凝胶上层空间残留的水分。
- 在15 mL离心管中配制3 mL 4%丙烯酰胺浓缩胶混合液（4% (w/v) 丙烯酰胺（丙烯酰胺:双丙烯酰胺 = 29:1），125 mM Tris-HCl (pH 6.8)，0.1% (w/v) SDS）。
注意：浓缩胶混合液中不得加入P-tag丙烯酰胺或MnCl2溶液。 - 加入7.5 µL TEMED和24 µL 10% (w/v) APS，使其终浓度分别为0.25% (v/v)和0.08% (w/v)。轻轻旋转混匀5秒，将混合液倒入分离胶上方。立即插入合适的梳子（例如可容纳最多25 µL样品的17孔塑料梳）。
- 室温静置30分钟使浓缩胶聚合。此步骤无需避光。浓缩胶聚合完成后应立即使用，不宜长期保存。
3. SDS–PAGE 和免疫印迹
- 从凝胶中取出梳子，然后移除硅胶垫片，再取下凝胶的夹子。
- 将制备好的凝胶放入电泳槽中，并用长尾夹夹紧固定。
- 在凝胶的上下槽中加入电泳缓冲液（25 mM Tris，192 mM Glycine，0.1% (w/v) SDS）。使用5 mL注射器和21G针头以电泳缓冲液冲洗加样孔，以去除凝胶碎屑。
- 使用连接在注射器上的弯头针去除凝胶底部空间的气泡。制作弯头针的方法是：手动将21G针头的中部弯曲，使针尖与针座之间的角度变为30-45 °.
- 离心沉淀因加入 MnCl₂ 而产生2 在 20,000 × 室温下离心 1 分钟，转速为 g，以获得澄清的样品。
- 上样 10 µg 用于检测过表达 Rab10 磷酸化的蛋白质 30 µg 内源性 Rab10 蛋白
注意：必须在所有孔中加入等体积的样品。空泳道应加入 1× Laemmli SDS-PAGE 上样缓冲液。如果样品中含有 MnCl₂2，加入相同浓度的 MnCl₂2 到空白样品。 - 应向加载了分子量标记物（MWM）的加样孔中补充1× Laemmli SDS-PAGE 上样缓冲液，以确保所有泳道中上样的样品体积相同。
注意：同样，如果样品中含有 MnCl₂2，加入相同浓度的 MnCl₂2 加入不含EDTA的MWM。或者，可以使用不含EDTA的MWM。 - 以50 V电压进行浓缩电泳（约30分钟），直至染料前沿进入分离胶。
- 样品浓缩后，将电压调至120 V进行分离，直至染料前沿迁移至凝胶底部（对于80 mm和100 mm长的凝胶，分别约需50和80分钟）。
注意：MWM 的迁移模式与常规 SDS-PAGE 凝胶上的迁移模式预期不同。不应将其用于 P-tag SDS-PAGE 凝胶上蛋白质分子量的估算，但可用于检测 P-tag 凝胶的重复性。参考 讨论 详情请见。 - 用去离子水洗涤凝胶以去除 MnCl₂2 从凝胶中。
- 将含有10 mM EDTA和0.05% (w/v) SDS的转移缓冲液（48 mM Tris，39 mM 甘氨酸，20% (v/v) 甲醇）倒入容器中例如，大号称量舟）。缓冲液体积应足以浸没凝胶。
- 从玻璃板上取下分离胶，每块胶放入一个容器中。弃去浓缩胶。
- 将凝胶置于摇床（约60 rpm）上，室温孵育10分钟。
- 重复洗涤步骤，共 3 次。
注意：每次洗涤均需使用新鲜缓冲液。 - 用含有0.05%（w/v）SDS的转移缓冲液将凝胶洗涤一次，每次10分钟，以去除EDTA。缓冲液体积应足以覆盖凝胶。
- 使用湿转法将蛋白电转移至硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。
- 将一张滤纸（10 × 7 cm）置于用于转膜的海绵垫上。将凝胶放置在滤纸上，确保滤纸与凝胶之间无气泡。
- 将一张膜（10 × 7 cm）置于凝胶上，并确保凝胶与膜之间无气泡。
- 在膜上再放置一张滤纸（10 × 7 cm），并再次确保膜与滤纸之间无气泡。
- 在滤纸上再放一块海绵垫。将膜/滤纸叠层放入转移用胶片夹中。
- 将凝胶 cassette 置于转膜槽中，确保膜位于凝胶与带正电的阳极之间。
- 将电泳槽连接至电源，并将其放入装有冰水的聚苯乙烯泡沫箱中。以100 V电压开始电转，持续180分钟。
注意：由于P-tag SDS-PAGE凝胶中的蛋白质转膜效率低于常规SDS-PAGE凝胶，因此需要延长转膜时间。转膜过程中必须有效冷却，以避免凝胶融化。
- 检查转膜
- 用镊子将膜从凝胶上取下，放入塑料容器中，并用丽春红S溶液（0.1% (w/v) 丽春红S，5% (v/v) 乙酸）浸泡，以染色膜上转移的蛋白质。溶液用量应足以覆盖整张膜。
- 室温下手动摇晃孵育膜1分钟。
注意：每个泳道中均应出现一条条带梯。 - 用镊子将膜从染色液中取出，观察每个加样泳道中的条带梯度是否呈现均匀的模式和强度。
- 染色观察后，移除染色液，加入 TBST 缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 7.4，150 mM NaCl，0.1% (v/v) 聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯）。缓冲液体积应足以覆盖膜。
注意：Ponceau S 溶液可收集并重复使用数次。 - 在室温下，将膜置于TBST中，在摇床上轻轻摇动（约60 rpm），直至膜上无可见条带残留。
- 用新鲜的TBST重复洗涤步骤，持续5分钟。
- 移除并弃去 TBST。加入含 5% (w/v) 脱脂奶粉的 TBST 溶液进行封闭，于室温在摇床（约 60 rpm）上孵育 1 小时。封闭液体积应足以覆盖膜。
- 将一抗（检测内源性 Rab10 使用抗 Rab10 抗体，检测过表达 HA-Rab10 使用抗 HA 抗体）用封闭液按每张膜 10 mL 的量稀释，制备一抗溶液（参见 材料表 用于浓度。
- 移除并弃去封闭液，加入一抗。将膜置于摇床上（约60 rpm）于4°C孵育过夜 4 °C.
- 移除一抗溶液，加入 TBST 洗涤膜。缓冲液体积应足以覆盖膜。
- 将膜在室温下置于摇床上孵育5分钟（约60转/分钟）。每次使用新鲜TBST重复洗涤（步骤3.16）共3次。
- 按每张膜10 mL的量，用封闭液稀释辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，配制二抗溶液。对于使用抗Rab10抗体孵育的膜，采用HRP标记的抗兔IgG抗体；对于使用抗HA抗体孵育的膜，采用HRP标记的抗小鼠IgG抗体（参见 材料表 用于浓度测定）。
- 第三次洗涤后，移除并弃去 TBST，加入二抗溶液。将膜置于摇床（约 60 rpm）上，室温孵育 1 小时。
- 用 TBST 清洗膜 10 分钟。重复该清洗步骤共 3 次，方法同 3.17 步。
- 使用增强化学发光（ECL）显影膜。
注意：曝光时间可能因所使用的ECL溶液和化学发光检测系统而异。- 打开配备电荷耦合器件（CCD）相机及与成像仪相连的计算机。启动成像仪的控制软件。等待CCD相机温度降至-25 °C.
- 将1 mL ECL溶液置于实验台铺好的塑料膜上，用于一张膜。
- 将膜的凝胶面朝上置于ECL溶液中，然后迅速翻转，使膜的两面均被溶液覆盖。
- 将膜取出，使膜的一侧接触纸巾5秒以沥干。
- 将膜置于透明薄膜之间（例如，透明纸袋
注意：不建议使用塑料膜包裹膜。用于包裹膜的透明薄膜应尽可能平整，无可见皱褶，以避免背景不均。 - 将膜置于黑色托盘上。将托盘放入成像仪中并关闭门。
- 点击 "聚焦" 控制软件窗口中的按钮。检查膜是否正确放置。单击 "返回" 按钮
- 选择 "精确度" 用于 "曝光类型"选择 "手册" 用于 "曝光时间" 并将曝光时间设置为 1 s。
- 选择 "高" 用于 "灵敏度/分辨率". 离开 "添加数字化图像" 未选中。点击 "开始" 点击按钮以拍摄图像。
- 将计算机显示屏上出现的图像以 TIFF 文件格式保存。
- 以曝光时间1、3、10、30、60、90、120、150秒直至180秒依次重复拍摄图像。在拍摄最后一张图像时，检查 "添加数字化图像" 因此可以同时获取膜的数字图像，而非化学发光图像。
- 选择在目标条带范围内具有最大动态范围且无任何饱和像素（以红色显示）的最佳图像。
注：也可使用常规X射线胶片进行检测19.
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结果
过表达系统：在 HEK293 细胞中由 3×FLAG-LRRK2 介导的 HA-Rab10 磷酸化
将0.266 µg的HA-Rab10野生型质粒与1.066 µg的3×FLAG-LRRK2（野生型、激酶失活突变体（K1906M）或FPD突变体）共转染至HEK293细胞中。通过P-tag SDS-PAGE结合抗HA抗体免疫印迹检测Rab10的磷酸化水平（图2）。取10 µg蛋白样品加载于含50 µM P-tag丙烯酰胺和100 µM MnCl2的10%凝胶（80 × 100 × 1 mm）中进行电泳。P-tag凝胶成像（上图）使用标准ECL溶液，曝光时间为10秒。LRRK2与Rab10共表达导致P-tag凝胶中出现条带迁移（上图中以空心圆圈标示；比较第2和第4泳道）。相比之下，与激酶失活突变体（K1906M）LRRK2共表达则未能改变Rab10的迁移率（比较第4和第5泳道），表...
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讨论
本文介绍了一种基于P-tag方法检测LRRK2在内源性水平下对Rab10磷酸化的简便且可靠的检测方法。由于目前可用的抗磷酸化Rab10抗体仅适用于过表达的蛋白15，因此利用P-tag SDS-PAGE的本方法是评估内源性Rab10磷酸化水平的唯一途径。此外，本方法还可用于估算细胞中Rab10磷酸化的化学计量比。由于P-tag方法可广泛适用于多种磷酸化蛋白，本实验方案可作为建立其他磷酸化蛋白类似检测方法的“原型”。
本方案的关键步骤是凝胶的制备和样品的准备。P-tag 丙烯酰胺是一种相对光不稳定的试剂，长期在 4 °C 储存后，其延缓磷酸化蛋白电泳迁移能力有时会丧失。研究人员应特别注意避免将 P-tag 丙烯酰胺暴露于光照下。此外，P-tag 分子需要与 Mn2+ 离子形成复合物，以捕获磷酸基团。因此，样品中不应含有 EDTA 等螯合剂，这类物质是市售 SDS-PAGE 样品缓冲液的常见成分。我们建议使用经典的 Laemmli 样品缓冲液来制备适用于 P-tag SDS-PAGE 的样品。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢日本东京大学的Takeshi Iwatsubo博士慷慨提供编码3xFLAG-LRRK2野生型及突变体的质粒。我们还感谢英国邓迪大学的Dario Alessi博士慷慨提供MLi-2以及编码HA-Rab10的质粒。本研究由日本学术振兴会（JSPS）科研费补助金JP17K08265（G.I.）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| 杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS） | 自制 | 150 mM NaCl, 8 mM Na2HPO4-12H2O, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4 在MilliQ水中溶解，并通过高压灭菌。 | |
| 氯化钠 | Nacalai Tesque | 31320-34 | |
| 十二水合磷酸氢二钠 | 和光 | 196-02835 | |
| 氯化钾 | 和光 | 163-03545 | |
| 磷酸二氢钾 | 和光 | 169-04245 | |
| 2.5% 胰蛋白酶（10倍浓缩） | Sigma-Aldrich | T4549 | 用无菌 DPBS 稀释 10 倍，以配制工作液 |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基 (DMEM) | 和光 | 044-29765 | |
| 胎牛血清 | BioWest | S1560 | 热失活于 56 °C 30 分钟 |
| 青霉素-链霉素（100倍浓缩液） | 和光 | 168-23191 | |
| HEPES | 和光 | 342-01375 | |
| 氢氧化钠 | 和光 | 198-13765 | |
| 聚乙烯亚胺盐酸盐 MAX，线性，分子量 40,000（PEI MAX 40000） | PolySciences, Inc. | 24765-1 | 将储备液溶于20 mM HEPES-NaOH（pH 7.0）中，浓度为1 mg/mL，随后用NaOH将pH调至7.0 |
| 二甲基亚砜 | 和光 | 045-28335 | |
| Tris | STAR | RSP-THA500G | |
| 盐酸 | 和光 | 080-01066 | |
| 聚氧乙烯(10)辛基苯基醚 | 和光 | 160-24751 | 等同于 Triton X-100 |
| 乙二醇双(2-氨基乙基醚)-N,N,N’, N’四乙酸（EGTA） | 和光 | 346-01312 | |
| 正钒酸钠(V) | 和光 | 198-09752 | |
| 氟化钠 | 关东化学 | 37174-20 | |
| β二水合磷酸甘油酸二钠盐五水合物 | Nacalai Tesque | 17103-82 | |
| 十水合焦磷酸钠 | Kokusan Chemical | 2113899 | |
| 微囊藻毒素-LR | 和光 | 136-12241 | |
| 蔗糖 | 和光 | 196-00015 | |
| 完全不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物 | 罗氏 | 11873580001 | 将一片溶于 1 mL 水中，可于 -20 °C 一个月。用于细胞裂解时按1:50稀释使用 |
| Pierce 考马斯亮蓝（Bradford）蛋白质检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23200 | |
| 十二烷基硫酸钠 | Nacalai Tesque | 31607-65 | |
| 甘油 | 和光 | 075-00616 | |
| 溴酚蓝 | 和光 | 021-02911 | |
| β-巯基乙醇 | 关东化学 | 25099-00 | |
| 乙醇 | 和光 | 056-06967 | |
| 甲醇 | 和光 | 136-01837 | |
| 磷酸结合标签丙烯酰胺 | 和光 | AAL-107 | P-tag 丙烯酰胺 |
| 40% (w/v) 丙烯酰胺溶液 | Nacalai Tesque | 06119-45 | 丙烯酰胺:Bis = 29:1 |
| 四甲基乙二胺（TEMED） | Nacalai Tesque | 33401-72 | |
| 过硫酸铵（APS） | 和光 | 016-08021 | 将过硫酸铵粉末溶于MilliQ水中，配制成10% (w/v) 溶液 |
| 2-丙醇 | 和光 | 166-04831 | |
| 四水合氯化锰 | Sigma-Aldrich | M3634 | |
| Precision Plus Protein 预染标准蛋白 | Bio-Rad | 1610374, 1610373, 1610377 | 本方案中使用的分子量标记物 |
| WIDE-VIEW 预染蛋白分子量标准 III | 和光 | 230-02461 | |
| 甘氨酸 | Nacalai Tesque | 17109-64 | |
| Amersham Protran NC 0.45 | GE Healthcare | 10600007 | 硝酸纤维素膜 |
| Durapore 膜滤器 | EMD Millipore | GVHP00010 | PVDF 膜 |
| 滤纸，编号1 | Advantec | 00013600 | |
| Ponceau S | Nacalai Tesque | 28322-72 | |
| 乙酸 | 和光 | 017-00251 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | 聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯 |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | 和光 | 345-01865 | |
| 脱脂奶粉 | Difco Laboratories | 232100 | |
| Immunostar | 和光 | 291-55203 | ECL 溶液（普通灵敏度） |
| Immunostar LD | 和光 | 290-69904 | ECL 溶液（高灵敏度） |
| 考马斯亮蓝染色液 | 自制 | 1 g 考马斯亮蓝 R-250，溶于含 50% (v/v) 甲醇和 10% (v/v) 乙酸的 1 L MilliQ 水中 | |
| 考马斯亮蓝 R-250 | 和光 | 031-17922 | |
| 考马斯亮蓝脱色液 | 自制 | 12% (v/v) 甲醇，7% (v/v) 乙酸，溶于 1 L MilliQ 水中 | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
| 抗体 | |||
| 抗HA抗体 | Sigma-Aldrich | 11583816001 | 使用于 0.2 μg/mL 用于免疫印迹。 |
| 抗Rab10抗体 | 细胞信号传导技术 | #8127 | 免疫印迹中按1:1000稀释使用。 特异性经Ito等在Biochem J, 2016中通过CRISPR KO验证。 |
| 抗pSer935抗体 | Abcam | ab133450 | 使用于 1 μg/mL 用于免疫印迹。 |
| 抗LRRK2抗体 | Abcam | ab133518 | 使用于 1 μg/mL 用于免疫印迹。 |
| 抗-α-微管蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | T9026 | 使用于 1 μg/mL 用于免疫印迹。 |
| 抗GAPDH抗体 | Santa-Cruz | sc-32233 | 使用于 0.02 μg/mL 用于免疫印迹。 |
| 过氧化物酶标记的AffiniPure羊抗小鼠IgG（H+L） | Jackson ImmunoResearch | 515-035-003 | 使用于 0.16 μg/mL 用于免疫印迹。 |
| 辣根过氧化物酶标记的AffiniPure山羊抗兔IgG（H+L） | Jackson ImmunoResearch | 111-035-003 | 使用于 0.16 μg/mL 用于免疫印迹。 |
| 名称 | 公司 | 目录号 | 评论 |
| 抑制剂 | |||
| GSK2578215A | MedChem Express | HY-13237 | 储备液用DMSO配制成10 mM，储存于-80 °C |
| MLi-2 | 由达里奥·阿莱西博士（邓迪大学）提供 | 储备液用DMSO配制成10 mM，保存于-80 °C | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
| 质粒 | |||
| Rab10/pcDNA5 FRT TO HA | 由 Dario Alessi 博士提供 (University of Dundee) | 该质粒表达氨基末端带有HA标签的人源Rab10。 | |
| LRRK2 WT/p3xFLAG-CMV-10 | 由东京大学的Dr Takeshi Iwatsubo提供 | 伊藤等人，生物化学，46：1380–1388 (2007)。该质粒表达氨基末端带有3xFLAG标签的野生型人LRRK2。 | |
| LRRK2 K1906M/p3xFLAG-CMV-10 | 由东京大学的Dr Takeshi Iwatsubo提供 | 伊藤等人，生物化学，46：1380–1388 (2007)。该质粒表达氨基末端带3xFLAG标签的人源LRRK2 K1906M激酶失活突变体。 | |
| LRRK2 N1437H/p3xFLAG-CMV-10 | 本文。该质粒表达人 LRRK2 的氨基末端 3xFLAG 标签 N1437H 家族性帕金森病突变体。 | ||
| LRRK2 R1441C/p3xFLAG-CMV-10 | 由东京大学的Dr Takeshi Iwatsubo提供 | 上村等，生物化学，48：10963–10975（2013）。该质粒表达人源LRRK2的氨基末端带3xFLAG标签的R1441C家族性帕金森病突变体。 | |
| LRRK2 R1441G/p3xFLAG-CMV-10 | 由东京大学的Dr Takeshi Iwatsubo提供 | Kamikawaji 等，Biochemistry，48：10963–10975 (2013)。该质粒表达氨基末端带3xFLAG标签的人源LRRK2的R1441G家族性帕金森病突变体。 | |
| LRRK2 R1441H/p3xFLAG-CMV-10 | 由东京大学的Dr Takeshi Iwatsubo提供 | 上村等，生物化学，48：10963–10975 (2013)。该质粒表达氨基末端带3xFLAG标签的人源LRRK2的R1441H家族性帕金森病突变体。 | |
| LRRK2 R1441S/p3xFLAG-CMV-10 | 本文。该质粒表达人源 LRRK2 的氨基末端 3xFLAG 标签标记的 R1441S 家族性帕金森病突变体。 | ||
| LRRK2 Y1699C/p3xFLAG-CMV-10 | 由东京大学的Dr Takeshi Iwatsubo提供 | 上村等，生物化学，48：10963–10975（2013）。该质粒表达氨基末端带3xFLAG标签的人源LRRK2 Y1699C家族性帕金森病突变体。 | |
| LRRK2 G2019S/p3xFLAG-CMV-10 | 由东京大学伊庭嶋武教授提供 | Kamikawaji 等，Biochemistry，48：10963–10975 (2013)。该质粒表达人源 LRRK2 的氨基末端 3xFLAG 标签 G2019S 家族性帕金森病突变体。 | |
| LRRK2 I2020T/p3xFLAG-CMV-10 | 由东京大学的Dr Takeshi Iwatsubo提供 | 上村等，生物化学，48：10963–10975（2013）。该质粒表达人源LRRK2的氨基末端带3xFLAG标签的I2020T家族性帕金森病突变体。 | |
| 名称 | 公司 | 目录号 | 评论 |
| 仪器设备 | |||
| CO2 培养箱 | 赛默飞世尔科技 | Forma Series II 3110 水套式培养箱 | |
| 自动移液器 | Drummond | Pipet-Aid PA-400 | |
| 微量移液器 P10 | Nichiryo | 00-NPX2-10 | 0.5–10 μL |
| 微量移液器 P200 | Nichiryo | 00-NPX2-200 | 20–200 μL |
| 移液器 P1000 | Nichiryo | 00-NPX2-1000 | 100–1000 μL |
| 微量移液器 P10 使用技巧 | STAR | RST-481LCRST | 无菌 |
| P200 微量移液器使用技巧 | 福井启介 | 1201-705YS | 无菌 |
| P1000 微量移液器使用技巧 | STAR | RST-4810BRST | 无菌 |
| 5 mL 一次性移液管 | Greiner | 606180 | 无菌 |
| 10 mL 一次性移液管 | Greiner | 607180 | 无菌 |
| 25 mL 一次性移液管 | 猎鹰 | 357535 | 无菌 |
| 血细胞计数板 | Sunlead Glass | A126 | 改良型血细胞计数板 |
| 显微镜 | Olympus | CKX53 | |
| 10 cm 培养皿 | 猎鹰 | 353003 | 用于组织培养 |
| 6孔板 | AGC Techno Glass | 3810-006 | 用于组织培养 |
| 涡旋混合器 | 科学工业公司 | Vortex-Genie 2 | |
| 细胞刮刀 | 住友电木 | MS-93100 | |
| 1.5 mL 离心管 | STAR | RSV-MTT1.5 | |
| 15 mL 离心管 | AGC Techno Glass | 2323-015 | |
| 50 mL 离心管 | AGC Techno Glass | 2343-050 | |
| 离心机 | TOMY | MX-307 | |
| 96孔板 | Greiner | 655061 | 不适用于组织培养 |
| 酶标仪 | Molecular Devices | SpectraMax M2e | |
| SDS–PAGE电泳槽 | 日本荣度 | NA-1010 | |
| 转移槽 | 日本荣度 | NA-1510B | |
| 凝胶板（带缺口） | 日本荣养 | NA-1000-1 | |
| 凝胶板（平滑） | 日本荣度 | NA-1000-2 | |
| 硅胶间隔片 | 日本荣养 | NA-1000-16 | |
| 17孔梳子 | 日本荣道 | 定制制作 | |
| 回形夹 | 日本荣度 | NA-1000-15 | |
| 5 mL 注射器 | Terumo | SS-05SZ | |
| 21G | Terumo | NN-2138R | |
| 电源站 1000 VC | ATTO | AE-8450 | SDS 电源供应器–PAGE 与转膜 |
| 大型称量舟 | 伊纳光学 | AS-DL | |
| 塑料容器 | AS ONE | PS 案例编号 4 | 10 x 80 x 50 mm |
| 摇床振荡器 | Titech | NR-10 | |
| 聚苯乙烯泡沫箱 | 通用 | 内部尺寸应能容纳一个转膜槽（200 × 250 × 250 mm）。 | |
| ImageQuant LAS-4000 | GE Healthcare | 配备冷却 CCD 相机用于 ECL 检测的成像仪 |
参考文献
- Sveinbjornsdottir, S. The clinical symptoms of Parkinson's disease. J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 318-324 (2016).
- Hernandez, D. G., Reed, X., Singleton, A. B. Genetics in Parkinson disease: Mendelian versus non-Mendelian inheritance. J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 59-74 (2016).
- Paisán-Ruíz, C., et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).
- Zimprich, A., et al. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).
- Gilks, W. P., et al. A common LRRK2 mutation in idiopathic Parkinson's disease. Lancet. 365 (9457), 415-416 (2005).
- Satake, W., et al. Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson's disease. Nat. Genet. 41 (12), 1303-1307 (2009).
- Simón-Sánchez, J., et al. Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson's disease. Nat. Genet. 41 (12), 1308-1312 (2009).
- Klein, C., Ziegler, A. Imputation of sequence variants for identification of genetic risks for Parkinson's disease: a meta-analysis of genome-wide association studies. Lancet. 377 (9766), 641-649 (2011).
- Cookson, M. R. The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson's disease. Nat. Rev. Neurosci. 11 (12), 791-797 (2010).
- Ozelius, L. J., et al. LRRK2 G2019S as a Cause of Parkinson’s Disease in Ashkenazi Jews. N. Engl. J. Med. 354 (4), 424-425 (2006).
- Lesage, S., et al. LRRK2 G2019S as a Cause of Parkinson’s Disease in North African Arabs. N. Engl. J. Med. 354 (4), 422-423 (2006).
- Bouhouche, A., et al. LRRK2 G2019S Mutation: Prevalence and Clinical Features in Moroccans with Parkinson's Disease. Parkinsons. Dis. , 1-7 (2017).
- West, A. B., et al. Parkinson's disease-associated mutations in leucine-rich repeat kinase 2 augment kinase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (46), 16842-16847 (2005).
- Ito, G., et al. GTP binding is essential to the protein kinase activity of LRRK2, a causative gene product for familial Parkinson's disease. Biochemistry. 46 (5), 1380-1388 (2007).
- Steger, M., et al. Phosphoproteomics reveals that Parkinson's disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases. Elife. 5, (2016).
- Ito, G., et al. Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors. Biochem. J. 473, 2671-2685 (2016).
- Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E., Takiyama, K., Koike, T. Phosphate-binding tag, a new tool to visualize phosphorylated proteins. Mol. Cell. Proteomics. 5 (4), 749-757 (2006).
- Database, J. S. E. Using a Hemacytometer to Count Cells. J. Vis. Exp. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2017).
- Ni, D., Xu, P., Gallagher, S. Immunoblotting and Immunodetection. Curr. Protoc. Mol. Biol. (114), 10.8.1-10.8.37 (2016).
- Reith, A. D., et al. GSK2578215A; a potent and highly selective 2-arylmethyloxy-5-substitutent-N-arylbenzamide LRRK2 kinase inhibitor. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22 (17), 5625-5629 (2012).
- Fell, M. J., et al. MLi-2, a potent, selective and centrally active compound for exploring the therapeutic potential and safety of LRRK2 kinase inhibition. J. Pharmacol. Exp. Ther. 355, 397-409 (2015).
- Dzamko, N., et al. Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization. Biochem. J. 430 (3), 405-413 (2010).
- Thévenet, J., Pescini Gobert, R., Hooft van Huijsduijnen , R., Wiessner, C., Sagot, Y. J. Regulation of LRRK2 expression points to a functional role in human monocyte maturation. PLoS One. 6 (6), e21519(2011).
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