方法文章

一种实时3D 单粒子跟踪协议

DOI：

10.3791/56711

⸱

2018年1月3日

 , 
1Department of Chemistry, Duke University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本协议详细介绍了一种 real-time 3D 单粒子跟踪显微镜的构造和操作, 能够跟踪高扩散速度和低光子计数率的纳米荧光探针。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

实时三维单粒子跟踪 (RT-3D-SPT) 有可能在蜂窝系统中对快速的3D 过程产生影响。尽管近年来提出了各种 RT-3D-SPT 方法, 但在低光子计数速率下跟踪高速3D 扩散粒子仍然是一个挑战。此外, RT-3D-SPT 设置通常是复杂和难以实施, 限制其广泛应用于生物问题。该协议提出了一个 RT-3D-SPT 系统, 名为3D 动态光子定位跟踪 (3 维 DyPLoT), 它可以跟踪高扩散速度 (高达20µm2/秒) 在低光子计数率 (下至10赫) 的粒子。3 d-DyPLoT 采用2D 电光偏转器 (2 d-爆炸物) 和可调谐的声学梯度 (标签) 镜头, 以驱动一个单一的聚焦激光点动态在3D。结合一种优化的位置估计算法, 3 维 DyPLoT 可以锁定在高跟踪速度和高定位精度的单粒子上。由于单一的励磁和单一的检测路径布局, 3 维 DyPLoT 是健壮的, 易于设置。本协议讨论如何逐步构建3维 DyPLoT。首先, 介绍了光学布局。然后, 通过光栅扫描190纳米荧光珠与压电 nanopositioner 对系统进行了标定和优化。最后, 为了证明 real-time 3D 跟踪能力, 110 nm 荧光珠在水中跟踪。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

先进的成像技术的出现, 打开了一个窗口, 看到更详细的细胞现象的结构, 一路下降到分子水平。方法如随机光学重建显微镜 (风暴)1,2,3, 照片激活的本地化显微镜 (PALM)4,5,6,7, 结构化照明显微镜 (SIM)8,9,10,11, 和受激辐射损耗显微镜 (STED)12,13, 14已经远远超出了衍射极限, 从而将空前的细节提供给了活细胞的结构和功能。然而, 充分了解这些系统的行为需要动态信息和结构信息。上面列出的超分辨率方法涉及空间分辨率和时间分辨率之间的权衡, 从而限制了动态过程的探测时间精度。提供高空间精度和时间分辨率的方法是 RT-3D-SPT15、16、17、18、19、20 21,22,23,2425262728在这里, 我们将传统的3维的30和 RT-3D-SPT 区分开来. 传统的3维单标需要一个时间序列的三维图像数据 (可以用共焦显微镜或荧光显微镜获取)给定正确的配置)。在传统的3维标度中, 通过在每个图像堆栈中定位粒子并在连续的卷中连接位置来创建轨迹, 来确定粒子的坐标。对于这些方法, 最终的时间分辨率取决于容积成像率。对于共焦显微镜, 这是很容易在几秒到几十秒的规模。对于荧光的方法 , 其中的光学路径纵 , 使轴向位置信息可以提取 , 时间分辨率是有限的相机曝光或读取时间。这些 epifluorescent 的方法是有限的范围内轴向信息可以收集, 虽然最近的进展, 在傅里叶平面相掩模设计和自适应光学是将这些范围扩展到10µm 或更多31,32,33,34。

相比之下, RT-3D-SPT 不依赖于获取3D 图像堆栈并在事实之后找到粒子。相反, real-time 的位置信息是通过单点检测器提取的, 通过使用高速压电阶段, 反馈被应用到有效地 "锁定" 物镜焦距中的粒子。这就允许连续测量粒子的位置限制, 只有多少光子可以收集。此外, 这种方法能够在粒子在长距离移动时对其进行光谱审讯。RT-3D-SPT 的效果类似于一个无力的纳米物体的光阱, 其中粒子是连续探测和测量在 real-time 不需要大的激光功率或光学力量。鉴于 RT-3D-SPT 提供了一种连续审讯快速扩散对象的方法 (最多20µm2/秒)25,29在低光子计数率三,20, 35, 它应提供一个窗口, 进入快速或瞬态的生物过程, 如细胞内货物运输, 配体受体结合, 和细胞外动力学的单一病毒。然而, 在这一点上, RT-3D-SPT 的应用仅限于少数几个致力于推动这一技术的团体。

一个障碍是 RT-3D-SPT 方法所要求的光学布局的复杂性, 这是多种多样的。对于大多数方法, 光反馈是由压电工作台提供的。当粒子在 X、Y 或 Z 中产生小的运动时, 从单点探测器的读数转换为错误函数, 并以高速向压电 nanopositioner, 这反过来又移动样品来抵消粒子的运动, 有效地将其锁定在相对于物镜的位置。要测量 X、Y 和 Z 中的小位置移动, 可以使用多个检测器 (4 或5取决于实现)15、18、21或多个励磁点 (2-4), 如果锁定放大器用于使用旋转激光光斑提取 X 和 Y 位置)25,28被应用。这些多个检测和发射点的重叠使得系统难以对齐和维护。

在这里, 我们提出了一个高速目标锁定 3 d-标的方法与简化光学设计称为 3 d-DyPLoT29。3 d-DyPLoT 使用 2 d-爆炸物和标记透镜36,37,38 , 以高速率 (50 赫 XY, 70 赫 Z) 动态移动聚焦激光光斑。结合激光聚焦位置和光子到达时间, 使粒子的3D 位置可以迅速获得, 即使在低光子计数率。2 d-爆炸物排爆行动驱动激光焦点在骑士的游览样式39以正方形大小 1 x 1 µm 在 x Y 平面和标记透镜移动激光焦点在轴向范围 2-4 µm。3D 粒子位置得到优化的位置估计算法29,40在3D。在现场可编程门阵列 (FPGA) 上对3D 动态移动光斑、雪崩光电二极管 (APD) 的光子计数、real-time 粒子位置计算、压电级反馈和数据记录进行了控制。在本协议中, 我们描述了如何建立一个3维 DyPLoT 显微镜 step-by 步, 包括光学对准, 校准与固定粒子, 最后自由粒子跟踪。作为一个示范, 110 纳米荧光珠连续跟踪在水中的时间分钟。

本文所描述的方法是一个理想的选择, 在任何应用, 它是希望连续监测快速移动荧光探针在低光水平, 包括病毒, 纳米颗粒, 和小泡, 如体。与以往的方法相比, 只有一个单一的励磁和单一的检测路径, 使对准和维护一目了然。此外, 这个大的探测区域使这个显微镜能够很容易地快速地拾取粒子, 而在低信号水平 (下至10赫) 跟踪的能力使得这种方法适合微光应用程序29。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 设置布局和对齐

  1. 跟踪励磁激光器的安装与准直
    1. 使用国产安装将激光器粘贴到光学工作台上。该安装是一个简单的铝板与安装孔的激光头和光学表。激光应牢固地附着在金属支架上, 以稳定散热。对于这项工作, 使用 488 nm 固体激光器照明 (图 1), 虽然波长可以选择适合特定的荧光或实验。一个关键的因素是, 激光波长适合 2 d-爆炸物的工作范围, 这是由两个器 (图 1: W2) 之间的波板主要确定。488 nm 激光可以有效激发绿色或黄色荧光蛋白 (GFP/YFP), 这是常见的荧光标签在活细胞实验。
    2. 使用一对介质镜像 (图 1: M) 调整激光束的高度和方向. 确保激光光束平行于光学工作台, 并将其调整到合适的高度。
      注: 应根据显微镜平台选择高度。对于本协议中使用的所有后续镜像, 都应保留此高度, 但不会明确声明。
    3. 准用一对透镜 (图 1: L1 和 L2) 对光束进行了分析。焦距的镜头, 应谨慎选择, 以避免激光斑点被修剪的光圈 2 d-爆炸物。通过 2 d-爆炸物排爆后, 激光束的形状变化明显。在这里的准直的质量是非常重要的, 因为像差将被随后的透镜放大, 任何分歧将恶化的性能 2 d-爆炸物的偏转。理想情况下, 通过将光束聚焦到至少20米以外的点来准光束。
  2. 将一个针孔 (图 1: PH) 放置在第一个准直透镜 (图 1: L1) 的焦点上。
    1. 选择合适尺寸的针孔。可根据以下计算选择针孔尺寸:
      figure-protocol-1
      其中, λ是激光的波长, f是第一个透镜的焦距, D是输入光束的直径。
    2. 在3D 平移阶段安装针孔, 使其能够精确放置在第一准直透镜的焦点上。
    3. 调整针孔的位置。将激光功率计放在针孔后, 调整 XYZ 的针孔位置, 使电能表读数最大化。如果观察到一个衍射环, 用虹膜放置在 2 d-排爆前。
  3. 安装格兰-汤普森偏光片
    1. 将格兰-汤普森偏光片 (图 1: GP) 放在第二个准直透镜 (图 1: L2) 之后, 以清除激光束的偏振。旋转偏光片, 以找到最大的传输功率计。
  4. 安装 EODs
    1. 使用 2 EODs (图 1: EOD1 和 #38; EOD2) 将激光偏转到 X 和 Y 方向。通过调整每个爆炸物的偏航、俯仰和高度来最大化激光传输。
    2. 使用制造商在每个偏转器一侧提供的校准标记对齐两个 EODs。
    3. 将测试模式应用于2维爆炸物的控制器, 以检查爆炸物的输出。这可以是骑士的巡回 (图 2) 通过下面所描述的 FPGA 或由函数发生器提供的一个简单的正弦波。为了得到最佳性能, 每个偏转器的偏转应与压电 nanopositioner 的 X 或 Y 方向平行。这个方向是由器关于传输轴的角方向决定的。在不移动2维爆炸物的情况下旋转偏转方向, 在2维爆炸物排爆后放置一只鸽子棱镜, 使偏转轴与压电 nanopositioner 轴对准。
  5. 波板安装
    1. 将波板 (图 1: W1) 放在格兰-汤普森偏光片 (图 1: GP) 和 2 d-爆炸物排爆器之间, 使入射激光束极化与 2 d-爆炸处理的偏转轴线对准。放置一个长焦距镜头 (300 毫米) 后, 2 d 的爆炸物, 并放置一个 sCMOS 相机在激光焦点。接下来, 打开 2 d-爆炸物, 以生成下面描述的骑士之旅 (图 2)。旋转波板, 直到在相机上观察到均匀的方形激光分布。
  6. 光束扩展透镜对和继电器透镜副的安装
    1. 放置一对镜片 (图 1: L3 和 L4) 在 2 d-排爆后扩展光束以填充物镜的后孔 (图 1: OL) 和另一对镜片 (图 1: L5 和 L6) 以将焦平面中继到显微镜物镜。确保在这两对镜片之间留有足够的空间, 因为在后面的步骤中, 它们之间会安装标签镜头。
  7. 安装分色滤光片, 10/90 分束器, 聚焦透镜, APD, 物镜, 荧光发射过滤器, 完成检测通路。
    1. 安装分色滤镜 (图 1: DC) 以反射激光朝向物镜。将激光对准物镜的中心, 使用长透镜管的顶部和底部有两个虹膜。
    2. 安装10/90 分束器 (图 1: BS), 其中10% 的光被反射到 sCMOS 相机 (如下所述) 和90% 的通过到 APD 进行跟踪。
    3. 对准 APD将激光聚焦到物镜上的片上。使用片的反射来对齐所有下游元素, 通过在目标焦点上放置一个片并检查 APD 读数的强度。在分束器后, 在3D 平移阶段安装 apd 聚焦透镜 (图 1: L7), 然后是 apd。定位透镜, 使激光反射从物镜进入透镜中心。
在片上, 通过调整3D 位置, 使激光反射的强度最大化, 可以优化 APD 的位置。当探测器位置在任意方向移动时, APD 位置处于最佳位置, 从而降低了强度。
  • 安装一个 longpass 荧光发射过滤器 (图 1: F), 然后将光束分配器移除反射和散射光。
  • 标记透镜的安装
    1. 将标记镜头放在两对镜片之间 (图 1: L4 和 L5之间), 如前所述, 并显示在图 1中。调整偏航, 俯仰, 高度和横向位置, 使光束通过垂直通过标记透镜的中心。

    • 2. 样品制备。

    1. 固定粒子制备
      1. 在 PBS 中稀释 190 nm 荧光珠到 ~ 5 x 108珠/毫升。添加400µL 珠解决方案上的片和安装在压电舞台的样品持有人 (珠的体积将取决于样品持有人; 这里使用的样品盒的直径是18毫米)。在这里使用的珠子, PBS 导致微粒存放在片。
    2. 自由运动微粒准备
      1. 稀释 110 nm 荧光珠到〜 5 x 108珠/毫升与 DI 水。添加400µL 珠解决方案到一个片和安装到样品持有人的压电阶段。

    3. 优化跟踪参数

    1. 光栅扫描固定粒子
      1. 在显微镜上放一个固定的微粒样品。
      2. 打开激光, 微控制器, 压电 nanopositioner 控制器, 标签镜头控制器, 和爆炸物控制器。请注意, 该顺序并不重要。在闭合回路中运行压电 nanopositioner。
      3. 光栅扫描 XYZ 中的示例使用自定义扫描软件程序 (图 S3, 根据作者的请求提供的软件), 它在骑士之旅 (图 2) 中驱动 2 d-排爆, 从 APD 收集计数, 驱动压电nanopositioner, 并执行位置计算 (图 S2)。步长为 40 nm, 扫描范围为2µm。
        1. 将片放在目标的焦点上, 去掉荧光发射滤波器, 利用激光从片的反射来最大化信号强度作为微 Z 位置的函数。在将样品放置在焦平面上后, 将荧光发射过滤器放回。
        2. 打开扫描程序。通过在 "开始"、"完成" 和 "步骤" 中键入数字来设置扫描范围和步骤大小。首先设置一个大的扫描范围和步长, 以找到一个粒子 (例如, 10 x 10 µm 范围与 200 nm 步大小)。找到微粒后, 缩小扫描范围并减小步长 (例如, 2 x 2 µm 范围, 100 nm 步长)。单击 "扫描" 按钮执行3D 光栅扫描以查找荧光焦点。
    2. 标记镜头设置 (另请参见图 3)
      1. 点击标签镜头控制软件。依次单击 "连接"、"通电"。
      2. 为了改变触发信号的输出相位, 必须改变输出触发模式。首先将模式从 "RGB" 更改为 "多", 然后将其更改回。现在可以更改该阶段 (图 3b)。
      3. 将输出阶段设置为0°、90°和270°。虽然可以使用覆盖相空间的任何三阶段, 但发现这三的工作经验很好 (图 3c)。
      4. 选择68500赫兹频率设置。
      5. 为了找到最佳频率, 经常需要改变频率搜索范围。单击 "高级"、"设置"。更改 "最大值"。频率 (hz) 的0列从7万赫兹到 71500 hz。这可以调整到任何频率范围是适当的。单击 "保存校准"、"退出校准" (图 3d)。
      6. 为了使新的校准生效, 请将共振切换到另一个频率 (例如, 189150 hz), 然后切换回68500赫兹频率设置 (图 3e)。
      7. 将振幅逐渐改变为35%。单击 "锁定共振"。锁定频率后, 单击 "解锁共振" (图 3e)。标记透镜现在可以使用了。
      8. 要校准, 更改估计中使用的参数, 使估计位置等于实际位置, 如图 4e所示, f. 输入 x、y 和 z 的扫描范围, 然后单击 "扫描" 按钮以在 XYZ 中扫描示例, 以移动粒子通过移动激光光斑。粒子的位置, 因为它是通过激光聚焦扫描应该同意的估计粒子位置确定的位置估计回路 (图 S1)。估计位置和实际位置 (图 4d) 之间的关系可以从估计位置图像 (图 4f) 中提取。如果位置不一致, 请调整位置估计循环中使用的激光位置 (ck) 的值 (图 S1)。
      9. 对齐标签镜头
        1. 当标签镜头控制器关闭, 光栅扫描粒子图像 (如下所述) 在安装标记镜头和安装标记透镜后, 应该看起来相同。接下来, 通过移动目标与 z nanopositioner 进行荧光粒子 z 堆栈扫描, 以调整标记透镜的位置和角度 (图 4)。调整标记透镜的位置, 直到沿 z 方向的 xy 平面中的粒子图像没有漂移, 这是当粒子的 xy 位置没有变化 (图 4d) 的函数时实现的。跟踪系统可以在标签镜头对准后使用。
    3. 微粒监测用 sCMOS 相机的安装
      1. 安装一个 sCMOS 相机, 以可视化粒子, 而他们被跟踪。仅在安装并优化了跟踪系统的所有组件后才安装 sCMOS。
    在显微镜上加载一个固定的荧光粒子样本, 并运行跟踪程序, 锁定一个粒子在目标的焦点体积。然后, 安装 100 mm 焦距透镜 (图 1: L8) 和 sCMOS。调整 sCMOS 位置, 使粒子的图像聚焦到最小和最亮的点。

    4. 自由扩散纳米粒子的实时3D 跟踪

    1. 将 110 nm 的自由运动微粒样品放在显微镜上。
    2. 打开激光, 微定位控制器, 压电 nanopositioner 控制器, 标签镜头控制器, 和爆炸物控制器。在开环中运行压电 nanopositioner。根据步骤3.2 设置标签镜头软件。
    3. 打开并运行跟踪软件 (可根据作者的要求提供)。将位置估计参数设置为其优化值, 在3节中找到。
    4. 将片放在目标的焦点上, 去掉荧光发射滤波器, 利用激光从片的反射来最大化信号强度作为微 Z 位置的函数。在找到片后, 增加焦点位置15µm 将激光从片聚焦到解决方案中。放回荧光发射过滤器。
    5. 设置整型控制常数。积分控制常数可以设置为低值开始, 并慢慢增加, 直到振荡可以看到在粒子的位置读数。一旦观测到振荡, 将积分控制常数设置为引起振荡的值的80%。典型值将是约0.012 的 XY ' 积分增益 ' 和0.004 的 Z ' 积分增益 '。
    6. 在 "跟踪阈值" 和 "最小跟踪" 中设置跟踪阈值, 并通过单击 "搜索" 和 "自动跟踪" 启动跟踪实验。终止跟踪的阈值设置略高于后台级别, 触发跟踪的阈值大约比背景高两倍。在这里, 触发跟踪的阈值是3赫, 终止轨迹的阈值是1.5 赫。

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    结果

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    固定粒子扫描 (图 4) 和自由扩散 110 nm 荧光粒子跟踪 (图 5) 是按照上述协议执行的。粒子扫描是通过移动压电 nanopositioner 和 bin 光子, 同时计算在扫描的每个点的粒子的估计位置。扫描图像显示一个均匀强度的平方 (图 4a), 估计的位置显示一个与粒子的实际位置的线性关系, 在 x、y 和 z 方向上的 1 x 1 x 2 µm 范围 (图 4bf)。

    为了演示 real-time 跟踪, 110 nm 的荧光粒子在水中被3维 DyPLoT (图 5a

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    讨论

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    尽管近年来出现了许多3D 单粒子跟踪方法, 但在低光子计数率下, 以简单的设置进行的高速3D 扩散的鲁棒 real-time 跟踪仍然是一个挑战, 这限制了它在重要的生物问题.本协议中描述的3维 DyPLoT 方法以多种方式解决了这些难题。首先, 将激励和检测路径与其他实现简单而健壮的方法相比, 大大简化了。其次, 移动激光光斑和位置估计算法为反馈回路提供精确的位置估计, 使反馈更加稳定。第三, 动态移动激光光斑的有效大探测范围 (1 x 1 x 4 µm) 可以跟踪快速移动的粒子。为了了解这一大探测区域的重要性, 考虑压电 nanopositioner 的固有响应时间非常重要。高速压电级有共振1赫的顺序, 将响应时间限制为1毫秒在 1 ms 中, 100 纳米纳米粒子的扩散系数为4µm2/秒, 将从衍射中心的平均 90 nm 扩散公司检测量。这只是平均位移, 真正的随机运动将显示比这更大的步骤, 导致粒子离开焦点体积和结束当前的轨道。对于较小的粒子来说, 情况更糟, 因为越来越大的热扩散步骤导致了跟踪损失。有效的大探测区使跟踪系统克服了固有的压电级滞后, 从粒子位置的大扩散跳跃中恢复, 提高了跟踪机构的整体鲁棒性...

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    披露

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    作者声明没有竞争的金融利益。

    致谢

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    这项工作得到了国家卫生研究院的国家综合医学研究所的支持, R35GM124868 和杜克大学颁发的奖项。

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    材料

    本文使用的材料清单
    姓名公司目录编号评论
    2D 电光导流板 ConOpticsM310A2 需要
    EOD 的电源ConOptics412将 FPGA 输出转换为高压，用于 EOD
    TAG 镜头TAG光学TAG 2.0轴向偏转激光
    XY压电纳米定位器MadCity LabsNano-PDQ275HS用于移动样品以锁定粒子在物镜焦距体积内；
    Z 压电纳米正能量计MadCity LabsNano-OP65HS用于移动物镜以跟随扩散粒子
    微定位器MadCity LabsMicroDrive用于粗定位样品和评估
    物镜蔡司PlanApo最佳灵敏度所需的高数值孔径。100X， 1.49 NA， M27， 蔡司
    sCMOS 相机PCOpco.edge 4.2用于监测粒子的位置
    APDExcelitasSPCM-ARQH-15较低的暗计数 有益
    场可编程门阵列National InstrumentsNI-7852r
    软件National InstrumentsLabVIEW
    跟踪激发激光器JDSUFCD488-30
    镜头ThorLabsAC254-150-A-MLL1
    镜头ThorLabsAC254-200-A-MLL2
    针孔ThorLabsP75SPH
    格兰-汤普森偏光片ThorLabsGTH5-AGT
    半波片ThorLabsWPH05M-488WP
    镜头ThorLabsAC254-75-A-MLL3
    镜头ThorLabsAC254-250-A-MLL4
    镜头ThorLabsAC254-200-A-MLL5
    镜头ThorLabsAC254-200-A-MLL6
    二向色镜ChromaZT405/488/561/640rpc直流
    荧光发射滤光片ChromaD535/40mF
    10/90 分光镜Chroma21012BS
    PBSSigmaD8537
    190 nm 荧光纳米颗粒Bangs 实验室FC02F/9942
    110 nm 荧光纳米颗粒Bangs 实验室FC02F/10617
    盖玻片Fisher Scientific12-545A
    功率计ThorlabsPM100D
    CMOSThorlabsDCC1545M
    IrisThorlabsSM1D12D
    显微镜Mad City LabsRM21
    用于沿的

    参考文献

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