方法文章

一种实时3D 单粒子跟踪协议

DOI：

10.3791/56711

⸱

2018年1月3日

 , 
1Department of Chemistry, Duke University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本协议详细介绍了一种 real-time 3D 单粒子跟踪显微镜的构造和操作, 能够跟踪高扩散速度和低光子计数率的纳米荧光探针。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

实时三维单粒子跟踪 (RT-3D-SPT) 有可能在蜂窝系统中对快速的3D 过程产生影响。尽管近年来提出了各种 RT-3D-SPT 方法, 但在低光子计数速率下跟踪高速3D 扩散粒子仍然是一个挑战。此外, RT-3D-SPT 设置通常是复杂和难以实施, 限制其广泛应用于生物问题。该协议提出了一个 RT-3D-SPT 系统, 名为3D 动态光子定位跟踪 (3 维 DyPLoT), 它可以跟踪高扩散速度 (高达20µm2/秒) 在低光子计数率 (下至10赫) 的粒子。3 d-DyPLoT 采用2D 电光偏转器 (2 d-爆炸物) 和可调谐的声学梯度 (标签) 镜头, 以驱动一个单一的聚焦激光点动态在3D。结合一种优化的位置估计算法, 3 维 DyPLoT 可以锁定在高跟踪速度和高定位精度的单粒子上。由于单一的励磁和单一的检测路径布局, 3 维 DyPLoT 是健壮的, 易于设置。本协议讨论如何逐步构建3维 DyPLoT。首先, 介绍了光学布局。然后, 通过光栅扫描190纳米荧光珠与压电 nanopositioner 对系统进行了标定和优化。最后, 为了证明 real-time 3D 跟踪能力, 110 nm 荧光珠在水中跟踪。

引言

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先进的成像技术的出现, 打开了一个窗口, 看到更详细的细胞现象的结构, 一路下降到分子水平。方法如随机光学重建显微镜 (风暴)1,2,3, 照片激活的本地化显微镜 (PALM)4,5,6,7, 结构化照明显微镜 (SIM)8,9,10,11, 和受激辐射损耗显微镜 (STED)12,13, 14已经远远超出了衍射极限, 从而将空前的细节提供给了活细胞的结构和功能。然而, 充分了解这些系统的行为需要动态信息和结构信息。上面列出的超分辨率方法涉及空间分辨率和时....

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方案

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1. 设置布局和对齐

  1. 跟踪励磁激光器的安装与准直
    1. 使用国产安装将激光器粘贴到光学工作台上。该安装是一个简单的铝板与安装孔的激光头和光学表。激光应牢固地附着在金属支架上, 以稳定散热。对于这项工作, 使用 488 nm 固体激光器照明 (图 1), 虽然波长可以选择适合特定的荧光或实验。一个关键的因素是, 激光波长适合 2 d-爆炸物的工作范围, 这是由两个器 (图 1: W2) 之间的波板主要确定。488 nm 激光可以有效激发绿色或黄色荧光蛋白 (GFP/YFP), 这是常见的荧光标签在活细胞实验。
    2. 使用一对介质镜像 (图 1: M) 调整激光束的高度和方向. 确保激光光束平行于光学工作台, 并将其调整到合适的高度。
      注: 应根据显微镜平台选择高度。对于本协议中使用的所有后续镜像, 都应保留此高度, 但不会明确声明。
    3. 准用一对透镜 (图 1: L1 和 L2) 对光束进行了分析。焦距的镜头, 应谨慎选择, 以避免激光斑点被修剪的光圈 2 d-爆炸物。通过 2 d-爆炸物排爆后, 激光束的形状变化明显。....

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结果

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固定粒子扫描 (图 4) 和自由扩散 110 nm 荧光粒子跟踪 (图 5) 是按照上述协议执行的。粒子扫描是通过移动压电 nanopositioner 和 bin 光子, 同时计算在扫描的每个点的粒子的估计位置。扫描图像显示一个均匀强度的平方 (图 4a), 估计的位置显示一个与粒子的实际位置的线性关系, 在 x、y 和 z 方向上的 1 x 1 x 2 µm 范围 (图 4bf)。

为了演示 real-time 跟踪, 110 nm 的荧光粒子在水中被3维 DyPLoT (图 5a

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讨论

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尽管近年来出现了许多3D 单粒子跟踪方法, 但在低光子计数率下, 以简单的设置进行的高速3D 扩散的鲁棒 real-time 跟踪仍然是一个挑战, 这限制了它在重要的生物问题.本协议中描述的3维 DyPLoT 方法以多种方式解决了这些难题。首先, 将激励和检测路径与其他实现简单而健壮的方法相比, 大大简化了。其次, 移动激光光斑和位置估计算法为反馈回路提供精确的位置估计, 使反馈更加稳定。第三, 动态移动激光光斑的有效大探测范围 (1 x 1 x 4 µm) 可以跟踪快速移动的粒子。为了了解这一大探测区域的重要性, 考虑压电 nanopositioner 的固有响应时间非常重要。高速压电级有共振1赫的顺序, 将响应时间限制为1毫秒在 1 ms 中, 100 纳米纳米粒子的扩散系数为4µm2/秒, 将从衍射中心的平均 90 nm 扩散公司检测量。这只是平均位移, 真正的随机运动将显示比这更大的步骤, 导致粒子离开焦点体积和结束当前的轨道。对于较小的粒子来说, 情况更糟, 因为越来越大的热扩散步骤导致了跟踪损失。有效的大探测区使跟踪系统克服了固有的压电级滞后, 从粒子位置的大扩散跳跃中恢复, 提高了跟踪机构的整体鲁棒性.......

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披露

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作者声明没有竞争的金融利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作得到了国家卫生研究院的国家综合医学研究所的支持, R35GM124868 和杜克大学颁发的奖项。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2D 电光导流板 ConOpticsM310A2 需要
EOD 的电源ConOptics412将 FPGA 输出转换为高压，用于 EOD
TAG 镜头TAG光学TAG 2.0轴向偏转激光
XY压电纳米定位器MadCity LabsNano-PDQ275HS用于移动样品以锁定粒子在物镜焦距体积内；
Z 压电纳米正能量计MadCity LabsNano-OP65HS用于移动物镜以跟随扩散粒子
微定位器MadCity LabsMicroDrive用于粗定位样品和评估
物镜蔡司PlanApo最佳灵敏度所需的高数值孔径。100X， 1.49 NA， M27， 蔡司
sCMOS 相机PCOpco.edge 4.2用于监测粒子的位置
APDExcelitasSPCM-ARQH-15较低的暗计数 有益
场可编程门阵列National InstrumentsNI-7852r
软件National InstrumentsLabVIEW
跟踪激发激光器JDSUFCD488-30
镜头ThorLabsAC254-150-A-MLL1
镜头ThorLabsAC254-200-A-MLL2
针孔ThorLabsP75SPH
格兰-汤普森偏光片ThorLabsGTH5-AGT
半波片ThorLabsWPH05M-488WP
镜头ThorLabsAC254-75-A-MLL3
镜头ThorLabsAC254-250-A-MLL4
镜头ThorLabsAC254-200-A-MLL5
镜头ThorLabsAC254-200-A-MLL6
二向色镜ChromaZT405/488/561/640rpc直流
荧光发射滤光片ChromaD535/40mF
10/90 分光镜Chroma21012BS
PBSSigmaD8537
190 nm 荧光纳米颗粒Bangs 实验室FC02F/9942
110 nm 荧光纳米颗粒Bangs 实验室FC02F/10617
盖玻片Fisher Scientific12-545A
功率计ThorlabsPM100D
CMOSThorlabsDCC1545M
IrisThorlabsSM1D12D
显微镜Mad City LabsRM21
用于沿的

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  2. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imagi....

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Real time 3D Single Particle Tracking3D Dynamic Photon Localization Tracking2D Electro optic DeflectorTunable Acoustic Gradient LensAvalanche Photo DiodeField Programmable Gate ArrayPiezoelectric NanopositionerFluorescent Bead TrackingPhoton Counting RatePosition Estimation Algorithm

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