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方法文章

一种用于实时三维单粒子追踪的实验方案

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DOI：

10.3791/56711

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2018年1月3日

 , 
1Department of Chemistry, Duke University

本文内容

摘要

本方案详细介绍了构建和操作一种实时三维单粒子追踪显微镜的方法，该显微镜能够以高扩散速度和低光子计数率追踪纳米级荧光探针。

摘要

实时三维单粒子追踪（RT-3D-SPT）有望揭示细胞系统中快速的三维动态过程。尽管近年来已提出多种RT-3D-SPT方法，但在低光子计数率条件下追踪高速三维扩散粒子仍具挑战性。此外，RT-3D-SPT系统通常结构复杂且难以实现，限制了其在生物学问题中的广泛应用。本实验方案介绍了一种名为三维动态光子定位追踪（3D-DyPLoT）的RT-3D-SPT系统，该系统可在低光子计数率（低至10 kHz）条件下追踪高扩散速度的粒子（高达20 µm2/s）。3D-DyPLoT采用二维电光偏转器（2D-EOD）和可调谐声学梯度（TAG）透镜，实现单个聚焦激光点在三维空间内的动态扫描。结合优化的位置估计算法，3D-DyPLoT能够以高追踪速度和高定位精度锁定单个粒子。由于采用单一激发和单一检测光路设计，3D-DyPLoT系统具有良好的稳定性且易于搭建。本方案详细阐述了3D-DyPLoT系统的逐步构建过程：首先描述光学布局；随后通过压电纳米位移器对190 nm荧光微球进行光栅扫描，完成系统的校准与优化；最后，为验证其实时三维追踪能力，对水中110 nm荧光微球进行追踪实验。

引言

先进成像技术的出现为我们观察细胞现象的精细结构打开了窗口，其分辨率已深入到分子水平。诸如随机光学重建显微技术（stochastic optical reconstruction microscopy, STORM）1,2,3、光激活定位显微技术（photo-activated localization microscopy, PALM）4,5,6,7、结构照明显微技术（structured illumination microscopy, SIM）8,9,10,11以及受激发射损耗显微技术（stimulated emission depletion microscopy, STED）12,13,14等方法已突破衍射极限，为活细胞的结构与功能提供了前所未有的细节信息。然而，要全面理解这些系统的行为，不仅需要结构信息，还需要动态信息。上述超分辨率方法在空间分辨率与时间分辨率之间存在权衡，限制了对动态过程探测的时间精度。而RT-3D-SPT方法15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29则能够同时提供高空间精度和高时间分辨率。本文中，我们区分了传统的3D-SPT30与RT-3D-SPT。传统3D-SPT仅需一系列三维图像数据（可通过共聚焦显微镜或在适当配置下的落射荧光显微镜获取）。在传统3D-SPT中，粒子的坐标是在数据采集完成后，通过在每幅图像堆栈中定位粒子，并将连续体积中的位置连接起来形成轨迹而确定的。对于这些方法，最终的时间分辨率由体成像速率决定。对于共聚焦显微镜，该速率通常在数秒至数十秒量级。而对于落射荧光方法，通过调控光路以提取轴向位置信息，其时间分辨率受限于相机的曝光或读出时间。尽管这些落射荧光方法在可采集轴向信息的范围上存在限制，但近年来在傅里叶平面相位掩模设计和自适应光学方面的进展已将该范围扩展至10 µm或更广31,32,33,34。

相比之下，RT-3D-SPT 并不依赖于采集三维图像堆栈并在事后定位粒子。相反，它通过单点探测器实时提取位置信息，并施加反馈以有效实现 "锁定" 通过使用高速压电载物台，使粒子保持在物镜的焦平面体积内。这使得对粒子位置的连续测量成为可能，其时间分辨率仅受限于可收集的光子数量。此外，该方法能够在粒子进行长距离运动时实现对其光谱的探测。实时三维单粒子追踪（RT-3D-SPT）的作用机制类似于一种无受力光学捕获技术，适用于纳米级物体，可在无需高功率激光或光学作用力的情况下，对粒子进行实时、连续的探测与测量。鉴于RT-3D-SPT能够实现对快速扩散物体（最高达20 µm²/s）的持续监测，2/秒25,29 在低光子计数率下进行三维成像20,29,35它应能揭示快速或瞬时的生物过程，例如细胞内货物运输、配体-受体结合以及单个病毒颗粒的胞外动态。然而截至目前，实时三维单粒子追踪技术（RT-3D-SPT）的应用仅限于少数致力于推进该技术发展的研究团队。

其中一个障碍是RT-3D-SPT方法所需的光学布局复杂，且各方法之间存在差异。对于大多数方法而言，光学反馈由压电载物台提供。当粒子在X、Y或Z方向发生微小移动时，来自单点探测器的读数被转换为误差函数，并高速输入至压电纳米定位器，后者随之移动样品以抵消粒子的运动，从而有效地将粒子相对于物镜固定在原位。为了测量X、Y和Z方向上的微小位置变化，需采用多个探测器（根据具体实现方式为4个或5个）15,18,21，或多个激发光斑（2至4个；若使用锁相放大器通过旋转激光光斑提取X和Y方向位置，则可采用较少数量）25,28。这些多个检测光斑与发射光斑之间的重叠使得系统难以对准和维护。

本文介绍了一种高速目标锁定的三维单粒子追踪（3D-SPT）方法，其光学设计简化，称为3D-DyPLoT29。3D-DyPLoT利用二维电光偏转器（2D-EOD）和TAG透镜36,37,38，以高速率（XY方向50 kHz，Z方向70 kHz）在物镜焦体积内动态移动聚焦激光光斑。通过结合激光焦点位置与光子到达时间，即使在低光子计数率下，也能快速获取粒子的三维位置。2D-EOD驱动激光焦点在X-Y平面内按“骑士巡回”模式39扫描，每个方格尺寸为1 × 1 µm；TAG透镜则在轴向（Z方向）移动激光焦点，范围为2–4 µm。三维粒子位置通过一种优化的位置估计算法29,40在三维空间中实现。三维动态移动激光光斑的控制、雪崩光电二极管（APD）的光子计数、实时粒子位置计算、压电载物台反馈以及数据记录，均由现场可编程门阵列（FPGA）完成。在本实验方案中，我们逐步描述了如何搭建3D-DyPLoT显微镜，包括光学校准、利用固定粒子进行标定，以及最终实现自由运动粒子的追踪。作为示例演示，110 nm的荧光微球在水中被连续追踪数分钟。

本文所述方法是持续监测低光强下快速移动的荧光探针的理想选择，适用于病毒、纳米颗粒以及内体等囊泡的研究。与以往方法相比，该系统仅包含单一激发路径和单一检测路径，使光路对准和日常维护更为简便。此外，较大的检测区域使该显微镜能够轻松捕获快速扩散的颗粒，而其在低信号水平（低至10 kHz）下进行追踪的能力，使该方法成为低光强应用的理想方案29。

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方案

1. 设置布局与对齐

  1. 跟踪激发激光器的安装与准直
    1. 使用自制的支架将激光器固定在光学平台上。该支架为一块带有激光头和光学平台安装孔的简单铝板。为确保稳定性与散热，激光器应牢固地安装在金属支架上。本实验采用 488 nm 固态激光器作为照明光源（图 1），尽管可根据特定荧光团或实验需求选择其他波长。关键因素是激光波长需适配二维电光偏转器（2D-EOD）的工作范围，该范围主要由两个偏转器之间的波片决定（图 1：W2）。488 nm 激光可有效激发绿色或黄色荧光蛋白（GFP/YFP），这些是活细胞实验中常用的荧光标记。
    2. 使用一对介质镜（图 1：M）调节激光束的高度与方向。确保激光束与光学平台平行，并调整至合适高度。
      注：高度应根据显微镜平台确定。本方案中所有后续使用的反射镜均应保持相同高度，尽管下文不再特别说明。
    3. 使用一对透镜对光束进行准直（图 1：L1 和 L2）。应仔细选择透镜的焦距，以避免激光光斑被二维电光偏转器（2D-EOD）的孔径截断。若光束通过 2D-EOD 后形状发生变化，则表明存在截断现象。此处准直质量极为重要，因为像差会被后续透镜放大，而任何发散都会降低 2D-EOD 偏转性能。理想情况下，应将光束聚焦至至少 20 米外的一点以实现准直。
  2. 在第一准直透镜（图 1：L1）的焦点处放置适当尺寸的针孔（图 1：PH）。
    1. 选择合适尺寸的针孔。针孔尺寸可根据以下公式计算：
      figure-protocol-1
      其中 λ 为激光波长，f 为第一透镜的焦距，D 为入射光束直径。
    2. 将针孔安装在三维平移台上，以便精确置于第一准直透镜的焦点处。
    3. 调节针孔位置。在针孔后放置激光功率计，并在 XYZ 三个方向上调节针孔位置，使功率计读数最大化。若观察到衍射环，可在 2D-EOD 前放置一个虹彩光阑将其遮挡。
  3. 格兰-汤普森偏振器的安装
    1. 将格兰-汤普森偏振器（图 1：GP）置于第二准直透镜（图 1：L2）之后，以净化激光束的偏振态。旋转偏振器，使功率计读数达到最大，以获得最大透过率。
  4. 电光偏转器（EOD）的安装
    1. 使用两个电光偏转器（图 1：EOD1 & EOD2）分别在 X 和 Y 方向上偏转激光束。通过调节每个 EOD 的偏摆、俯仰和高度，使激光透过率最大化。
    2. 利用制造商在每个偏转器侧面提供的对准标记，对两个 EOD 进行相互对准。
    3. 向 2D-EOD 控制器施加测试图案以检查其输出。可采用下文所述 FPGA 生成的“骑士巡游”图案（图 2），或使用函数发生器提供的简单正弦波。为获得最佳性能，每个偏转器的偏转方向应分别与压电纳米定位器的 X 或 Y 方向平行。该方向由偏转器绕透射轴的角向方向决定。若需在不移动 2D-EOD 的情况下旋转偏转方向，可在 2D-EOD 后放置一个道威棱镜，以使偏转轴与压电纳米定位器的轴对齐。
  5. 半波片的安装
    1. 在格兰-汤普森偏振器（图 1：GP）与 2D-EOD 之间放置一个半波片（图 1：W1），以使入射激光束的偏振方向与 2D-EOD 的偏转轴对齐。在 2D-EOD 后放置一个长焦透镜（300 mm），并在激光焦点处放置 sCMOS 相机。随后开启 2D-EOD，生成下文所述的“骑士巡游”图案（图 2）。旋转半波片，直至在相机上观察到均匀的方形激光分布。
  6. 扩束透镜组与中继透镜组的安装
    1. 在 2D-EOD 后放置一对透镜（图 1：L3 和 L4），以扩展光束，使其充满物镜（图 1：OL）的后孔径；再放置另一对透镜（图 1：L5 和 L6），以将焦平面中继至显微镜物镜。务必在两组透镜之间预留足够空间，以便后续安装 TAG 透镜。
  7. 安装二向色镜、10/90 分束器、聚焦透镜、APD、物镜和荧光发射滤光片，以完成检测光路。
    1. 安装二向色镜（图 1：DC），将激光反射至物镜方向。使用长镜筒顶部和底部的两个虹彩光阑，使激光沿物镜中心直线通过。
    2. 安装 10/90 分束器（图 1：BS），使 10% 的光被反射至 sCMOS 相机用于成像（下文详述），90% 的光透过至 APD 用于跟踪。
    3. 对 APD 进行对准。通过物镜将激光聚焦至盖玻片上。在物镜焦点处放置盖玻片，利用其反射光对所有下游元件进行对准，并监测 APD 读数强度。在分束器后，先安装 APD 聚焦透镜（图 1：L7），再将 APD 安装在三维平移台上。调整透镜位置，使来自物镜的反射激光通过透镜中心。通过调节三维位置，使盖玻片反射激光在 APD 上的信号强度最大化。当探测器在任意方向移动均导致信号强度降低时，即表明 APD 已处于最佳位置。
    4. 在分束器前安装长通荧光发射滤光片（图 1：F），以去除反射光和散射光。
  8. TAG 透镜的安装
    1. 如前所述并如 图 1 所示，将 TAG 透镜置于两组透镜之间（图 1：L4 和 L5 之间）。调节其偏摆、俯仰、高度和横向位置，使光束垂直通过 TAG 透镜中心。

2. 样品制备。

  1. 固定粒子的制备
    1. 将190 nm的荧光微球用PBS稀释至约 5 × 108 个微球/mL。取400 µL微球溶液滴加到盖玻片上，并安装到压电载物台的样品 holder 上（微球溶液的体积取决于样品 holder 的大小；此处使用的样品 holder 腔室直径为18 mm）。对于本实验所用的微球，PBS可促使微球沉积在盖玻片表面。
  2. 自由运动粒子的制备
    1. 将110 nm的荧光微球用去离子水稀释至约 5 × 108 个微球/mL。取400 µL微球溶液滴加到盖玻片上，并安装到压电载物台的样品 holder 上。

3. 优化追踪参数

  1. 光栅扫描固定颗粒
    1. 将固定好的颗粒样品置于显微镜下。
    2. 打开激光器、微操纵器控制器、压电纳米位移控制器、TAG透镜控制器和EOD控制器。注意，开启顺序并无严格要求。将压电纳米位移器设置为闭环模式运行。
    3. 使用定制扫描软件程序在 XYZ 方向上对样品进行光栅扫描图 S3，软件可向作者申请获取），用于驱动二维电学器官放电（2D-EOD）呈骑士巡游路径（图2），采集APD的计数，驱动压电纳米定位器，并执行位置计算（图 S2。步长为40 nm，扫描范围为 2 µm.
      1. 将盖玻片置于物镜焦平面时，移除荧光发射滤光片，利用激光在盖玻片表面的反射信号，调节微位移器的Z轴位置以获得最大信号强度。将样品定位至焦平面后，重新装回荧光发射滤光片。
      2. 打开扫描程序。通过在“start”、“finish”和“step”中输入数值来设置扫描范围和步长。首先设置较大的扫描范围和步长以定位颗粒例如，10 × 10 µm 以200 nm步长进行扫描）。找到粒子后，缩小扫描范围并减小步长（例如，2 × 2 µm 以100 nm步长进行范围扫描。点击“scan”按钮执行三维光栅扫描，以找到荧光焦点。
  2. TAG透镜设置（另见 图3)
    1. 单击 TAG 镜头控制软件。依次单击“连接”、“开启电源”。
    2. 要改变触发信号的输出相位，必须更改输出触发模式。首先将模式从“RGB”更改为“Multiplane”，然后再更改回“RGB”。此时即可调整相位。图 3b).
    3. 设置输出相位为 0 °, 90 °，和 270 °尽管任何能够覆盖相空间的三个相位均可使用，但经验表明，这三个相位的效果较好（图 3c).
    4. 选择 68,500 Hz 频率设置。
    5. 为找到最佳频率，通常需要更改频率搜索范围。点击“高级”、“设置”，将第0列的“最大频率(Hz)”从70,000 Hz更改为71,500 Hz。此参数可根据实际需要调整至合适的频率范围。点击“保存校准”、“退出校准”图3d).
    6. 为使新的校准生效，需先将共振频率切换至另一频率（例如 189,150 Hz），然后再切换回 68,500 Hz 频率设置图 3e).
    7. 逐渐将振幅调整至35%。点击“锁定共振”。频率锁定后，点击“解锁共振”图3e）。TAG镜头现已可使用。
    8. 为进行校准，调整估算过程中所使用的参数，使估算位置与实际位置一致，如图所示 图 4e，f. 输入x、y和z的扫描范围，然后点击“scan”按钮，在XYZ方向扫描样品，使粒子穿过移动的激光焦点。粒子在激光焦点中扫描时的位置应与位置估计循环所确定的预估粒子位置一致图 S1）估计位置与实际位置之间的关系（图4d）可以从估计的位置图像中提取（图4f）。如果位置不一致，调整激光位置的数值（ck）用于位置估计循环中（图 S1).
    9. 调整TAG透镜
      1. 当TAG透镜控制器关闭时，安装TAG透镜前后所采集的光栅扫描粒子图像（如下所述）应完全相同。接下来，通过z轴纳米定位器移动物镜，进行荧光粒子Z轴层扫扫描，以调节TAG透镜的位置和角度图4调节TAG透镜的位置，直到粒子图像在Z方向上沿XY平面无漂移，即当粒子的XY位置不随Z位置变化而发生变化时，达到最佳状态。图 4d）。在完成TAG透镜的对准后，跟踪系统即可投入使用。
  3. 用于颗粒监测的sCMOS相机安装
    1. 安装sCMOS相机以在追踪过程中可视化粒子。仅在跟踪系统的全部组件安装并优化后，再安装sCMOS相机。将固定荧光微粒样品载入显微镜，运行追踪程序，使一个微粒锁定在物镜焦平面范围内。随后，安装焦距为100 mm的透镜（图1L8）和sCMOS。调整sCMOS的位置，使颗粒的像聚焦为最小且最亮的光斑。

4. 自由扩散纳米颗粒的实时三维追踪

  1. 将 110 nm 的自由运动粒子样品置于显微镜下。
  2. 打开激光器、微位移控制器、压电纳米定位控制器、TAG 透镜控制器和 EOD 控制器。以开环模式运行压电纳米定位器。根据步骤 3.2 设置 TAG 透镜软件。
  3. 打开并运行跟踪软件（可向作者索取）。将位置估计参数设置为第 3 节中确定的优化值。
  4. 为将盖玻片置于物镜焦平面上，移除荧光发射滤光片，利用激光在盖玻片上的反射信号，调节微位移器的 Z 位置以使信号强度最大化。找到盖玻片后，将焦平面位置增加 15 µm，使激光焦点远离盖玻片并进入溶液中。随后重新装回荧光发射滤光片。
  5. 设置积分控制常数。积分控制常数可从较低值开始逐步增加，直至在粒子位置读数中观察到振荡现象。一旦出现振荡，将积分控制常数设为引发振荡值的 80%。典型值约为 XY 方向“积分增益”0.012，Z 方向“积分增益”0.004。
  6. 在“Track Threshold”和“Track Minimum”中设置跟踪阈值，点击“Search”和“Auto Track”开始跟踪实验。终止跟踪的阈值略高于背景水平，触发跟踪的阈值约为背景水平的两倍。此处，触发跟踪的阈值为 3 kHz，结束轨迹的阈值为 1.5 kHz。

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结果

按照上述方案，进行了固定微粒扫描（图4）和自由扩散的110 nm荧光微粒追踪（图5）。微粒扫描通过移动压电纳米定位器并在每个扫描点累积光子，同时计算微粒在各点的估计位置来完成。扫描图像显示了一个强度均匀的方形区域（图4a），而估计位置在x、y和z方向上1 × 1 × 2 µm范围内与微粒的实际位置呈线性关系（图4b-f）。

为展示实时追踪效果，采用3D-DyPLoT对水中110 nm的荧光颗粒进行了三维追踪（图5a，b）。均方位移（MSD）分析呈现出典型的线...

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讨论

尽管近年来出现了多种3D单粒子追踪方法，但在简单装置条件下实现对低光子计数率下高速3D扩散进行稳定实时追踪仍是一项挑战，这限制了其在重要生物学问题中的应用。本方案中描述的3D-DyPLoT方法从多个方面解决了这些挑战。首先，与其它实现方式相比，该方法大幅简化了激发和检测光路，使光路对准更加简单且稳定。其次，移动激光光斑与位置估计算法为反馈回路提供了精确的位置估计，使反馈更加稳定。第三，动态移动激光光斑的有效大检测范围（1 × 1 × 4 µm）使得对快速移动粒子的追踪成为可能。要理解这一大检测区域的重要性，必须考虑压电纳米位移器的固有响应时间。高速压电平台的共振频率在1 kHz量级，导致其响应时间约为1 ms。在1 ms内，一个扩散系数为4 µm2/s、粒径为100 nm的纳米粒子将从衍射极限检测体积中心平均扩散约90 nm。这仅是平均位移，而实际的随机运动可能出现远大于此的步长，导致粒子离开焦平面体积，从而终止当前轨迹。对于更小的粒子，情况更为严重，其热扩散步长更大，更容易丢失追踪。有效的大检测区域使追踪系统能够克服压电平台固有的滞后效应，并从粒子位置的大范围扩散跳跃中恢复，从而提高追踪机制的整体鲁棒性。最后，大...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

本工作获得了美国国立卫生研究院下属的国家普通医学科学研究所授予的R35GM124868号基金以及杜克大学的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
二维电光偏转器 ConOpticsM310A需要2个
电光偏转器电源ConOptics412将FPGA输出转换为电光偏转器所需的高压
TAG  透镜TAG OpticsTAG 2.0用于沿轴向偏转激光
XY压电纳米定位器MadCity LabsNano-PDQ275HS用于移动样品，将颗粒锁定在物镜焦区内的 
Z轴压电纳米定位器MadCity LabsNano-OP65HS用于移动物镜以跟踪扩散的颗粒
微调定位器MadCity LabsMicroDrive用于粗略定位样品并进行评估
物镜ZeissPlanApo需要高数值孔径以获得最佳灵敏度。100X，1.49 NA，M27，Zeiss
sCMOS相机PCOpco.edge 4.2用于监测颗粒的位置
雪崩光电二极管（APD）ExcelitasSPCM-ARQH-15暗计数较低为佳
现场可编程门阵列（FPGA）National InstrumentsNI-7852r
软件National InstrumentsLabVIEW
跟踪激发激光器JDSUFCD488-30
透镜ThorLabsAC254-150-A-MLL1
透镜ThorLabsAC254-200-A-MLL2
小孔ThorLabsP75SPH
格兰-汤普森偏振器ThorLabsGTH5-AGT
半波片ThorLabsWPH05M-488WP
透镜ThorLabsAC254-75-A-MLL3
透镜ThorLabsAC254-250-A-MLL4
透镜ThorLabsAC254-200-A-MLL5
透镜ThorLabsAC254-200-A-MLL6
二向色镜ChromaZT405/488/561/640rpcDC
荧光发射滤光片ChromaD535/40mF
10/90分束器Chroma21012BS
磷酸盐缓冲液（PBS）SigmaD8537
190 nm荧光纳米颗粒Bangs LaboratoriesFC02F/9942
110 nm荧光纳米颗粒Bangs LaboratoriesFC02F/10617
盖玻片Fisher Scientific12-545A
功率计ThorlabsPM100D
CMOS相机ThorlabsDCC1545M
光阑ThorlabsSM1D12D
显微镜Mad City LabsRM21

参考文献

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