本方案详细介绍了构建和操作一种实时三维单粒子追踪显微镜的方法，该显微镜能够以高扩散速度和低光子计数率追踪纳米级荧光探针。
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本文内容
摘要
摘要
实时三维单粒子追踪（RT-3D-SPT）有望揭示细胞系统中快速的三维动态过程。尽管近年来已提出多种RT-3D-SPT方法，但在低光子计数率条件下追踪高速三维扩散粒子仍具挑战性。此外，RT-3D-SPT系统通常结构复杂且难以实现，限制了其在生物学问题中的广泛应用。本实验方案介绍了一种名为三维动态光子定位追踪（3D-DyPLoT）的RT-3D-SPT系统，该系统可在低光子计数率（低至10 kHz）条件下追踪高扩散速度的粒子（高达20 µm2/s）。3D-DyPLoT采用二维电光偏转器（2D-EOD）和可调谐声学梯度（TAG）透镜，实现单个聚焦激光点在三维空间内的动态扫描。结合优化的位置估计算法，3D-DyPLoT能够以高追踪速度和高定位精度锁定单个粒子。由于采用单一激发和单一检测光路设计，3D-DyPLoT系统具有良好的稳定性且易于搭建。本方案详细阐述了3D-DyPLoT系统的逐步构建过程：首先描述光学布局；随后通过压电纳米位移器对190 nm荧光微球进行光栅扫描，完成系统的校准与优化；最后，为验证其实时三维追踪能力，对水中110 nm荧光微球进行追踪实验。
引言
先进成像技术的出现为我们观察细胞现象的精细结构打开了窗口，其分辨率已深入到分子水平。诸如随机光学重建显微技术（stochastic optical reconstruction microscopy, STORM）1,2,3、光激活定位显微技术（photo-activated localization microscopy, PALM）4,5,6,7、结构照明显微技术（structured illumination microscopy, SIM）8,9,10,11以及受激发射损耗显微技术（stimulated emission depletion microscopy, STED）12
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方案
1. 设置布局与对齐
- 跟踪激发激光器的安装与准直
- 使用自制的支架将激光器固定在光学平台上。该支架为一块带有激光头和光学平台安装孔的简单铝板。为确保稳定性与散热，激光器应牢固地安装在金属支架上。本实验采用 488 nm 固态激光器作为照明光源（图 1），尽管可根据特定荧光团或实验需求选择其他波长。关键因素是激光波长需适配二维电光偏转器（2D-EOD）的工作范围，该范围主要由两个偏转器之间的波片决定（图 1：W2）。488 nm 激光可有效激发绿色或黄色荧光蛋白（GFP/YFP），这些是活细胞实验中常用的荧光标记。
- 使用一对介质镜（图 1：M）调节激光束的高度与方向。确保激光束与光学平台平行，并调整至合适高度。
注：高度应根据显微镜平台确定。本方案中所有后续使用的反射镜均应保持相同高度，尽管下文不再特别说明。 - 使用一对透镜对光束进行准直（图 1：L1 和 L2）。应仔细选择透镜的焦距，以避免激光光斑被二维电光偏转器（2D-EOD）的孔径截断。若光束通过 2D-EOD 后形状发生变化，则表明存在....
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结果
按照上述方案，进行了固定微粒扫描（图4）和自由扩散的110 nm荧光微粒追踪（图5）。微粒扫描通过移动压电纳米定位器并在每个扫描点累积光子，同时计算微粒在各点的估计位置来完成。扫描图像显示了一个强度均匀的方形区域（图4a），而估计位置在x、y和z方向上1 × 1 × 2 µm范围内与微粒的实际位置呈线性关系（图4b-f）。
为展示实时追踪效果，采用3D-DyPLoT对水中110 nm的荧光颗粒进行了三维追踪（图5a，b）。均方位移（MSD）分析呈现出典型的线.......
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讨论
尽管近年来出现了多种3D单粒子追踪方法，但在简单装置条件下实现对低光子计数率下高速3D扩散进行稳定实时追踪仍是一项挑战，这限制了其在重要生物学问题中的应用。本方案中描述的3D-DyPLoT方法从多个方面解决了这些挑战。首先，与其它实现方式相比，该方法大幅简化了激发和检测光路，使光路对准更加简单且稳定。其次，移动激光光斑与位置估计算法为反馈回路提供了精确的位置估计，使反馈更加稳定。第三，动态移动激光光斑的有效大检测范围（1 × 1 × 4 µm）使得对快速移动粒子的追踪成为可能。要理解这一大检测区域的重要性，必须考虑压电纳米位移器的固有响应时间。高速压电平台的共振频率在1 kHz量级，导致其响应时间约为1 ms。在1 ms内，一个扩散系数为4 µm2/s、粒径为100 nm的纳米粒子将从衍射极限检测体积中心平均扩散约90 nm。这仅是平均位移，而实际的随机运动可能出现远大于此的步长，导致粒子离开焦平面体积，从而终止当前轨迹。对于更小的粒子，情况更为严重，其热扩散步长更大，更容易丢失追踪。有效的大检测区域使追踪系统能够克服压电平台固有的滞后效应，并从粒子位置的大范围扩散跳跃中恢复，从而提高追踪机制的整体鲁棒性。最后，大.......
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院下属的国家普通医学科学研究所授予的R35GM124868号基金以及杜克大学的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 二维电光偏转器 | ConOptics | M310A | 需要2个 |
| 电光偏转器电源 | ConOptics | 412 | 将FPGA输出转换为电光偏转器所需的高压 |
| TAG 透镜 | TAG Optics | TAG 2.0 | 用于沿轴向偏转激光 |
| XY压电纳米定位器 | MadCity Labs | Nano-PDQ275HS | 用于移动样品，将颗粒锁定在物镜焦区内的 |
| Z轴压电纳米定位器 | MadCity Labs | Nano-OP65HS | 用于移动物镜以跟踪扩散的颗粒 |
| 微调定位器 | MadCity Labs | MicroDrive | 用于粗略定位样品并进行评估 |
| 物镜 | Zeiss | PlanApo | 需要高数值孔径以获得最佳灵敏度。100X，1.49 NA，M27，Zeiss |
| sCMOS相机 | PCO | pco.edge 4.2 | 用于监测颗粒的位置 |
| 雪崩光电二极管（APD） | Excelitas | SPCM-ARQH-15 | 暗计数较低为佳 |
| 现场可编程门阵列（FPGA） | National Instruments | NI-7852r | |
| 软件 | National Instruments | LabVIEW | |
| 跟踪激发激光器 | JDSU | FCD488-30 | |
| 透镜 | ThorLabs | AC254-150-A-ML | L1 |
| 透镜 | ThorLabs | AC254-200-A-ML | L2 |
| 小孔 | ThorLabs | P75S | PH |
| 格兰-汤普森偏振器 | ThorLabs | GTH5-A | GT |
| 半波片 | ThorLabs | WPH05M-488 | WP |
| 透镜 | ThorLabs | AC254-75-A-ML | L3 |
| 透镜 | ThorLabs | AC254-250-A-ML | L4 |
| 透镜 | ThorLabs | AC254-200-A-ML | L5 |
| 透镜 | ThorLabs | AC254-200-A-ML | L6 |
| 二向色镜 | Chroma | ZT405/488/561/640rpc | DC |
| 荧光发射滤光片 | Chroma | D535/40m | F |
| 10/90分束器 | Chroma | 21012 | BS |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma | D8537 | |
| 190 nm荧光纳米颗粒 | Bangs Laboratories | FC02F/9942 | |
| 110 nm荧光纳米颗粒 | Bangs Laboratories | FC02F/10617 | |
| 盖玻片 | Fisher Scientific | 12-545A | |
| 功率计 | Thorlabs | PM100D | |
| CMOS相机 | Thorlabs | DCC1545M | |
| 光阑 | Thorlabs | SM1D12D | |
| 显微镜 | Mad City Labs | RM21 |
参考文献
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imagi....
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重印与许可
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