本方案描述了染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）、4-硫代尿苷测序（4sU-seq）、总RNA测序（total RNA-seq）和核糖体谱分析在细胞系和原代细胞中的联合应用。该方法能够追踪转录因子结合、从头转录、RNA加工、降解及翻译随时间发生的变化，并展示活化细胞和/或快速变化细胞中整体事件的动态过程。
方法文章
转录因子结合、转录、翻译及降解的实时分析以展示细胞激活过程中的全局事件
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
细胞在激活后会迅速改变其功能程序，从而改变基因表达谱。例如，在细胞分化、形态发生和功能刺激（如免疫细胞的激活）过程中，或在暴露于局部环境中的药物和其他因素后，基因表达会发生巨大变化。根据刺激类型和细胞类型的不同，这些变化可能迅速发生，并涉及基因调控的任何可能层面。揭示响应细胞对特定类型刺激/药物的所有分子过程，是分子生物学中最困难的任务之一。本文描述了一种能够同时分析多层基因调控的实验方案。我们特别比较了转录因子结合（染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq））、从头转录（4-硫尿苷测序（4sU-seq））、mRNA加工与降解以及翻译（核糖体谱分析）。通过结合这些方法，可以全面展示全基因组范围内的详细作用过程。
在分析快速适应或动态变化的系统时，尤其推荐对新转录的RNA进行测序，因为该方法能够反映在4sU暴露期间所有基因的转录活性（无论其表达上调或下调）。结合使用全RNA测序（total RNA-seq）与核糖体谱分析（ribosome profiling），还可用于计算RNA的周转率和翻译速率。对高通量测序结果进行生物信息学分析，可提供多种数据解析与解读手段。所获得的数据还能够追踪共转录及可变剪接等过程，此处仅列举部分可能的应用结果。
此处描述的联合方法可应用于不同的模式生物或细胞类型，包括原代细胞。此外，我们为所使用每种方法提供了详细的实验方案，包括质量控制步骤，并讨论了可能遇到的问题和注意事项。
引言
近年来，RNA测序（RNA-seq）已成为分析细胞或生物体内所有表达RNA的标准工具1然而，要全面理解细胞在特定刺激或药物作用下适应的整个过程，必须完整确定从mRNA转录到加工、降解及翻译等所有潜在的分子事件。由于总RNA水平的变化受到多种因素影响，总RNA测序难以准确检测RNA转录的短期变化。 例如 RNA半衰期与转录活性，其作为反映细胞对环境影响适应性的模板具有局限性2,3事实上，已开发出多种新的测序技术，可实现对基因调控过程中各个步骤的分析。4 当以正确方式组合时，本方案描述了如何结合一些较易实施的测序技术，以比较的方式追踪 mRNA 关键调控层次的变化。为分析转录活性，已有多种方法被提出，例如基因表达的帽子分析（Cap-analysis of gene expression, CAGE）5，原位延伸转录本测序（native elongation transcript sequencing, NET-seq）6，以及全基因组核内转录运行分析（GRO-seq）7,8，以及溴尿苷测序（Bru-seq）和4-硫尿苷测序（4sU-seq），这些方法利用可掺入新转录RNA中的代谢物9,10，仅举几例而言。尽管CAGE能够鉴定精确的转录起始位点，NET-seq和GRO-seq可提供关于转录方向的更准确信息，而4sU-seq（即本文所描述的方法）仅检测新转录的RNA。然而，4sU-seq具有高度敏感性，可在不同时间窗口中应用，以在快速变化的细胞中定量测量转录活性，以及在数分钟内发生的mRNA加工过程的定量变化9,11,12此外，4sU-seq 与 RNA-seq 联用可理想地用于计算基因的 RNA 降解速率9mRNA的转录由RNA聚合酶II（RNAPII）执行，而RNAPII又受到多种因素的影响，例如转录因子、组蛋白修饰以及通用激活因子/抑制因子，这些因子甚至可能成为转录复合物的一部分。为了检测某一因子结合在多少基因/启动子/增强子区域，已开发出染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）技术，由于存在大量商业化的抗体，该技术现已成为此目的的标准方法13然而，尽管 ChIP-seq 能够明确提供调控因子结合位置的信息，却无法反映其结合是否确实导致了转录水平的变化14因此，将 ChIP-seq 与 4sU-seq 联合使用是回答此类生物学问题的理想组合。基因表达的调控也可能发生在后续阶段，因为 mRNA 水平与蛋白质水平并不一定相关15,16，表明在翻译或翻译后水平上可能存在显著调控，具体取决于上下文。2011年，核糖体谱分析首次与RNA测序相结合，现已成为量化蛋白质快速变化的首选方法，因为质谱技术仍存在一定的灵敏度限制。17确实，通过这些方法获得的翻译速率已被证明能够相对较好地估计蛋白质水平的变化（至少在长期变化的测量中），并能对翻译过程提供更为详细的观察。 例如 起始端和可变翻译阅读框的确定17四种方法的联合使用可用于稳态条件、不同细胞类型之间，或对快速变化的细胞进行时间序列实验11该应用可提供转录因子结合变化对RNA转录、加工及翻译影响的全基因组范围概览。
方案
所有方法均符合德国慕尼黑亥姆霍兹中心的机构、州级和联邦级指导方针。
1. 准备
- 制定详细的实验设计计划，包括时间安排、向细胞培养基中添加4sU的时间以及每种方法对应的细胞收获时间。根据具体的生物学问题，仔细考虑取样时间点、4sU标记时长及其浓度表1).
注意：请预先验证 4sU 对细胞活力和应激反应的影响（参见 "验证最佳的4sU标记条件" 在代表性结果中 图1建议至少使用一个样本对每种方法进行预实验。验证RNA/DNA的质量和数量是否足以进行深度测序（参见方案中相应部分），并在实验过程中练习快速而轻柔的细胞操作。 - 计算每种方法每个时间点所需的细胞数量（参见 表 2 使用原代T细胞时可进行粗略估算）。此外，与仅对4sU RNA进行测序相比，可考虑减少总RNA测序的样本数量（例如，仅当需要计算时间点的翻译速率或RNA降解速率时）。为确认和验证结果的显著性（推荐做法），应至少设置一个生物学重复。
注意：重要的是，所有方法及连续时间点的样本必须来自同一初始细胞池。建议每种方法至少由一名专职研究人员负责。 - 提前准备好所有必需的物品（例如，分装的4sU、环己酰亚胺、哺乳动物裂解缓冲液和1%甲醛。加入4sU后，应避免将细胞暴露于强光下，因为这可能导致4sU标记的RNA与细胞蛋白发生交联18.
- 在处理前将所有目标细胞汇集至一个培养瓶中（图2）。计数细胞（例如，用血细胞计数板计数后，取所需数量的细胞用于每种方法的未处理对照组（注意：4sU-seq 的未处理对照组也需标记 4sU）。将剩余细胞进行处理，并立即按每个时间点和每种方法所需数量分装。操作细胞时应尽可能迅速，以减少因温度或 CO₂ 变化所引起的应激2 水平。
注意：例如，在处理后1 h、2 h和3 h分别取样，然后将四分之一的细胞用于未处理对照，四分之三的细胞用于处理对照。
2. 4sU 标记
注意：本方案修改自 Rädle， 等人.19 有关4sU代谢标记的更多细节，请参阅其方案。对于所有方法及连续的时间点，样品必须源自相同的初始细胞池。
- 标记开始
- 使用前将分装的4sU解冻。在每个时间点直接将4sU加入含有目标细胞的培养基中（参见 表 2 关于推荐的T细胞数量，至少60 µ每时间点取 g RNA，轻轻混匀，放回培养箱。剩余 4sU 应丢弃（不可重新冷冻）。
- 标记结束时，收集细胞（例如，细胞刮刀），在 4℃ 下以 330 × g 离心 5 分钟 °C，置于可耐受高g力的聚丙烯管中。吸除培养基，加入RNA提取试剂（每3×10⁶细胞不少于1 mL）。6 细胞，具体推荐使用的细胞类型见材料部分）加入每个离心管中。充分重悬沉淀（每 3 x 10⁶ 个细胞使用 ≥1 mL 液体）。6 细胞），室温（RT）孵育5分钟，然后将样品在-20℃冷冻 °C. 样品可在 -20℃ 保存 °至少 1 个月，4 °C
注意： 用于RNA提取的试剂在接触皮肤或眼睛时具有极高危险性。操作时应格外小心，并遵守相关安全说明。.
- 使用改良的RNA分离方案进行RNA制备
- 每1 mL RNA提取试剂中加入0.2 mL氯仿，剧烈振荡15秒使其充分混匀。随后按照Rädle代谢标记实验方案中的步骤进行操作（步骤1–12，2. 采用改良Trizol法进行RNA提取）。 等人.19
- 测定RNA浓度（参见 材料表），按照制造商的说明进行操作。将此RNA同时用于总RNA测序（见步骤3. 总RNA测序），或保存于-80℃ °至少 1 个月保持在 C 条件下。
- 新转录RNA的硫醇特异性生物素标记
- 从 30 - 80 开始 µg 总细胞 RNA。60 µg RNA 应能获得足量的新生转录 RNA。
- 准备标记反应。按以下顺序移液（每份） µg RNA：1 µL 10x 生物素化缓冲液，7 µL RNA（含有1 µg RNA 溶于无核酸酶的 H2O）和2 µL 生物素-HPDP（1 mg/mL）。最后加入生物素-HPDP，并立即用移液器混匀。用铝箔包裹管子以避免强光照射。关于生物素-HPDP 的替代方案，参见讨论部分。室温下旋转孵育 1.5 小时。
- 离心适当的2 mL离心管（参见 材料表)，15,000 × g 离心 2 分钟。用移液器将所有生物素标记的 RNA 转移至预先离心过的 2 mL 离心管中，加入等体积的氯仿，剧烈混匀。孵育 2–3 分钟，直至两相开始分离且气泡逐渐消失。
- 在 4 °C 下以 15,000 x g 离心 15 分钟 °C. 小心地将上层水相转移至新管中。
- 重复步骤 2.3.3 和 2.3.4 一次。向水相中加入 10% 体积的 NaCl（5 M）和等体积的异丙醇。在 4°C 下以 20,000 × g 离心 20 分钟。 °C. 弃去上清液。
- 加入等体积新配制的75%乙醇。在20,000 x g离心。弃去上清液，短暂离心后去除残留乙醇。用30 - 100 μL溶液充分重悬 µL H2O（使用 1 µL H2O 型血 1 µ使用移液器混合步骤 2.3.1 中的输入 RNA。
- 通过电泳分析验证RNA完整性，或取一份等分试样后续验证。
- 新转录（标记）RNA与预先存在（未标记）RNA的分离
- 去除磁珠（参见 材料表) 来自 4 °C储存，并静置至少30分钟以使其恢复至室温。将4sU洗涤缓冲液（每样本3 mL）加热至65 °C.
- 配制 100 mM 二硫苏糖醇（DTT）溶液。使用超微量天平称取 DTT，并加入所需量的无核酸酶水。务必现用现配。使用 200 µ每样本升
- 加热生物素标记的RNA样本（1 µ克µL）至 65 °C下变性10分钟，立即置于冰上。加入100 µL链霉亲和素磁珠与生物素化RNA结合，在室温下旋转孵育15分钟。
- 放置合适的层析柱（参见 材料表 将每个样本的建议量加入磁力架中，并用1 mL室温的4sU洗涤缓冲液预平衡每根柱子。
注意：此步骤大约需要 5 - 10 分钟。如果任何一列在 5 分钟后仍未开始流出，请用戴着手套的手指轻轻按压柱子顶部。 - 将RNA/磁珠混合物加至每根柱子的中部。弃去穿流液，除非需要回收未标记的RNA；如果需要回收，则收集穿流液以及至少第一次洗涤液，并按照Rädle所述方法进行RNA回收。 等 （步骤 1 - 7，7. 回收未标记且未结合的 RNA）19.
- 用 0.9 mL 预热至 65°C 的 4sU 洗涤缓冲液洗涤三次 °分别加入来自步骤 2.4.2 的 C 组分和 0.9 mL 室温 4sU 洗涤缓冲液。
- 使用磁性微珠回收新转录的RNA。用移液器加入400 µ每份样品取适量充分分散的RT磁性微珠加入管中，并置于每根层析柱下方。用100 μL洗脱新转录的RNA µL 100 mM DTT。等待3分钟，然后用100进行第二次洗脱 µL 100 mM DTT。（可选：按照 Rädle 所述方法进行洗脱和回收） 等)19
- 用移液器吹打混合10次，充分混匀新转录的RNA/磁珠，然后按照制造商说明书进行后续操作。用11 μL洗脱液洗脱RNA µL 无核酸酶 H2O. 使用合适的荧光计定量RNA（参见 材料表）。RNA 可在 -80 保存 °至少 1 个月保持在 C 条件下。
注意：新转录的RNA可用于制备用于下一代测序的cDNA文库（参见 材料表 对于试剂盒选择建议或进一步的下游分析，大多数文库制备试剂盒所需的RNA量为100 - 500 ng（参见讨论部分）。
3. 总RNA测序
- 在使用改良的总RNA提取试剂进行RNA提取后，直接从4sU标记的RNA中获取RNA，用于总RNA-seq（参见步骤2.2.2）
- 进行文库构建时，将一份RNA样品稀释至终浓度为50 - 100 ng/µL。使用与新转录RNA文库构建相同的试剂盒。对于大多数文库构建试剂盒，100 - 500 ng RNA已足够
4. 核糖体图谱分析
注意：所有方法及连续时间点的样本必须来源于相同的起始细胞池。关于试剂盒选择的建议，请参见材料表。
- 核糖体保护片段（RPFs）的制备与分离：
- 为每个时间点使用适量的细胞（参考 表 2 对于推荐的T细胞数量）。按照制造商方案用环己酰亚胺处理贴壁细胞。
注意：环己酰亚胺具有高毒性，可能引起突变。避免皮肤接触和吸入。 - 从每个时间点收集非贴壁或半贴壁细胞，合并至一个聚丙烯管中，并将终浓度调整为 1 x 106 每毫升细胞特异性培养基中的细胞数（例如，补充T细胞RPMI培养基）。加入环己酰亚胺至终浓度为0.1 mg/mL，通过倒置聚丙烯管混匀，孵育1分钟。在4℃下以330 × g离心细胞5分钟 °C. 吸去培养基，并用至少10 mL含环己酰亚胺（终浓度为0.1 mg/mL）的PBS洗涤细胞。
- 在 4 °C 条件下，以 330 × g 离心 5 分钟 °C. 吸去培养基，加入 100 µL 哺乳动物细胞裂解缓冲液每 10 x 106 细胞。用移液器吹打混匀，并通过无菌的22-25号针头反复推出，以彻底裂解细胞。
- 将细胞裂解液转移至预冷的1.5 mL离心管中。冰上孵育10分钟，期间定期轻柔颠倒混匀。4℃下以20,000 × g离心10分钟。 °C 以澄清裂解液。将上清液转移至预冷的 1.5 mL 离心管中。
- 用无核酸酶水将裂解液稀释至1:10，测定A260使用分光光度计进行测定。以无核酸酶水作为空白对照，以哺乳动物细胞裂解缓冲液1:10稀释液作为标准品。计算A260/mL 浓度，根据以下公式计算：
(A260 细胞裂解液 - A260 哺乳动物裂解缓冲液) × 10 稀释因子 = A260/mL - 创建 200 µ将裂解液在冰上分装成 L 体积的等份，然后进行核酸酶处理。
注意：可选步骤，准备 100 µL 总RNA 分装，加入 10 µL 10% SDS，混匀，4℃保存 °C，并继续进行4.3.2。建议使用来自4sU标记RNA的总RNA（参见步骤3：总RNA测序）。
- 为每个时间点使用适量的细胞（参考 表 2 对于推荐的T细胞数量）。按照制造商方案用环己酰亚胺处理贴壁细胞。
- 核糖体足迹分析
- 立即进行核酸酶处理，切勿冷冻裂解液。每 A 加入 7.5 单位核酸酶（包含在推荐试剂盒中）260 裂解液的量。例如：80 A260/mL 裂解液 × 0.2 mL 裂解液 × 7.5 U/A260核酸酶 = 120 U 核酸酶。
注意：可根据制造商说明，对核酸酶消化进行滴定。 - 将核酸酶反应在室温下轻轻混匀孵育45分钟。分装200 μL后冻存 µ将裂解液用液氮分装成 L 份，并于 -80 保存 °C，或通过加入15 μL终止液终止核酸酶反应 µL RNase抑制剂加入至每个200 µL 等分试样，并继续进行步骤 4.3.2。
- 立即进行核酸酶处理，切勿冷冻裂解液。每 A 加入 7.5 单位核酸酶（包含在推荐试剂盒中）260 裂解液的量。例如：80 A260/mL 裂解液 × 0.2 mL 裂解液 × 7.5 U/A260核酸酶 = 120 U 核酸酶。
- RPFs 的纯化
- 解冻一份核酸酶消化的RPF样品，并加入15 µL RNase抑制剂。将样品置于冰上。
- 根据制造商的说明书纯化RPFs（推荐使用柱纯化法），并在分光光度计上测定RNA浓度。
- rRNA 耗竭
- 使用 5 µg 纯化的 RPF 用于 rRNA 耗竭。
- 按照制造商的说明书（步骤1-2，初级rRNA去除）进行rRNA去除。使用分光光度计测定去除rRNA后的RPF中RNA的浓度。
- RPF的PAGE纯化
- 使用500 ng的rRNA耗竭的RPF进行PAGE纯化。
- 为PAGE纯化准备RNA对照、样品和ladder。混合5 µL RNA 对照与 5 µL 变性凝胶上样缓冲液加入 0.5 mL 微离心管中。混匀 10 µ每种 RPF 的 L 与 10 µL 变性凝胶上样缓冲液。准备一份分子量标记物分装样本（4 µL 20/100 梯度，1 µ升无核酸酶水，和5 µL 变性凝胶上样缓冲液）。将其加在每个样品与对照之间，以防止交叉污染。
- 将样品和分子量标记物在95℃孵育以变性 °℃孵育5分钟，立即置于冰上。加入20 µ每份样品的 L（可选，上样 10） µL，并将剩余样品在20℃下冷冻 °C）间隔10 µ将 10 μL 已制备的分子量标记物加入 12% 或 15% 尿素-聚丙烯酰胺凝胶中。加载 10 µRNA对照的L。电泳至溴酚蓝条带到达凝胶底部（180 V，约70分钟）（图3).
- 根据制造商方案在 4 °C 对凝胶进行染色 °C. 使用发射蓝光的暗场透射光源观察RNA。根据RNA对照作为参考，切取各样本中长度约为28和30 nt的凝胶条带。
注意：RPFs 几乎不可见。即使样品不可见，也应按照 RNA 对照（包含长度为 28 和 30 nt 的两条寡核苷酸）所示的大小切取切片。 - 用无菌的20号针头在0.5 mL 微离心管底部刺一个小孔。将每块凝胶切片转移至单独的管中，并将带盖的管子放入1.5 mL 管内。在12,000 x g 离心2 min。如果凝胶切片未完全破碎进入1.5 mL 管中，则重复离心步骤。
- 用400 μL洗脱液从破碎的凝胶切片中洗脱RNA µ升无核酸酶水，40 µL 醋酸铵（5 M）和 2 µL SDS（10%）各4℃过夜 °C.
- 将悬浊液用1 mL移液枪头（宽口枪头或剪去末端自制的1 mL枪头）转移至1.5 mL滤管中（随推荐试剂盒提供）。在2,000 × g离心3 min，以分离洗脱的RNA与凝胶切片。轻柔地将水相溶液移入1.5 mL离心管中。加入2 µL 糖原（随推荐试剂盒提供）和 700 µL 100% 异丙醇，于 -20 ℃ 保存 °在 C 条件下至少 1 小时。
- 在 4 ℃ 离心 °在 4 °C 下，以 13,000 x g 离心 20 分钟。弃去上清液。用预冷的新鲜配制的 80% 乙醇洗涤沉淀 °C，13,000 x g 离心 10 分钟。弃上清，空气干燥。每份样品重悬于 20 µL 和 8 中的 RNA 控制 µL 无核酸酶水。-20℃保存 °C 如有需要。
- 片段化、末端修复、3' 接头连接、逆转录
- 按照制造商提供的方案进行操作（片段化与末端修复、3'接头连接以及反转录）。
- PAGE 纯化 cDNA
- 准备样品、RNA对照和分子量标记物用于PAGE纯化：混合10 µ每份样品和 RNA 对照各取 10 μL µL 变性胶上样缓冲液。准备一份ladder等分试样（4 µL 20/100 梯度，1 µ5 微升无核酸酶水 µL 变性凝胶上样缓冲液）。将其加在每个样品与对照之间，以防止交叉污染。
- 将样品和分子量标记物在95℃孵育以变性 °℃孵育5分钟，立即置于冰上。加入20 µ每份样品的 L（可选，加载 10） µL，并将剩余样品在20℃下冷冻 °C）间隔为10 µ将10 μL制备好的ladder加样至10%聚丙烯酰胺/7 - 8 M尿素/TBE凝胶中。加样10 μL µL的RNA对照。电泳至溴酚蓝完全迁出凝胶（180 V，约60分钟）。
- 根据制造商方案在 4 °C 对凝胶进行染色 °C. 使用发射蓝光的暗场透射仪观察RNA，并切下每个样品中对应于约70 - 80 nt的凝胶条带。
- 按照第4.5.5–4.5.8步所述操作，并将每个样品重悬于10 µL 无核酸酶水
- cDNA 环化
- 在冰上混合以下试剂，为每个样本配制足够的环化主混合液：4.0 µL 环化反应体系，2.0 µL ATP，2.0 µL MnCl2，以及 2.0 µL连接酶。
- 加入10 µ将主混合液各 L 加入每个样本中。轻轻混匀并短暂离心。将样本在 60 ℃ 下孵育 °4°C 下孵育 2 小时。立即将样品置于冰上。
- PCR 扩增
- 按照制造商的说明书进行PCR扩增（步骤1-3）。使用4 µL的环化cDNA用于初级T细胞的扩增，进行9个PCR循环，以获得最佳结果。
- 根据制造商的说明书纯化文库并检测其片段大小分布（步骤4-8，PCR扩增）。扩增后文库的预期大小为140 - 160 bp（参见 图4).
- 对于测序文库，请参考生产商的方案以及测序平台的进一步指导。
5. ChIP-Seq
注意：本实验方案修改自 Blecher-Gonen, 等人.14 有关 ChIP-seq 的更多细节，请参考其方案。所有方法及连续时间点的样本必须来源于同一初始细胞池。
- 细胞交联与收获
- 交联适量的细胞（参考 表 2 每个时间点推荐的T细胞数量）加入终浓度为1%的甲醛，溶于细胞特异性培养基中（例如，室温下轻轻摇动孵育10分钟。加入甘氨酸至终浓度为0.125 M，以终止交联反应。
- 在 4°C 下以 330 × g 离心 5 分钟 °C. 弃去上清液，用预冷的 PBS 洗涤细胞。重复步骤 5.1.2 两次，将细胞沉淀在 -80 ℃ 冻存。 °C. 冻存的沉淀物可保存至少6个月。
- 细胞裂解与超声处理
注意：在所有细胞裂解和超声处理步骤中，样品必须置于冰上或4℃环境中。 °C 以最大限度减少交联逆转和蛋白质降解。- 将细胞沉淀重悬于 1 mL 冰冷的细胞裂解缓冲液中，缓冲液需新鲜添加蛋白酶抑制剂（可选择性加入磷酸酶抑制剂）以分离细胞核。冰上孵育 10 分钟，于 4 ℃ 以 2,600 × g 离心 5 分钟 °C.
- 吸弃上清液，将核沉淀重悬于1 mL预冷的核裂解缓冲液中（需新鲜添加蛋白酶抑制剂，可选：同时添加磷酸酶抑制剂）。冰上孵育10分钟。超声处理细胞，使DNA片段化至平均大小为0.2–1.0 kb（见 图5).
注意：超声处理条件需根据细胞类型及其他条件进行优化（例如，细胞数量、体积和缓冲液）。对于原代T细胞，建议进行20至25个循环的超声处理（详见材料部分的详细说明）。 - 取 20 - 50 µ取一份剪切后的染色质样品，95℃加热10分钟 °C并以1,000 rpm振荡进行快速逆转交联，以验证染色质片段大小。加入2 - 5 µL Proteinase K，56℃孵育20分钟 °C，1,000 rpm 振荡。95℃ 加热失活 10 分钟。 °C 和 1,000 rpm 振荡。使用合适的试剂盒纯化染色质（参见 材料表在1%琼脂糖凝胶上检测染色质片段大小，并使用100 bp Plus Marker。
- 将剪切后的染色质在 4°C 下以 20,000 × g 离心 10 分钟，DNA 平均片段大小为 0.2–1.0 kb °C，以沉淀不溶性染色质和碎片。将上清液转移至新管中，置于冰上保存。
- 保留 5 - 10% 的超声处理后染色质作为输入样品，于 -20 ℃ 冻存。 °C（用于步骤 5.5.2）。
- 将抗体偶联至磁珠
- 耦联 10 µg 抗体（例如，抗RNA聚合酶II；抗组蛋白H3K36me3）在220 µL PBS（含0.5% BSA和0.5% Tween 20）至80 µL 超顺磁性珠粒与蛋白G偶联（参见 材料清单在室温下旋转孵育至少1小时。
- 将试管置于磁架上，待所有磁珠完全吸附至管壁后，小心移除上清液。随后用 6 µ将鲑鱼精子DNA在含0.5% BSA和0.5% Tween 20的PBS中，室温旋转孵育30分钟进行超声处理。
- 将离心管置于磁力架上，待所有磁珠完全吸附至管壁后，吸除上清液。用 ChIP IP 缓冲液洗涤磁珠三次。
- 染色质免疫沉淀
- 将染色质用含有新鲜添加的蛋白酶抑制剂（可选：磷酸酶抑制剂）的细胞核裂解缓冲液稀释至总体积1 mL。加入含有新鲜添加的蛋白酶抑制剂（可选：磷酸酶抑制剂）的ChIP免疫沉淀缓冲液，使最终体积为3 mL。置于冰上或4°C保存。 °C，同时将抗体与磁珠偶联。
- 将稀释后的染色质加入第5.3.3步中与抗体偶联的磁珠中，4℃孵育过夜 °C，轻轻旋转。
- 用以下缓冲液洗涤（每种1 mL，参见 材料表在室温下旋转孵育5分钟，将离心管放回磁力架上，依次去除上清：洗涤缓冲液I、洗涤缓冲液II、洗涤缓冲液III和2×TE pH 8.0。
- 弃去上清液，室温晾干约 5 分钟。
- 逆转交联
- 从磁铁上取下样品。加入 50 µ加入 L 洗脱缓冲液，用移液器吹打混匀，以从磁珠中洗脱蛋白-DNA 复合物。
- 从该步骤开始保留输入样品。向输入样品中加入洗脱缓冲液，使最终体积为 50 µL（以保持缓冲液组成与ChIP样品相似），并与ChIP样品一同处理。
- 混合 3 µ洗脱缓冲液的L和2 µL RNase（无DNase）。加入5 µ将混合液各 L 加入每个样品中，37℃孵育 30 分钟 °C.
- 混合 2.5 µL蛋白酶K，1 µL 甘氨酸和 1.5 µ每份样品加入 5 μL 洗脱缓冲液。添加 5 µ将混合液的 L 加入每个样本（1 U 蛋白酶 K 和 20） µ每份样品加入 g 糖原，37℃孵育 2 小时 °C.
- 在 65 ℃ 孵育样品 °在4°C下振荡孵育过夜（至少4小时），以进行逆转交联。
- 将离心管置于磁力架上至少 30 秒，然后将上清液转移至新的离心管中。样品可在 -20 ℃ 冷冻保存。 °C，最长可保存 12 个月。
- DNA 纯化
- 加入140 µL 的均匀分散的顺磁性微珠加入至 60 µ样品体积为 L（2.3:1 比例）。用移液器轻轻吹打 25 次以充分混匀，确保每管中液体均一。室温孵育 2 分钟。将管子置于磁力架上 4 分钟，或直至所有磁珠完全吸附至管壁，弃去上清液。
- 将离心管置于磁力架上，加入 200 µL 新鲜配制的70%乙醇。将离心管静置孵育30秒，避免扰动磁珠。弃去上清液，并重复此步骤一次。彻底吸除乙醇，让磁珠在空气中干燥4分钟。
注意：乙醇去除不完全可能会显著降低DNA的回收率和得率。仅将沉淀干燥至干燥即可。过度干燥沉淀可能会降低DNA的回收率和得率。 - 从磁铁上取下试管，加入 20 µL 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)。轻轻吹打混匀25次，确保充分混合。室温孵育2分钟。将离心管重新置于磁力架上4分钟，转移上清液至另一管中。
- 使用合适的荧光计测量DNA的量（参见 材料表).
- 通过qPCR验证ChIP是否成功（稀释1） µL 在 100 中 µl H2O 并使用 2 - 5 µ用于 qPCR）。使用特异性引物针对阳性对照（目标蛋白的已知结合位点）和阴性对照（例如一个沉默的基因和/或非目标蛋白作用的基因。
注意：根据所用试剂盒的不同，文库制备可使用低至2 ng的ChIP DNA（参见 材料表 关于试剂盒选择的建议。
结果
4sU标记：验证最佳条件 4sU标记条件（凋亡、核应激、胞质应激）、时间及浓度： 高水平的4sU可抑制rRNA的生成与加工，并诱导细胞质及细胞核应激30因此，应检测目标细胞在4sU作用下是否产生应激反应以及是否发生凋亡。建议通过蛋白质印迹（Western blot）分析检测p53的累积，以反映核内应激；检测磷酸化EIF2a水平的升高，以显示胞质应激；并通过荧光激活细胞分选（FACS）分析检测细胞凋亡。可使用高浓度及长时间的4sU处理，或使用毒胡萝卜素（thapsigargin）、亚砷酸盐（arsenite）等药物诱导细胞应激。为诱导细胞凋亡或细胞死亡，细胞可用BH3I-1（500 ng/µL）或在5分钟内孵育 95 °C （热休克）。采用Annexin V/7-AAD染色法检测凋亡细胞（Annexin V）和死亡细胞（7-AAD）。标记 体外 生成初始 Th1 细胞 0.5 小时 500 µM 4sU（终浓度）或 1 小时 200 µM 4sU 既不诱导细胞应激迹象，也不诱导细胞凋亡（图1但可导致足够的4sU掺入。
RNA标记时间也可缩短（≤5 min），这将导致与较长标记时间相比，短寿命的内含子序列增加。为可视化共转录剪接速率，4sU标记时间不应超过30 min。有关4sU标记的更多细节，请参见Rädle 等.19
质量控制：在处理 RNA 时，RNA 的完整性至关重要。可在生物素化后通过电泳分析检测 4sU 标记 RNA 的质量（参见材料表）。建议对步骤 2.2.2 中分离得到的 RNA 进行验证，尤其是在将其用于总 RNA 测序时。RNA 完整性数值（RIN）应 ≥8，以确保 RNA 完整性满足后续实验要求（图 3）。
电泳分析也可用于验证新转录的RNA。需要注意的是，新转录的RNA所含成熟rRNA显著少于总RNA，其典型的rRNA条带也相应较弱。
核糖体谱分析：cDNA文库的PCR扩增： cDNA扩增（步骤4.9.1）是确保获得良好测序结果的关键步骤。通过电泳分析扩增后的文库。良好的扩增文库样本在140 - 160 bp处呈现一个主峰（图4A）。应避免出现过量的接头二聚体（图4B），此类样本需根据制造商说明书采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）纯化程序进一步纯化（PCR产物的PAGE纯化）。过多的模板或过多的PCR循环次数可能导致过度扩增，表现为出现高于预期分子量的条带、弥散的PCR产物以及接头二聚体产物（图4C）。对于大多数样本，使用1 - 5 µL环化cDNA并进行9轮PCR扩增，通常即可获得足量的正确PCR产物。
ChIP：染色质剪切： 每种细胞类型的最优剪切条件均需进行调整。确定剪切条件（例如，循环次数，高功率或低功率）预先设定好。出于检测目的，应使用相同数量的细胞和相同体积，因为较低的细胞密度会提高剪切效率。应尽量避免染色质剪切过度或不足。过大的染色质片段可能因堵塞而显著影响ChIP结果，而剪切过度则可能破坏目标蛋白上的表位，导致抗体结合效率降低。在本实验中，当剪切后染色质的主要片段大小约为1,000 bp或略低时，获得了最佳结果（图 5A).
通过 qPCR 验证 ChIP：在开始 ChIP 实验之前，建议通过 ChIP-qPCR 检测所用抗体是否适用于 ChIP（如有可能，应使用经 ChIP 验证级别的抗体）。在开始文库构建之前，需通过 qPCR 验证用于测序的 ChIP 效果（参见步骤 5.6.5）。设计可结合目标蛋白已知结合位点的引物。如果目标蛋白在基因内的精确结合位点未知，可使用多对引物扫描该基因及其相关调控元件。对于 Th1 细胞中经刺激后转录上调的 Ifng 基因的 RNAPII ChIP，可使用 Ifng 和 actin 引物作为阳性对照。Sox9 和 insulin 可作为阴性对照，因为这些基因在 Th1 细胞中不表达（图 5B）。注意不要使用通常用于 mRNA qPCR 的跨外显子引物。也可使用 IgG 对照以验证所用抗体的特异性。免疫沉淀的 DNA 可使用合适的荧光计进行定量（参见材料表）。IgG 对照非特异性结合的 DNA 量应显著低于目标抗体结合的 DNA 量。
重复实验：生物学显著性的证明 强烈建议所有方法的动能实验均从同一细胞池开始进行，以确保所有未处理和已处理样本中的细胞具有相同的特性图2）。然而，建议为每种方法的主要时间点取少量等分试样，以便将样本与生物学重复进行比较（例如，通过qPCR、FACS分析）。这可粗略估计两个重复样本的处理是否具有可重复性，从而决定是否进行测序。重复样本的验证应通过生物信息学分析进行。结果的可重复性可通过重复样本间FPKM值的相关性进行评估，并使用散点图进行可视化图6).
图 1：在不干扰细胞生理状态的前提下验证最佳 4sU 标记条件（引自 Davari et al.11）
(A) 通过 FACS 分析检测细胞凋亡：体外 生成的 Th0 细胞分别用不同浓度的 4sU（括号中所示）处理 0.5 h、1 h 和 2 h。采用 BH3I-1 处理以 Annexin V 检测诱导的凋亡，热激处理（95 °C 下 5 min）用于诱导细胞死亡，并通过 7-AAD 检测。(B) 经 4sU 处理并活化的 T 细胞中 p53 的蛋白质印迹分析：除 0.5 h 时间点使用 500 µM 4sU 标记外，其余样品均使用 200 µM 4sU 标记，并在指定的活化时间进行标记。(C) 在活化的 Th1 细胞中，采用与 (B) 相同的标记条件对磷酸化-EIF2a 和总 EIF2a 进行蛋白质印迹分析。Thapsigargin 作为阳性对照。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 2：用于追踪全基因组动态变化的动力学实验设计示意图
该示意图展示了将 4sU-seq、总 RNA-seq、核糖体谱分析（Ribosome Profiling）和 ChIP-seq 相结合，以研究细胞处理后全基因组变化的实验设计。收集细胞并预留所需数量的细胞作为未处理对照组。对剩余细胞进行处理，并根据每种方法和时间点进行分样。按照描述，使用 4sU 对未处理/处理的细胞进行标记以用于 4sU-seq。各方法对应的时间点和样本数量取决于所研究的具体生物学问题。针对每个时间点和每种方法采集样本，并依照本实验方案中对应的部分进行操作。请点击此处查看该图的高清版本。
图3：4sU标记RNA的质量控制
对活化的Th1细胞提取的总RNA和生物素化RNA使用Bioanalyzer进行分析。图中显示了18S rRNA和28S rRNA条带，仪器给出RNA完整性数值（RIN）以评估RNA完整性。为确保RNA完整性，RIN应≥8。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：核糖体分析文库的Bioanalyzer检测图谱
(A) 优质文库：样本在预期大小范围（140 - 160 bp）处出现明显峰，无需进一步纯化。(B) 该样本中接头二聚体扩增产物（120 bp）相对于目标产物（140 - 160 bp）过多，此文库需进一步纯化。(C) 过量扩增样本：可见高于预期的分子量峰及弥散的PCR扩增子（箭头所示）。请点击此处查看该图的放大版本。
图5：染色质剪切后的最佳片段大小及通过qPCR验证的ChIP结果
(A) 琼脂糖凝胶图像显示了三个样品经超声波剪切25个循环后所得染色质的最优片段大小，染色质提取与纯化步骤如本实验方案前文所述。(B) 总RNA聚合酶II（RNAPII）ChIP（抗RNA聚合酶II抗体，8WG16，ab817）的qPCR结果以输入DNA百分比表示。Ifng 和 actin 引物作为阳性对照，而 Sox9 与 Insulin 为阴性对照（这两个基因在活化的Th1细胞中不表达）。请点击此处查看该图的放大版本。
图6：生物学重复样本的比较（来自Davari et al. 11 的图）
该代表性散点图比较了刺激活化的Th1细胞4小时后新转录RNA（4sU）的重复样本之间的表达值（FPKM）。绿色线表示相等的FPKM值，每个图中均标示出秩相关系数。
| 标记持续时间（分钟） | 推荐的 4sU 浓度（µM） |
| 120 | 100 - 200 |
| 60 | 200 - 500 |
| 15 - 30 | 500 - 1000 |
| <10 | 500 - 2000 |
表1：推荐的4sU浓度（来自Rädle， 等.19)
不同标记时间下推荐的4sU浓度范围如图所示。
| 方法 | 细胞数量 | RNA 量 |
| 4sU 标记 | ≥2 x 107 | ≥60µg |
| 核糖体谱分析 | ≥2 x107 | |
| ChIP-seq | ≥2 x 107 - 3 x 107 |
表2：所需原代T细胞的数量
每种方法所需的原代T细胞最低数量。若使用其他细胞类型，所需数量可能更少。
讨论
要充分理解细胞在特定刺激或处理下的适应过程，必须分析基因调控的整个过程。在不同时间点结合使用总RNA测序（total RNA-seq）、4-硫尿苷测序（4sU-seq）、核糖体谱分析（ribosome profiling）和染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq），可实现对基因调控主要过程随时间变化的全面分析。为设计实验方案并确定最佳时间点，需要对生物学过程有深入的理解。
由于研究基因调控的方法正在迅速发展，这些实验方案可适应快速的变化。然而，它们仍是研究各类细胞中基本基因调控机制的最重要方法。本文将讨论使用这些方法时需要注意的一些潜在问题和关键事项。
细胞：细胞必须具有高活性，若使用原代分离细胞，则需保证细胞群体的纯度（例如，通过FACS分析检测原代T细胞）。即使是轻微应激的细胞也可能影响这些高度敏感的测序方法的结果，降低新转录或新翻译RNA的产量，并在测序结果中产生非预期的应激反应信号。本方案中提及的用于沉淀细胞的离心速度已针对原代T细胞进行优化，因此请根据具体细胞类型调整离心速度。
4sU 对细胞生理学的影响： 除了上述用于验证添加 4sU 后对细胞生理学影响最小化的选项外，还可以进行进一步和/或额外的分析，尤其是在细胞数量有限的情况下。可通过简单计数标记和未标记的细胞来验证细胞倍增时间，以检测对细胞增殖的影响。也可通过核仁素和细胞核的免疫荧光染色分析细胞形态，检测是否诱导了核仁应激。为进一步验证 4sU 的影响，可通过将标记的总 RNA 与未标记的总 RNA 的测序读数进行比对，测量全局基因表达的改变情况。
细胞数量： 对于 体外 生成的T细胞，我们建议至少从上述指出的细胞数量开始 Table 2根据细胞类型选择每种方法所需的适当细胞数量。由于T细胞的细胞质和RNA含量较其他细胞少，因此其他细胞所需数量可能更少。对于ChIP-seq，细胞数量很大程度上取决于所用抗体以及目标蛋白在细胞中的表达水平。对于组蛋白或RNA聚合酶II（RNAPII）的ChIP，可使用较少细胞，而当检测转录因子时，尤其是低表达水平的转录因子，需增加细胞数量。
4sU标记与RNA生物素化： 使用贴壁细胞时，4sU标记可按照Rädle et al.19 所述方法进行。由于细胞对4sU的摄取非常迅速，因此可直接将其加入悬浮细胞、贴壁细胞或半贴壁细胞的培养基中。
建议使用 60 - 80 µg RNA 开始生物素标记。然而，也可使用更少的 RNA 量，尽管我们未测试低于 30 µg 的情况。在沉淀 RNA 时，若沉淀物难以观察，可加入共沉淀剂（例如，GlycoBlue）。Duffy et al. 还表明，甲基硫代磺酸盐活化的生物素（MTS-biotin）与 4sU 标记的 RNA 反应效率高于 HPDP-biotin31。因此，可考虑改用 MTS-biotin，特别是对于尿苷残基较少的小 RNA 回收而言（参见 Duffy et al. 提及的生物素标记方案；见“4sU 标记 RNA 的纯化”，实验步骤）。
为了回收新转录的RNA，可以使用磁性磁珠或自行选择的RNA纯化磁珠。务必注意，这些试剂盒可能针对特定RNA进行纯化，也可能不进行纯化。例如，如果您关注的是miRNA，请考虑使用专门用于miRNA捕获和测序的试剂盒。
新转录RNA的定量：为了准确量化新转录的RNA，应使用合适的荧光计进行测量（参见材料表）。在4sU标记1小时内，新转录的RNA约占总RNA的1 - 4%。标记1小时的活化T细胞中新转录的RNA中，约有90 - 94%为rRNA11。
核糖体谱分析：在建立该方法时，我们发现使用比原始方案建议量高1.5倍的核酸酶可确保充分消化。目前尚未有关于增加核酸酶用量产生不良影响的报道。由于核糖体保护片段（RPFs）在被核糖体蛋白结合时很难发生过度消化，因此可略微增加核酸酶用量，以滴定出最佳的消化效果。
如果在步骤 4.4.2 中回收的 RPF RNA 少于 500 ng，则重复核糖体 RNA 耗竭步骤，并使用 RNA Clean & Concentrator-5 柱合并纯化的 RPF。或者，在凝胶上（步骤 4.5.3）并排加载两个相同的样品，并在从凝胶中洗脱 RNA 时（步骤 4.5.6）合并凝胶切片。
我们建议在凝胶上尽可能紧贴28和30 nt条带切取RPFs。这有助于去除来自rRNA和tRNA的不需要的片段，避免这些片段进入文库并降低RPFs的测序读长数。
在凝胶纯化过程中，还建议避免紫外线照射。紫外线可能导致RNA片段产生切口以及嘧啶二聚体，最终严重影响文库构建和测序结果。
文库制备与数据测序： 核糖体谱分析（ribosome profiling）方案可用于构建适用于测序的 cDNA 文库。通过 4sU 标记生成的样品可直接用于文库制备，并可配合任何合适的 RNA 测序试剂盒使用。由于新转录的 RNA（尤其是在使用短时间标记时）可能尚未发生多聚腺苷酸化，因此不应进行多聚(A)选择。相反，我们强烈建议进行核糖体 RNA（rRNA）耗竭，以避免降低实际样品的测序深度。在使用 T 细胞时，我们起始使用 400 ng 新转录 RNA 和总 RNA（具体用量取决于所用试剂盒，参见材料部分），进行 rRNA 耗竭处理，并减少 PCR 扩增循环次数，以最小化 PCR 偏倚。文库制备可使用更少的起始材料，但需根据文库复杂性优化 PCR 循环数。
对于 ChIP-seq，市面上也有多种文库构建试剂盒可供选择。在我们的实验中，从 2 ng ChIP DNA 起始进行文库构建效果良好（参见材料部分关于试剂盒选择的建议）。测序时务必检查索引的颜色平衡。我们建议 4sU-seq、总 RNA-seq 和 ChIP-seq 样本的测序深度均达到 ≥40 × 106 条读长，核糖体谱分析样本则建议 ≥80 × 106 条读长。测序深度取决于样本类型及后续的生物信息学分析，应谨慎评估。若需分析内含子区域的读长以研究共转录剪接，应选择 100 bp 双端测序。
测序偏差：测序已成为确定转录、翻译或转录因子结合全局变化的金标准。近年来，现有方法已被推向极限，或开发出新技术以对起始量极低的RNA进行测序。这需要对cDNA进行扩增，从而引入噪声或偏差。最近开发了唯一分子标识符（UMIs），用于实验性识别由PCR引入的重复序列。最近研究表明，UMIs仅能轻微提升差异基因表达分析的测序效能和降低假阳性发现率32。尽管如此，建议在构建所有测序文库时使用唯一分子标识符（UMIs）以控制文库复杂性，尤其是在起始RNA量较低且需要较多PCR循环次数的情况下。
缓冲液与贮存液：用于 4sU-seq 和核糖体谱分析的所有缓冲液必须在严格无 RNase 的条件下配制，并使用无核酸酶的水。建议购买预先制备好的无核酸酶 NaCl、Tris-HCl、EDTA、柠檬酸钠和水。为确保无核酸酶环境，可使用 RNase 去污染溶液清洁移液器或实验台面。ChIP-seq 所用的所有缓冲液至少应为无 DNase 的，可在室温下保存。使用前应立即加入蛋白酶抑制剂，以及可选的磷酸酶抑制剂，并置于冰上保存。
生物信息学：所有测序数据（即，ChIP-seq、RNA-seq 和核糖体谱分析）的分析包括质量控制（例如，使用 FastQC，http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）、接头序列修剪（例如，使用 cutadapt20），随后将序列比对至所研究细胞的参考基因组。对于 RNA-seq 数据（包括总 RNA-seq 和 4sU-seq）以及核糖体谱分析数据，需使用可处理剪接的 RNA-seq 比对工具，例如 ContextMap 221。对于 ChIP-seq 数据的非剪接比对，使用 BWA-MEM22 即可。在使用程序（例如 featureCounts23）确定每个基因的读段数后，可采用 RPKM 模型（每百万比对片段中每千碱基外显子的读段数）1 计算基因表达量。从 ChIP-seq 数据中进行峰识别时，可选用多种程序，例如 MACS24 或 GEM25。进一步的下游分析可在 R26 中进行，特别是利用 Bioconductor 项目提供的工具27。
这里，整合4sU标记的RNA水平、总RNA水平以及核糖体谱分析所获得的翻译活性数据时，主要挑战在于标准化。解决该问题的经典方法是使用看家基因的表达水平进行标准化。为降低个别看家基因因随机波动带来的噪声，建议不单独使用少数几个看家基因，而是采用一组较大量看家基因的中位表达水平进行标准化。 例如 的 >Eisenberg 和 Levanon 汇编的 3,000 个持家基因28. 通过4sU-RNA与总RNA比值计算RNA降解速率时，标准化基于中位数降解速率进行（例如（假设RNA半衰期为5小时）29然而，由于该假设基于管家基因无整体变化的前提，我们建议采用不依赖标准化的分析方法。 例如基于相关性的聚类分析不同数据类型的时间序列，以鉴定在细胞激活过程中转录和翻译行为 distinct 的基因群组。关于不同数据类型生物信息学整合的详细描述，我们参考原始发表文献。11.
降解速率分析与数据整合： 一篇近期发表的论文33比较了通过多重基因控制（MGC）方法与全局性方法测定的半衰期，结果表明，与其他方法（例如，使用药物普遍抑制转录）相比，MGC测得的半衰期与代谢标记方法获得的结果相关性最佳。然而，应当指出，不同半衰期计算方法之间可能存在差异，且已有相关报道15,34。我们已尽可能排除了因长时间4sU暴露所引发的应激反应带来的多数问题和差异。因此，排除4sU标记所引入的应激反应至关重要。为进一步验证降解速率，我们推荐使用MGC方法。
此外，此处生成的数据集也可用于更综合的数据分析（例如，长链非编码RNA的调控）35,36。
披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
我们感谢Lars Dölken在建立原代T细胞4sU标记方面的建议；感谢Elisabeth Graf和Thomas Schwarzmayr在文库构建和测序过程中提供的关键帮助；感谢Dirk Eick和Andrew Flatley提供RNAPII和T细胞抗体；感谢N. Henriette Uhlenhaut和Franziska Greulich在ChIP-seq文库制备方面的帮助；Caroline C. Friedel的研究得到了德国研究基金会（DFG）项目FR2938/7-1和CRC 1123（Z2）的资助；Elke Glasmacher的研究得到了德国研究基金会（DFG）项目GL 870/1-1以及德国糖尿病研究中心（DZD）、慕尼黑亥姆霍兹中心的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4sU标记 | |||
| 4-硫代尿苷（100 mg） | Carbosynth | 13957-31-8 | 在无菌 H2O/PBS 中配制 50 mM 储存液；储存于 –20°C，分装为 50–500 份 µl；切勿再次冷冻。 |
| 1.5 ml 安全锁扣管 | Eppendorf | 30121589 | 可选 |
| 1.5 ml 螺口聚丙烯管 | Sarstedt | 72692005 | 与二甲基甲酰胺兼容 |
| 15 ml 离心管 | BD Falcon | 352096 | 与二甲基甲酰胺兼容 |
| 2.0 ml 螺口聚丙烯管 | Sarstedt | 72694005 | 与二甲基甲酰胺兼容 |
| 50 ml 离心管 | BD Falcon | 352070 | 与二甲基甲酰胺兼容 |
| Agencourt RNAClean XP | Beckman Coulter | A63987 | 我们建议使用这些磁性微珠。分装后于4℃保存°C |
| 氯仿 | Sigma Aldirch | 372978 | 警告 – 危害健康 |
| 二甲基甲酰胺 | Sigma Aldrich | D4551 | |
| 二硫苏糖醇 (DTT) | Roth | 6908.1 | 以无核酸酶的 H2O 配制 100 mM DTT 溶液2O；务必现配现用 |
| 乙醇 | 默克 | 1.00983.1000 | |
| EZ-Link Biotin-HPDP（50 mg） | Pierce | 21341 | 通过将 50 mg Biotin-HPDP 溶解于 50 ml DMF 中，配制 1 mg/ml 储存液。轻微加热可促进溶解。4 ℃ 保存°C 分装成每份 1 ml。DMF 可溶解某些塑料材料。我们建议使用玻璃移液管将 DMF 从其原装玻璃瓶转移至 50 ml Falcon 管中。 |
| 高灵敏度 DNA 试剂盒 | 安捷伦科技 | 5067-4626 | |
| 异丙醇 | 默克 | 1.09634.1011 | |
| NaCl (5 M) | Sigma Aldrich | 71386 | 储存液 |
| 无核酸酶的EDTA（500 mM），pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | 储备液 |
| 无核酸酶的 H2O | Sigma Aldrich | W4502 | 储存液 |
| 无核酸酶 Tris Cl (1 M)，pH 7.4 | Lonza | 51237 | 储存液 |
| Phase Lock Gel Heavy 管（2.0 ml） | 5Prime | 2302830 | 步骤1.3.4中使用 |
| 聚丙烯 15 毫升离心管 | Greiner Bio-One | 188271 | 或同等规格；需耐受高达 15,000 × g |
| QIAzol 裂解试剂（200 ml） | Qiagen | 79306 | 使用此类或同等的TRI试剂进行RNA提取，警告 – 腐蚀性且危害健康！确保立即可获取苯酚解毒剂（PEG-甲醇） |
| Qubit RNA HS 检测试剂盒 | Life Technologies | Q32852 | 在步骤 1.4.11 中使用该试剂盒定量 RNA 量 |
| RNeasy MinElute 试剂盒 | Qiagen | 74204 | 可选；包含缓冲液 RLT |
| 柠檬酸钠 | Sigma Aldrich | C8532 | 使用无核酸酶水配制 1.6 M 储存液 |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| µMacs链霉亲和素试剂盒 | Miltenyi | 130-074-101 | 4°C 保存°C，包括 µ步骤 1.4.6 中使用的 Macs 柱（室温保存） |
| 细胞活力与应激检测 | |||
| PE Annexin V 凋亡检测试剂盒 I | BD Biosciences | 559763 | 可选 |
| 毒胡萝卜素 | Sigma-Aldrich | T9033 | 可选 |
| p53 | abcam | ab26 | 可选 |
| p-eIF2α (Ser51) | 细胞信号传导 | 9721 | 可选 |
| BH3I-1 | Sigma-Aldrich | B 8809 | 可选 |
| 缓冲液 | |||
| 4sU 洗涤缓冲液 | 室温保存 | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20，溶于无核酸酶的 H₂O 中2O | |
| 生物素化缓冲液（10×） | 4°C 保存 °C | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA，溶于无核酸酶水中；分装为1 ml每管；4℃保存°C | |
| RNA 沉淀缓冲液 | 室温保存 | 1.2 M NaCl，0.8 M 柠檬酸钠溶于无核酸酶水中。需在无核酸酶条件下预先配制。置于 50 ml 离心管中，室温保存。 | |
| 设备 | |||
| 2100 Bioanalyzer 仪器 | 安捷伦 | G2939BA | |
| RNA 6000 Nano 试剂盒 | 安捷伦 | 5067-1511 | 使用该试剂盒在步骤 1.3.10 中验证 RNA 完整性 |
| RNA 6000 Pico 试剂盒 | Agilent | 5067-1513 | 可选 |
| 紫外/可见光分光光度计 | 赛默飞世尔科技 | NanoDrop 1000 | 或同等物。在步骤 1.2.2/3.1.8/3.3.3/3.4.3 中使用 |
| 高速离心机 | 赛默飞世尔科技 | Heraeus Multifuge X3R | 或能够达到13,000的同等设备 × g |
| 高速转子 | 赛默飞世尔科技 | Fiberlite F15-6 x 100y | |
| 15 ml 离心管接头 | |||
| 冷藏台式离心机 | Eppendorf | 5430 R | 或同等物 |
| 恒温混匀仪 | Eppendorf | Thermomixer C | 或同等物。 |
| 磁力架 | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | 一个支架可容纳 8 个 µMacs 柱 |
| 超精细尺度 | Mettler Toledo | ML204T | 或同等物 |
| E-Gel iBase 电源系统 | Invitrogen | G6400UK | 用于RNA凝胶；或同等用途。 |
| E-Gel EX 1% 琼脂糖预制凝胶 | Invitrogen | G4020-01 | 用于RNA凝胶；或同等用途。 |
| DynaMag-2 磁铁-1 每个 | Life Technologies | 12321D | |
| RNaseZap | Sigma | R2020 | 可选 |
| TruSeq 定向总RNA文库制备试剂盒 | Illumina | RS-122-2201 | 或等效试剂。对于T细胞，我们使用400 ng 4sU和总RNA，PCR扩增循环数为11次。该试剂盒包含rRNA去除步骤。 |
| Nanodrop | Thermo Scientific | 使用 Nanodrop 或同等仪器测定 RNA 浓度 | |
| 核糖体谱分析 | |||
| TruSeq Ribo Profile 试剂盒（哺乳动物或酵母） | Illumina | RPYSC12116（酵母） | |
| TruSeq Ribo Profile 试剂盒（哺乳动物或酵母） | Illumina | RPHMR12126（哺乳动物） | |
| Illustra MicroSpin S-400 HR 柱 | GE Healthcare | 27-5140-01 | |
| RNA 纯化 & 浓缩仪-25 试剂盒 | Zymo Research | R1017 | |
| RNA 纯化 & 浓缩仪-5 试剂盒 | Zymo Research | R1015 | |
| Ribo-Zero Gold rRNA 去除试剂盒（人/小鼠/大鼠） | Illumina | MRZG126 或 MRZG12324 | |
| （高灵敏度DNA试剂盒） | 安捷伦科技 | 5067-4626 | 4sU-seq 已需要 |
| 所有其他耗材和设备均列于用户指南中 | !!! | 仔细阅读用户指南，并提前订购所需的耗材（请注意某些耗材如凝胶的交付时间较长） | |
| 染色质免疫沉淀 | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) | 普通实验室供应商 | ||
| 100 bp Plus Marker | 赛默飞世尔科技 | SM0323 | |
| 16 % 甲醛 | 赛默飞世尔科技 | 28908 | 加入至终浓度为 1 % |
| 70% EtOH | 普通实验室供应商 | 务必新鲜配制 | |
| 琼脂糖 | 通用实验耗材供应商 | ||
| Agencourt RNAClean XP 磁珠 | Beckman Coulter | A63987 | 我们建议使用这些磁性微珠。分装后于4℃保存°C |
| ChIP文库制备试剂盒 | KapaBiosystems | KK8504 | 或使用您选择的试剂盒 |
| DNA低吸附微量离心管 | Eppendorf | Z666548-250EA | 或同等产品 |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10004D | 在步骤 4.3.1 中使用这些与蛋白 G 偶联的超顺磁性微珠；使用前恢复至室温 |
| 甘氨酸 | 普通实验室供应商 | 配制2M的储存液 | |
| 糖原 | 罗氏 | 10-901-393-001 | |
| MinElute PCR 纯化试剂盒 | Qiagen | 28004 | 在步骤 4.2.4 中使用该试剂盒（或同等产品）纯化染色质。 |
| 磷酸酶抑制剂（PhosStop） | 罗氏 | 4906837001 | 将新鲜的加入缓冲液中，并置于冰上保存 |
| Power SYBRgreen Master mix | 赛默飞世尔科技 | 4367659 | |
| 蛋白酶抑制剂（cOmplete，无EDTA） | 罗氏 | 11873580001 | 将新鲜的缓冲液加入并置于冰上保存 |
| 蛋白酶K | Invitrogen | 25530049 | |
| Qubit dsDNA HS Assay 试剂盒 | Invitrogen | Q32851 | 在步骤 4.6.4 中使用该试剂盒在 Qubit 荧光计上定量 DNA 数量 |
| Rnase，无DNase | 罗氏 | 11-119915001 | |
| 鲑鱼精子（超声处理至约100 bp） | Sigma | D1626 | |
| TE pH 8.0 | 通用实验室供应商 | ||
| 抗体（尽可能使用 ChIP 级别） | |||
| 抗RNA聚合酶II [8WG16] | abcam | ab817 | |
| 抗组蛋白 H3K36me3 | abcam | ab9050 | |
| 或目标抗体 | |||
| 缓冲液 | |||
| 结合/封闭缓冲液 | 室温保存 | 含 0.5% BSA 和 0.5% Tween 20 的 PBS | |
| 细胞裂解缓冲液 | 室温保存 | 5 mM Pipes [pH 8.0]、85 mM KCl 和 0.5% NP40 | |
| ChIP IP 缓冲液 | 室温保存 | 0.01% SDS；1.1% Triton X-100；1.2 毫摩尔 EDTA；16.7 mM Tris-HCl，pH 8.1；16.7 mM NaCl | |
| 洗脱缓冲液 | 室温保存，最长6个月 | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)，5 mM EDTA (pH 8.0)，300 mM NaCl 和 0.5 % SDS | |
| 细胞核裂解缓冲液 | 室温保存 | 50 mM Tris [pH 8.0]，10 mM EDTA 和 1% SDS | |
| 洗涤缓冲液 I | 室温保存 | 0.1 % SDS；1 % Triton X-100；2 mM EDTA；20 mM Tris-HCl pH 8.1；150 mM NaCl | |
| 洗涤缓冲液 II | 室温保存 | 0.1 % SDS；1 % Triton X-100；2 毫摩尔/升 EDTA；20 mM Tris-HCl pH 8.1；500 mM NaCl | |
| 洗涤缓冲液 III | 室温保存 | 0.25 M LiCl；1% NP-40；1 毫摩尔 EDTA；10 mM Tris-HCl，pH 8.1 | |
| 设备 | |||
| 2100 Bioanalyzer 仪器 | 安捷伦 | G2939BA | 使用该仪器进行电泳分析 |
| Nanodrop | 赛默飞世尔科技 | ||
| Bioruptor TBX 微管 1.5 ml | Diagenode | C30010010 | |
| 或适用于您超声破碎仪的专用管 | |||
| Bioruptor 超声破碎仪或任意选择的超声破碎仪 | 使用Bioruptor对T细胞进行超声处理：20 - 25个循环（高功率下30秒开启，30秒关闭），分装于两支1.5 ml Bioruptor微管中，每管500 µ每管 | ||
| 用于离心管的磁力架 | |||
| 恒温混匀仪 | |||
| 琼脂糖凝胶电泳 | |||
| Qubit 荧光仪 | 赛默飞世尔科技 | 使用此荧光计对微量 RNA/DNA 进行定量 |
参考文献
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