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由人诱导多能干细胞生成标准化且可重复的前脑类脑器官

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DOI：

10.3791/56768

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2018年1月23日

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Reconstructive Neurobiology, University of Bonn, 2Central Institute of Mental Health, University of Heidelberg/Medical Faculty Mannheim, 3Hector Institute for Translational Brain Research (HITBR gGmbH)

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

类脑器官代表了一种新的体外模型系统，可用于研究人类早期大脑发育。in vitro。本文提供了从人类诱导多能干细胞高效生成均质背侧前脑型类脑器官的详细方法，包括关键的表征与验证步骤。

摘要

人类大脑皮层高度扩展，具有复杂的结构和特定的功能区域，从而实现认知等高级脑功能。由于缺乏合适的模型系统，人类大脑皮层发育的研究受到限制。啮齿类动物研究结果向人类系统的转化受到物种差异的制约，而对人类原代组织的研究则因组织来源有限以及伦理问题而受阻。近年来人类多能干细胞（PSC）技术的发展包括建立了三维（3D）自组织的类器官培养系统，可在一定程度上模拟人类特有的脑发育过程in vitro。目前已有多种方案可用于生成全脑或特定脑区的类器官。本文所述方法为我们先前建立的、从诱导性多能干细胞（iPSC）生成均一且可重复的前脑型类器官的技术，该方法结合了PSC自组织的内在能力、向头端神经外胚层谱系的定向分化以及基质包埋以支持连续性神经上皮的形成。具体而言，该方案包括：（1）生成iPSC细胞聚集体，包括将iPSC克隆转化为融合的单层培养；（2）诱导形成头端神经外胚层；（3）将神经外胚层聚集体包埋于基质支架中；（4）从前脑神经外胚层聚集体生成前脑型类器官；以及（5）前脑型类器官的固定与验证。因此，该方案为in vitro生成标准化且可重复的iPSC来源皮层组织结构提供了一个易于应用的系统。

引言

人脑显然是最复杂的器官之一，负责所有人类的智力能力。因此，深入理解人类特有的大脑发育过程，是认识人类认知能力的关键前提。传统上，转基因动物被用作研究大脑发育的模式生物。这些模型为揭示大脑发育的基本原理提供了重要见解。目前我们已知，所有哺乳动物大脑发育的一个共同特征是前体细胞增殖、神经发生和神经元迁移的精确协调过程。然而，模式生物（如啮齿类动物）与人类的大脑之间存在显著的结构差异，尤其是在新皮层方面。目前提出的主要机制表明，灵长类动物皮层进化涉及干细胞和前体细胞增殖能力的增强，以及外侧放射状胶质细胞（oRGCs）的产生；而这类细胞在啮齿类动物中极为罕见1,2,3。

模拟人类大脑皮层发育的方法包括将多能干细胞（PSC）来源的端脑前体细胞及大脑皮层投射神经元以单层培养形式进行培养。这些标准化的分化方案可重现人类皮层发育的某些特征，例如皮层神经发生过程中典型的时间顺序4然而，这些方法在模拟器官发生过程中的发育事件（如空间模式形成和形态发生）方面仍存在不足。干细胞生物学领域的最新进展推动了源自多能干细胞（PSCs）的三维类器官培养技术的建立，该技术正在彻底改变相关研究领域 体外 人类器官发生。利用多能干细胞（PSCs）自我组装形成类器官结构的能力，已成功建立多种类器官，这些类器官反映了包括肾脏、肠道、眼睛和大脑在内的多种器官的关键结构和功能特性5此类类器官包含多种器官特异性的细胞亚型，这些细胞亚型聚集在一起，并在空间上以类似于发育中器官的方式进行组织排列。 体内5,6此外，利用单细胞RNA测序对细胞组成、谱系关系和基因调控网络的研究表明，人类脑类器官能够忠实地重现人类胎儿新皮层发育的主要特征，例如基因表达程序7,8然而，一个主要的缺点限制了它们的广泛应用，即批次间差异较大以及类器官之间的异质性9.

在此，我们提供了一种简单且标准化的前脑类器官培养体系的详细实验方案。该体系的关键特征在于能够高效且可重复地生成几乎完全具有背侧端脑身份的多能干细胞来源类器官。本方案基于我们近期研究中所采用的方法 细胞报告 纸10结合了iPSCs的自我组织能力与皮质神经上皮的选择性诱导，可在3周内稳定地生成均一的早期背侧端脑组织培养物. 该方案基于先前报道的SMAD信号通路和Wnt抑制策略，可引导多能干细胞向头端神经外胚层谱系分化11,12 结合基质包埋，可促进大而连续的神经上皮结构的形成13我们已成功将所述方法应用于多种iPSC细胞系，每个个体包含多个克隆。结果表明，该体系适用于对可重复性和均一性要求较高的下游应用，例如疾病建模。当将该方案应用于来自患有严重皮质畸形患者来源的iPSC时，我们能够重现该疾病的病理特征。 体外 并确定导致表型变化的新的分子机制10我们建议，所述类器官方案可用于弥合还原论的PSC来源皮质单层培养与 体内 研究，且代表了一种可靠且稳定的基于细胞的模型系统，可用于在体外模拟健康与疾病状态下的人类早期大脑皮层发育。

方案

1. 诱导多能干细胞聚集体的生成

  1. 从iPSC细胞集落中生成单细胞单层培养物
    1. 制备包被有基底膜提取物（BME）的6孔板。将BME在 在4 °C下冰浴2-3小时，用预冷的DMEM/F12培养基（DMEM-F12；1:50稀释）稀释，每孔加入1 mL稀释后的BME溶液覆盖培养板，4 °C孵育过夜。
    2. 吸弃培养基，用含0.5 mM EDTA的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤至少2个6孔板孔中的完整iPSC集落，洗涤两次，随后在室温（RT）下用含0.5 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的PBS孵育4分钟。吸弃EDTA溶液，用5 mL DMEM-F12培养基轻轻冲洗培养皿底部，使集落脱落。将脱落的集落收集至15 mL离心管中，通过离心（1,200 × g，4分钟）形成细胞沉淀。 g 室温下（at RT）。
      注意： 由商业来源的成纤维细胞重编程获得的iPSCs已成功应用10.
    3. 吸弃上清液，加入500 µL细胞解离试剂，将iPSC集落于37 °C孵育6分钟。
    4. 用1 mL移液器轻轻反复吹打细胞悬液数次，以将残留的细胞团块分散成单个细胞。
    5. 向细胞悬液中加入 4 mL DMEM-F12，以稀释细胞解离试剂。
    6. 以 1,200 x 转速离心细胞 g 室温下持续 4 分钟。
    7. 将细胞重悬于2 mL添加了5 µM Y-27632的iPSC培养基中，并接种至一孔BME包被的6孔板中。
      注意： 使用指定的iPSC培养基 材料表 用于单细胞单层iPSC培养。
    8. 第二天，将培养基更换为不含 Y-27632 的新鲜 iPSC 培养基。自此开始，每天更换培养基，持续培养细胞，直至 iPSC 达到 100% 汇合度。根据细胞系及起始孔的汇合程度，此过程通常需要 2 至 4 天。
    9. 待细胞融合后，传代iPSCs。吸除培养基，向细胞中加入500 µL细胞解离试剂。
    10. 在37 °C下孵育细胞5-10分钟。轻轻摇动培养板以使细胞脱落。
    11. 用 2 mL DMEM-F12 洗涤细胞孔中的细胞，并收集至 15 mL 离心管中。再加入 DMEM-F12，使总体积达到 5 mL。
    12. 以 1,200 x g 离心细胞 g 室温孵育4分钟，吸除上清液。
    13. 以1:2至1:4的比例将细胞接种于添加了5 µM Y-27632的iPSC培养基中，置于基质胶（BME）包被的6孔板（每孔2 mL培养基）上。
    14. 继续培养细胞 2-5 天，每天更换不含 Y-27632 的 iPSC 培养基。待细胞融合后，传代 iPSC（步骤 1.1.4–1.1.8）。
      注意： 将iPSCs在指定的iPSC培养基中以单层形式培养至少传代2次 材料表 在用于生成iPSC细胞团之前，先让细胞适应培养条件。
  2. 当单层iPSC培养物达到70-90%融合度时，用于生成iPSC聚集体。
    注意： 以单细胞形式适应培养条件的iPSC在解离和聚集体形成过程中不易受到导致细胞死亡的应激影响。单层iPSC培养物应呈现典型的多能性形态，无明显分化迹象。需定期检测培养物是否存在支原体污染。仅使用无支原体污染的iPSC培养物。
    1. 从6孔板的一个孔中吸出培养基，并向细胞中加入500 µL细胞解离试剂。
    2. 在37 °C下孵育细胞5-10分钟。轻轻摇动培养板以使细胞脱落。
    3. 用 2 mL DMEM-F12 洗涤孔中的细胞，并收集至 15 mL 离心管中。加入 DMEM-F12 至终体积为 10 mL。
    4. 细胞计数时，取25 µL细胞悬液与25 µL台盼蓝混合，以标记死细胞。使用计数板对活细胞进行计数。
    5. 从细胞悬液中收集足够数量的细胞（每个iPSC聚集体4,500个细胞）至15 mL离心管中。
    6. 以 1,200 x g 离心细胞 g 室温孵育4分钟，吸除上清液。
    7. 用适量添加了50 µM Y-27632的iPSC培养基重悬细胞，以获得每150 µL含4,500个活细胞的悬液。
      注意： 使用高浓度的Y-27632（50 µM）对iPSCs的存活至关重要。
    8. 在低吸附性96孔圆底板的每孔中加入150 µL，并置于37 °C、5% CO₂的培养箱中培养2.
      注意： 在生成iPSC聚集体时，需考虑在第20天至少需要6个类器官用于质量控制（见第5节）。

2. 诱导前部神经外胚层

  1. 每天在组织培养显微镜下使用 4X 或 10X 物镜密切观察 iPSC 细胞团的形态变化。在第 1 天观察时，细胞团应具有清晰的边界。继续将 iPSC 细胞团在 37 °C 和 5% CO2 的培养箱中进行培养。
    注意： 每孔中存在一定数量的死亡细胞属于正常现象，不会影响类器官的生成。
  2. 从第 2 天开始，每隔一天更换一次培养基：轻轻吸出约 2/3 的培养基，注意不要扰动底部的细胞团。随后加入额外的 100 µL 不含 Y-27632 的 iPSC 培养基。
    注意： 在 4–6 天内，细胞团直径将达到 350–450 µm，并呈现光滑的边缘。
  3. 在此阶段，使用剪去尖端的 100 µL 移液枪头将细胞团转移至低吸附性 6 cm 培养皿中（每皿最多 20 个细胞团），并置于皮层诱导培养基中。该培养基包含 DMEM-F12、N2 补充剂（1:200）、B27 补充剂（1:100）、葡萄糖（0.2 mg/mL）、环磷酸腺苷（cAMP；0.15 µg/mL）、0.5% 非必需氨基酸（NEAA）、1% L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、肝素（10 µg/mL），以及化合物 LDN-193189（180 nM）、A83-01（500 nM）和 Wnt 反应抑制剂-1（IWR-1）（10 µg/mL）。在细胞团转移至 6 cm 培养皿后的第 3 天更换皮层诱导培养基。
  4. 在皮层诱导过程中，使用 4X 物镜在组织培养显微镜下密切监测细胞团的形态变化。
    注意： 在皮层诱导培养基中培养 4–5 天后，细胞团边缘表面应开始变亮，表明已启动神经外胚层分化。此时，可观察到假复层上皮的放射状结构形成。接下来进入第 3 节 ，将细胞团包埋于 BME 基质中。

3. 神经外胚层聚集体在基质支架中的包埋

  1. 解冻 BME 在 4 °C 冰浴中放置 2–3 小时。分装未稀释的 BME，用量需充足。
  2. 准备用于包埋的塑料石蜡膜片。使用无菌剪刀将塑料石蜡膜裁剪成 4 cm × 4 cm 的小片，取一片覆盖在空的 100 µL 吸头盒（用于 100 µL 吸头）上，用戴着手套的手指轻压，使塑料石蜡膜片形成小凹陷（每个细胞聚集体需要 1 个凹陷）。用 70% 乙醇清洁塑料石蜡膜，并在密闭的无菌操作台内以紫外线照射 30 分钟（功率：15 瓦，波长：435 nm）。
  3. 使用直径为1.5–2 mm的100 µL截头吸头，将每个细胞团块转移至塑料石蜡膜片的一个凹槽中。若两个细胞团块发生融合，则无需分离，应将其一同转移至同一凹槽内。
  4. 使用未剪切的100 µL枪头轻轻吸除细胞聚集体周围的培养基。
    注意： 注意不要将细胞团吸入枪头，以免损伤细胞团。
  5. 向每个细胞聚集体中加入 40 µL 未稀释的 BME。
  6. 使用未切割的100 µL枪头将每个细胞聚集体置于BME液滴中央。
    注意： 务必小心，避免移液器吸头损伤正在发育的神经上皮。
  7. 使用无菌镊子将塑料石蜡膜片小心转移至10 cm培养皿（或其他合适的细胞培养皿）中，将培养皿放入培养箱孵育15–20分钟，使BME凝固。
  8. 同时，准备一个含有5 mL皮质诱导培养基的低吸附6 cm培养皿。
  9. BME 聚合后，从塑料石蜡膜片上取下含有细胞聚集体的液滴。用无菌镊子将塑料石蜡膜翻转，轻轻挤压细胞聚集体，使其落入已略微倾斜（约 30°）的低吸附 6 cm 培养皿中，直至液滴完全脱离塑料石蜡膜片。每个 6 cm 培养皿中最多转移 16 个细胞聚集体。
  10. 继续在37 °C下孵育细胞聚集体。

4. 由神经外胚层聚集体生成前脑型类器官

  1. 在基质胶（BME）基质中包埋后一天，将类器官培养皿置于细胞培养摇床的摇床上，设置倾斜角度为5°、转速为14 rpm，并将摇床放置于细胞培养箱中。
  2. 每天观察类器官。包埋于BME基质后，均一的神经上皮环状结构将逐渐形成。
  3. 当可见神经上皮环状结构时，更换为类器官分化培养基，该培养基包含DMEM-F12、N2添加剂（1:200）、B27添加剂（1:100）、葡萄糖（0.2 mg/mL）、cAMP（0.15 µg/mL）、0.5% NEAA、1% L-丙氨酰-L-谷氨酰胺和胰岛素（2.5 µg/mL）。
  4. 每3–4天更换一次类器官分化培养基，直至达到所需的分化时间点，随后固定类器官（见第5节）。
    注意：偶尔组织可能形成光学透明的芽状结构而无环状结构。尽管此情况并非理想状态，但并不影响皮层结构的发育。类器官可在类器官分化培养基中培养长达40天。对于延长培养期（40–100天），可在类器官分化培养基中添加1:50的BME以增加组织复杂性，并加入BDNF和GDNF以促进神经元的存活与成熟14,15。

5. 前脑类器官的固定与验证

  1. 用于验证时，在第20天收集6个类器官。取其中3个类器官用于mRNA提取和PCR分析。使用开口为3–3.5 mm的截断1 mL移液枪头，将另外3个类器官转移至含有PBS的24孔板中，用于固定及后续的免疫细胞化学分析。
  2. 用5 mL移液管小心吸去PBS并更换新鲜PBS，清洗类器官两次。在4%冷多聚甲醛（PFA，pH 7.4）中固定类器官15分钟。
    注意： PFA为已知的人类致癌物，所有操作必须在化学通风橱中进行，并佩戴腈手套。建议佩戴护目镜。甲醛可导致角膜不可逆损伤。
  3. 小心吸去PFA，用室温PBS洗涤三次，每次10分钟。
  4. 将PBS替换为30%蔗糖溶液（质量/体积，以PBS配制），并将样本置于4 °C保存，使类器官充分脱水。样本可在进一步处理前于4 °C保存最多7天。
  5. 固定后一天，通过加入台盼蓝（终浓度约1:50）对脱水类器官进行预染色，染色10分钟，以便在冷冻切片过程中可视化类器官。
  6. 配制包埋介质：含10%蔗糖、7.5%明胶（质量/体积，以PBS配制），加热至75 °C直至完全溶解成液态。
  7. 将30%蔗糖溶液替换为包埋介质，并将24孔板置于60 °C加热板上孵育15分钟，使类器官充分平衡。
  8. 在包埋模具底部覆盖一层包埋介质，并将其置于冰上使其聚合固化。
  9. 将类器官从24孔板转移至含有已固化包埋介质的模具中，顶部再加入适量包埋介质完全覆盖类器官，迅速将模具放入 100%乙醇/干冰冷冻浴中（温度应介于-30至-50 °C），冷冻至少1分钟以实现速冻。
  10. 用镊子将模具暂时放置于干冰上，可选择在-80 °C长期保存，或直接进行冷冻切片。
  11. 将类器官以20 µm厚度进行冷冻切片，将切片按顺序收集于载玻片上，并记录各切片在载玻片上的排列顺序（连续切片收集）。切片在载玻片上干燥数小时后，可储存于-80 °C，或直接进行免疫细胞化学染色。

结果

本文所述标准化的前脑类器官方案通常可在人源iPSC培养20天内，高效生成几乎完全为背侧皮层身份的高度均一的类器官培养物（方案概要见图1A）。建议在方案实施过程中设置多个质量控制节点，以判断是否继续实验，定义如下：“通过”（继续分化过程）和“不通过”（培养状态次优，建议终止该批次实验）（图1）。同时建议通过拍照和记录详细文档，对每个质量控制步骤进行充分记录。

生成前脑类器官的第一个关键步骤是使用高质量的iPSC细胞系进行起始培养。必须确保iPSC中不含较大量已分化的细胞。仅使用在起始种群中呈现为均一未分化细胞单层的iPSC培养物（图1B、C）。此外，必须严格按照规定的细胞数量进行iPSC聚集体的起始操作。首次对iPSC聚集体的详细检查应在第2天进行。此时，聚集体应已形成边缘光滑、结构致密的细胞芽（“通过”），而形态不规则或内部出现空腔的聚集体应予以弃用（“不通过”）（图1D、E）。下一个质量控制步骤应在方案的第10天进行。此时，细胞聚集体的外表面应呈现出光滑且光学透明的组织，表明神经外胚层已成功诱导（“通过”）；若缺乏此类组织，则提示神经诱导效果不理想（“不通过”）（图1F、G）。仅应将具有透明表面的聚集体（图1F）包埋至BME基质中。一旦包埋，皮质类器官将发育出连续的、环状神经上皮结构，并迅速扩张。在第15天和第20天通过检测类器官是否已形成极化神经外胚层来评估皮质诱导效率，如图1H、J所示（“通过”）。若类器官未形成此类神经上皮芽结构（如图1I、K所示的“不通过”情况），则需仔细回顾此前执行的质量控制步骤，以排查问题。若严格遵循本方案，可获得高度标准化的类器官批次（图2A、B），其在批次内及批次间极化神经外胚层形成的均一性可达≥90%（图2C）。导致极化神经外胚层形成效率不稳定的一个常见错误是增加iPSC聚集体的起始细胞数量，或使用低质量的iPSC培养物（如支原体污染的培养物或含有分化细胞的培养物）作为起始材料。

应在第20天对所生成类器官的端脑背侧身份进行详细验证。为此，应固定3个类器官并用于免疫荧光分析。分层的神经上皮环（图3A）表达神经干细胞标志物Sox2（图3B, D）、前脑标志物Pax6和Otx2（图3C, E）以及背侧皮层标志物Emx1（图3F）。这些皮层环的特征还包括N-钙黏蛋白和ZO-1在顶端的定位（图3G, H）、源自脑室区放射状胶质细胞（vRGC）的微管结构，该结构从结构的顶端延伸至基底端（图3I），以及位于顶端正在进行分裂的细胞，这些细胞对磷酸化波形蛋白（p-Vimentin，图3J）呈阳性染色。类器官结构内部可能出现细胞死亡现象。中心区域的凋亡属于正常现象，不会影响皮层组织的发育。此外，应使用另外3个类器官通过基因表达分析来评估该方案的一致性。前脑型类器官表达背侧前脑标志物（FoxG1、Otx2、Emx1），而中脑（FoxA2、Pax5）和后脑（HoxB2、HoxA4、HoxB4、HoxB6）标志物的表达则无法检测到（图3K）。

经过质量控制的类器官批次可用于多种应用，例如分析顶端放射状胶质细胞的分裂平面。为此，我们建议使用针对p-Vimentin和Tpx2的抗体进行双重染色（图3J）。p-Vimentin在有丝分裂期间被CDK1磷酸化，并定位于细胞核内，因此可标记所有处于有丝分裂阶段的细胞核16。Tpx2是一种微管相关蛋白，能够显示有丝分裂纺锤体以及在核间期迁移过程中的顶端突起17,18。利用这些标记物，原则上可分析vRGC分裂的三个方面：（I）细胞分裂是否发生在顶端侧；（II）分裂平面是垂直于顶端表面（提示对称分裂）、水平还是倾斜（提示不对称分裂）；（III）微管组织中心是否正常形成。

类器官还可进一步分化为更复杂、具有组织层次和分层结构的皮质组织。在第35 ± 2天的类器官中，皮质结构包含一个室管膜区（VZ）、内侧和外侧室下区（SVZ），以及类似皮质板（CP）的区域。在VZ以及内侧和外侧SVZ中，可识别出 ventricular radial glial cells（vRGCs）、中间前体细胞（IPs）以及类似于 outer radial glial cells（oRGCs）的细胞。此外，在类似皮质板的区域中可观察到初步形成的分层皮质结构：深层皮质神经元表达Tbr1和Ctip2，位于内部；上层皮质神经元表达Satb2，而Reelin表达细胞则位于外侧区域10。

iPSC 细胞团分化；神经诱导至皮质类器官发育阶段示意图。
图 1：类器官培养方案的示意图及“可继续”与“不可继续”标准的图示。（A）方案的示意图。CI 培养基：皮质诱导培养基；CD 培养基：皮质分化培养基。（B–C）理想的90%汇合度的iPSC单层培养图像（B），以及出现分化现象因而不适宜使用的iPSC培养物（C）。（D–E）细胞聚集体在大小、细胞密度和表面形态上均理想的示例（D），以及两个“不可继续”的细胞聚集体示例：一个存在细胞稀疏和空腔（E，上部聚集体），另一个边缘不规则（E，下部聚集体），均为细胞聚集后两天的图像。（F–G）边缘透明且光滑的细胞聚集体（F），以及缺乏光学透明化的细胞聚集体（G）。黄色线框标示关注区域。（H–K）在第15天和第20天分别成像的、具有连续神经上皮样结构的优质类器官（H、J），以及未能形成径向有序神经外胚层结构的失败类器官（I、K）。比例尺：B–C 为 500 µm；D–K 为 200 µm。请点击此处查看该图的高清版本。

类器官发育，光学图像 A-B，图表 C，比较iPSC神经上皮形成。
图 2：前脑型类器官培养方案的均一性与可重复性。（A-B）同一批次类器官在第15天（A）和第26天（B）的代表性明场图像。（C）第20天类器官的定量分析。统计显示在类器官外表面形成神经上皮的类器官数量，该结构在明场下表现为光学透明的表层组织，边界清晰，并可见放射状细胞结构（每种iPSC系n = 3，每次实验至少16个类器官）。比例尺，A-B：500 µm。误差棒表示±标准差（SD）。请点击此处查看该图的放大版本。

神经类器官发育示意图；Sox2、Pax6 标记物；DAPI 染色；前脑、中脑分析。
图 3：第 20 天前脑型类器官的验证。 （A-J）类器官的免疫细胞化学表征。类器官形成多个神经上皮环结构（A，DAPI 复染）。神经上皮环内分层排列的细胞表达神经干细胞标志物 Sox2（B, D）、前脑标志物 Pax6（C, D）和 Otx2（E），以及背侧前脑标志物 Emx1（F）。皮层环状结构在最顶端侧呈现清晰的黏附连接带，伴有 N-钙黏蛋白（G）和闭合小环蛋白 1（ZO-1；H）的聚集。室管膜放射状胶质细胞（RGCs）的微管网络（经乙酰化 α-微管蛋白，Ac-Tub 染色）从环结构的顶端延伸至基底端（I）。表达磷酸化波形蛋白（p-Vim）的增殖细胞位于顶端表面，有丝分裂纺锤体由 Tpx2 标记。右侧显示了垂直分裂面和水平分裂面的代表性高倍放大图像（J）。（K）在两个独立实验中，来自两条不同 iPSC 系的类器官在第 20 天时区域特异性转录因子的 RT-PCR 分析。FB：胎儿脑对照；AB：成人脑对照。比例尺：A-D 为 200 µm；E-I 为 10 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

表位稀释倍数
Sox21 - 300
Pax61 - 500
Otx21 - 500
Emx11 - 50
N-cadherin1 - 500
ZO-11 - 100
P-Vimentin1 - 1000
Tpx21 - 500
乙酰化 α-微管蛋白1 - 500
Alexa488 anti ms1 - 1000
Alexa488 anti rb1 - 1000
Alexa555 anti ms1 - 1000
Alexa555 anti rb1 - 1000

表1：第20天类器官质量控制所用抗体。

引物序列
Otx2 正向tgcaggggttcttctgtgat 
Otx2 反向agggtcagagcaattgacca 
FoxG1 正向ccctcccatttctgtacgttt 
FoxG1 反向ctggcggctcttagagat 
Emx1 正向agacgcaggtgaaggtgtgg 
Emx1 反向caggcaggcaggctctcc 
FoxA2 正向ccaccaccaaccccacaaaatg 
FoxA2 反向tgcaacaccgtctccccaaagt 
Pax5 正向aggatgccgctgatggagtac 
Pax5 反向tggaggagtgaatcagcttgg 
HoxB2 正向tttagccgttcgcttagagg 
HoxB2 反向cggatagctggagacaggag 
HoxA4 正向ttcagcaaaatgccctctct 
HoxA4 反向taggccagctccacagttct 
HoxB4 正向acacccgctaacaaatgagg 
HoxB4 反向gcacgaaagatgagggagag 
HoxB6 正向gaactgaggagcggactcac 
HoxB6 反向ctgggatcagggagtcttca 
18s 正向ttccttggaccggcgcaag 
18s 反向 gccgcatcgccggtcgg

表2：基因表达谱的引物及引物序列。

讨论

脑类器官是研究人类大脑发育的有力工具 体外 因为它们提供了相关的物种背景以及组织环境中细胞复杂的三维排列。由此，它们填补了非人类动物模型与简化的人体二维单层细胞培养技术之间的空白。然而，其应用受到可重复性不足的限制9我们开发了一种前脑类器官培养方案，该方案通过结合诱导多能干细胞（iPSC）的自我组织能力及其对模式化因子的响应性，克服了样本间差异较大的问题。具体而言，将iPSC聚集成团以促进其自我组织，并随后抑制TGF-ß/SMAD信号通路，通过添加BMP抑制剂（LDN-193189）和TGF-β I型受体抑制剂（A83-01）诱导背侧皮层分化。此外，还应用了Wnt通路抑制剂（IWR）以防止后部化。与“内在”型脑类器官培养方案相比19，这些基于自组装且无外部控制的过程导致生成的脑类器官具有较高的异质性，并表现出显著的批次间差异（通过极化神经外胚层形成的效率来衡量）15），本文所述方案可从人iPSCs稳定地生成均一的前脑特异性类器官。

这些前脑型类器官可应用于多种研究领域，例如神经发育研究、包括基因功能研究在内的进化研究、疾病建模，以及潜在的药物筛选和治疗用途。然而，该方案最适合用于研究人类皮层发育的早期阶段。例如，我们曾利用前脑型类器官研究vRGC行为中的人类特异性特征。更具体而言，我们探讨了与一种严重形式的无脑回畸形（lissencephaly）相关的病理生理变化，该疾病是一种以皮层折叠几乎完全缺失为特征的人类皮层发育畸形。由于小鼠大脑天然为无脑回结构，因此仅能部分模拟该疾病。当将类器官系统应用于无脑回畸形患者来源的诱导多能干细胞（iPSCs）时，我们能够可靠地重现该疾病的人类特异性特征，并鉴定其潜在机制。具体而言，我们发现患者来源的类器官表现出显著的体积减小，这是由于vRGCs的细胞分裂方式由对称分裂转变为不对称分裂所致。这一转变与vRGCs微管网络结构的改变、生发区（VZ）微环境结构的破坏以及细胞黏附分子表达的异常相关，最终导致N-钙黏蛋白/β-连环蛋白（N-cadherin/β-catenin）信号通路的激活受损10值得注意的是：β-catenin 对 vRGC 分裂模式的依赖性调控被认为是人类特有的，因为在小鼠中过表达 β-catenin 会导致皮层切向扩张，进而引发皮层折叠20因此，我们的数据强调，前脑类器官系统是一种有前景的工具，可用于以可量化的方式研究人类早期皮层发育的特有特征。 体外.

未来面临的一个主要挑战是，在延长的培养时间内维持类器官的均一性，以获得更为成熟的神经元表型。这一目标可能通过以下一种或多种方式实现：将类器官培养于生物反应器系统中14，使用悬浮支架15，或在分化培养基中添加神经生长因子及神经元存活因子。最后，通过将前脑型类器官与具有不同区域特征的脑类器官融合，可能实现大脑复杂性的可控增加21,22。

综上所述，本文介绍的前脑类器官培养方案为体外生成早期皮层结构提供了一种易于应用且可靠的工具。in vitro 条件下可形成高度均一的早期皮层组织，且该方案适用于多种诱导多能干细胞系，能够稳定地生成个体特异性的皮层组织。因此，该体系特别适用于疾病建模等需要高度均一性和可重复性的研究应用。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由北莱茵-威斯特法伦州创新科学与研究部（青年研究组）以及ERA-NET NEURON、JTC 2015神经发育障碍项目STEM-MCD资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
A83-01StemGent130-106-274500 nM
B27添加剂Gibco17504-0441比100
基底膜提取物（例如Geltrex）GibcoA14132-02
环磷酸腺苷（cAMP）Sigma-AldrichA95010.15 µg/mL
细胞解离试剂（TrypLE Express）Gibco12605028
计数室（例如Fuchs-Rosenthal）Karl Hecht40449001
D-葡萄糖Carl RothHN06.30.2 mg/mL
DMEM-F12 L-谷氨酰胺Gibco11320033
包埋模具（Tissue-Tek Cryomold）Sakura Finetek4565
乙二胺四乙酸Sigma-AldrichE65110.5 mM 
明胶Sigma-AldrichG1890
肝素Sigma-AldrichH3149-25KU10 ug/mL
WNT信号通路抑制剂（IWR-1）Enzo Life ScienceBML-WN103-000510 ug/mL
胰岛素Sigma-Aldrich91077C2.5 µg/mL
单层培养用iPSC培养基（Pluripro）Cell Guidance SystemsMK01
L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（GlutaMax）Gibco350500381%
低吸附6 cm培养皿Labomedic2081646L
低吸附10 cm培养皿Labomedic2081646O
LDN-193189Miltenyi Biotec130-104-171180 nM
N2添加剂Gibco17502-0481比200
非必需氨基酸Gibco111400350.50%
多聚甲醛Sigma-AldrichP61484.00%
磷酸盐缓冲液（PBS）Gibco14190144
塑料石蜡膜（Parafilm）BRAND GMBH + CO KG701606
ROCK抑制剂Y-27632Cell Guidance SystemsSM02-1005 µM 或 50 µM
蔗糖Sigma-AldrichS7903
15 mL离心管Corning Life Sciences734-0451 
显微镜载玻片（例如Superfrost Plus显微镜载玻片）Thermo Scientific4951PLUS4
组织培养6孔板Falcon734-0019
组织培养24孔板Falcon734-0949
台盼蓝染液Gibco15250-061
超低吸附96孔脂质涂层板A-U96AmsbioAMS.51011610
抗体
Sox2R&D SystemsMAB2018
Pax6CovancePRB-278P-100
Otx2R&D Systemsab9566
Emx1SigmaHPA006421
N-钙黏蛋白BD610921
ZO-1Life Tech61-7300
磷酸化波形蛋白BiozolD076-3
Tpx2Novus BiologicalsNB500-179
乙酰化α-微管蛋白 NEB/CS5335
Alexa488抗小鼠InvitrogenA11001
Alexa488抗兔InvitrogenA11008
Alexa555抗小鼠InvitrogenA21424
Alexa555抗兔InvitrogenA21429

参考文献

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前脑类器官人诱导多能干细胞皮层分化神经外胚层诱导基质包埋类器官标准化Sox2表达Pax6 Otx2Emx1标志物冷冻切片分析
由人诱导多能干细胞生成标准化且可重复的前脑类脑器官
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