一种用于测量肌营养不良小鼠模型行走能力的简单且低成本检测方法

摘要

本方案描述了一种灵活且低成本的小鼠在开放场活动实验中测量行走能力的系统。我们证明，基于该系统的6分钟行走实验能够检测到mdx小鼠自主运动的减少，并能准确区分这些动物在肌肉特异性挽救后的功能改善。

摘要

在进行肌营养不良症治疗的临床前测试时，测量功能学结局指标是一项至关重要的环节。对小鼠模型自主行走能力的评估是一种非侵入性且可重复的行为检测方法，其原理直接类比于临床患者行走功能的评估手段，例如6分钟步行试验及相关活动能力评分。目前许多检测小鼠行走速度和移动距离的常用方法均基于开放旷场实验，即在一段时间内记录动物在特定区域内的自由活动情况。该方法的一个主要缺点是，高分辨率运动追踪所需的商用软件和设备价格昂贵，且可能需要将小鼠转运至专门设施进行测试。本文介绍了一种基于视频记录的低成本小鼠行走检测系统，该系统采用免费且开源的软件实现。通过本实验方案，我们证明了杜氏肌营养不良症（DMD）的dystrophin缺失型mdx小鼠模型的自主行走能力较野生型小鼠显著降低。而在表达utrophin转基因的mdx小鼠中，这种活动能力的缺陷未被观察到，其总移动距离与野生型小鼠无显著差异。该方法能够有效检测与肌营养不良病理相关的自主行走能力变化，且提供了一个灵活多样的实验平台，可便捷地适应于各类研究环境。

引言

对肌肉功能进行可靠且可重复的测量，对于评估杜氏肌营养不良症（DMD）潜在疗法的有效性至关重要。DMD 是一种由抗肌萎缩蛋白基因（dystrophin gene）突变引起的遗传性疾病，会导致进行性肌肉无力、丧失行走能力，并最终引发心肺衰竭。目前最广泛使用的 DMD 动物模型是抗肌萎缩蛋白缺失的 mdx 小鼠。一系列功能检测方法已逐渐成为常规检测手段，用于评估 mdx 小鼠以及其它肌营养不良和肌病类似动物模型的疾病进展。常用的 体内 检测方法包括前肢握力测定、悬线停留时间、转棒仪最大转速、跑步机运动至力竭的时间以及运动活动轨迹追踪。该领域已投入大量努力以标准化这些检测方法，旨在减少不同临床前研究之间的变异性，并提高在小鼠中测试的治疗手段的转化潜力^1,2。

临床前测试的一个重要类别是自主运动能力的测量，这一参数在小鼠肌营养不良模型中经常发生变化。该测试通常基于开放场活动监测实验，可在数分钟至数小时内评估水平方向（行走）或垂直方向（直立）的运动^2,3,4。多项研究显示，mdx 小鼠的自主运动能力存在异常，尤其是在运动后，且这些测量指标对药物治疗和疾病进展具有敏感性。实施此类实验的一个主要限制是需要使用专用且昂贵的设备。本文介绍了一种低成本方法，利用 readily available resources 实现对小鼠行走活动的追踪。

6分钟步行距离是杜氏肌营养不良症患者临床评估中常用的一项指标^5,6。该指标经过改良后也被用于评估杜氏肌营养不良动物模型的干预效果，包括mdx小鼠⁷和金毛猎犬肌营养不良（GRMD）犬模型⁸。在本研究中，我们记录个体在接受轻度运动刺激后立即开始的6分钟内自由开放环境中的自主活动情况，并利用免费的开源软件通过随时间变化的水平移动来计算行走距离。

该方法的主要优势在于，无需使用专用设备或高成本的商业分析软件，即可在多种环境下对动物进行测试。此分析的一个重要特点是，它可以在基础实验室环境中完成，无需将小鼠从动物饲养室转移到专门的核心设施中。本文所述的视频追踪方案非常适合在相对较短的时间段内评估行走活动，能够检测野生型小鼠与mdx小鼠之间的活动差异，并可揭示杜氏肌营养不良（DMD）挽救模型中的功能改善。

方案

本研究所采用的方法已获得加州大学洛杉矶分校机构动物护理和使用委员会的批准（批准号：2000-029-43）。野生型（C57BL/6J）和mdx小鼠（C57Bl/10ScSn背景）购自商业来源。mdx:utrophin-Tg小鼠由James Ervasti惠赠，并经Kay Davies许可，维持在mdx背景上。行走能力检测在6月龄雄性小鼠上进行。小鼠饲养于Terasaki生命科学动物实验中心，遵循加州大学洛杉矶分校机构动物护理和使用委员会制定的指南，本研究亦获得加州大学洛杉矶分校动物福利保证（批准号：A3196-01）的批准。

1. 准备反应室

1. 在安静、温度受控的环境中，于每天的同一时间进行数据采集⁹。对被测小鼠的基因型和处理方式保持盲法进行测试。
2. 可采用任何开放场箱系统进行本项分析。
   注意：本研究中使用的是由大型垃圾箱制成的低成本且易于搬运的记录箱。开放场区域为放置在笼子或类似高架平台上的托盘。
3. 将摄像头置于箱体上方的金属网架上，以实现对整个区域的完整录制。
4. 每次试验前，使用消毒剂清洁记录箱。

2. 运动前方案与数据采集

1. 可选步骤：在开始活动记录前，立即对每只小鼠实施一次肌肉激活方案。
   注意：此步骤为可选，但在涉及mdx小鼠的实验中建议执行。
   1. 让小鼠抓住数字测力计的拉杆，轻柔向后拉，直至小鼠松开拉杆。每次试验重复该过程五次。
   2. 记录每次试验中的峰值张力（N）。
      注意：除了作为行走实验中的运动刺激外，该抓力测试中小鼠施加的力还可作为另一项功能性结果指标^2,10。
   3. 每只小鼠共进行五次试验，每次试验之间休息1分钟。
2. 在完成抓力测试或其他运动方案后，立即将小鼠放入活动室中。
3. 开始录制小鼠在活动室区域内的运动视频，允许小鼠自由探索6分钟。
4. 在6分钟时停止录制，并将小鼠放回其原饲养笼中。

3. 视频分析

1. 可选步骤：通过降低帧率来准备用于分析的视频。为了在追踪分析前将视频帧率降低为原来的二分之一，请在视频编辑软件（例如，iMovie 或类似程序）中使用以下协议对视频进行帧率下采样。
   注意：根据视频的长度和帧率，分析前降低帧率可能有助于提高处理效率。本研究中，视频以每秒30帧的速度录制（录制时长6分钟，总计约10,800帧）。
   1. 将视频加载到软件中。
   2. 在“速度”菜单下，选择“速度：快”，并将速度设置为2倍。
   3. 以 .mp4 文件格式导出下采样后的视频，用于后续追踪分析。
2. 在分析软件中打开视频。使用直线工具对视频进行标定：沿行为箱的一侧画一条直线。右键单击该直线，选择“标定测量值…”，然后输入行为箱边长的实际厘米数值。
3. 要开始对小鼠位置进行半自动追踪，请点击“移动”光标。
   从视频的初始帧开始，右键单击需要追踪的点；追踪点将以蓝色圆圈标记。
   注意：在本研究中，通过追踪每只动物尾基部的位置来确定其运动轨迹。
4. 通过按下键盘上的右箭头键前进至下一帧；追踪点应根据尾基部的位置自动移动。
   1. 如果在某一帧中追踪点未与目标位置对齐，请手动将蓝色圆圈调整至尾基部位置。
      注意：根据视频质量及小鼠运动速度，追踪过程可能需要不同程度的人工干预以保持与目标点的对齐。小鼠的运动轨迹应在视频播放过程中连续推进。
5. 完成整段视频的追踪后，保存视频及其轨迹叠加图像。通过选择“导出到电子表格”功能导出轨迹的位置数据。

4. 数据分析

1. 在电子表格软件程序中打开位置数据。运动分析软件会报告每帧图像中鼠标的位置坐标（X,Y）。
2. 要计算每帧之间的移动距离，请使用以下公式（其中第一帧中的位置为 x₁,y₁，第二帧中的位置为 x₂,y₂）：
   
   注意：通过累加每一帧之间的移动距离，可计算出随时间累积的总移动距离。

结果

旷场实验的多种改良方法已被证明是检测肌营养不良症模型疾病进展的有效手段。在此，我们展示了一种多功能的视频追踪方法，用于分析小鼠的二维运动，该方法使用 readily available 的录制设备和开源软件（图1A-B）。与类似实验报道的结果一致，我们发现，在测试前立即接受运动干预的 mdx 小鼠，在6分钟旷场任务中的自主运动显著少于野生型小鼠（图1C，图2）。在经历握力测试引起的轻度运动负荷后，mdx 小鼠在行走实验的最初几分钟内通常保持静止，到第4至5分钟时运动量略有增加（图3A）。当在未施加运动干预的条件下测试野生型与 mdx 动物时，我们未检测到两者在总移动距离上的差异（

讨论

旷场实验为检测肌肉疾病小鼠模型的运动功能提供了一种有效且非侵入性的方法，该实验的多种变体可作为临床前研究中重要的终点评估指标。此类实验的一个主要局限在于活动监测系统的高成本和可及性有限。在本研究中，我们展示了一种低成本的旷场活动分析系统，其能够产生与现有商业软件和设备相似的结果。该系统可在动物饲养屏障内使用，无需将动物转移至核心设施。该实验的灵活性还使其可广泛应用于各类科研和教学场景，包括以动物生理学和行为学为核心的本科实验课程。

本研究发现，在运动加剧后，野生型小鼠与mdx小鼠在自主运动方面的差异可被轻易检测到。其他研究团队在观察类似活动指标时也报道过这种显著差异，包括持续一小时的开放场地实验和过夜直立行为实验。尽管我们在未经运动处理的野生型小鼠与mdx小鼠之间未观察到自主行走的差异，但这一结果与其他团队的研究结果一致¹³。部分研究人员报告称，在未经运动处理的野生型小鼠与mdx小鼠之间，自主行走距离存在轻微差异⁷，而另一些研究则报告...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
摄像机	Apple Inc.	ME553LL/A	用于记录行走视频，iPhone 5S Plus（或同等设备）
Kinovea 软件（版本 0.8.15）	Kinovea 协会		开源视频分析软件。可免费下载，兼容 PC（版本 0.8.15，www.kinovea.org）
iMovie（版本 10.0.6）	Apple Inc.		可使用任何类似软件降低视频帧率（可选）
Roughneck 32 加仑黑色圆形垃圾桶（开放场装置）	Rubbermaid	# 1778013	可适配任何开放场装置用于记录。本研究使用一个由托盘置于平台构成的记录装置，放置于大型垃圾桶底部
Avant 白色塑料托盘 15"W x 10"D x 1.45"H（开放场装置）	US Acrylic, LLC		可使用任何开放场装置进行记录。本研究使用一个由托盘置于平台构成的记录装置，放置于大型垃圾桶底部
C57BL/6J	Jackson Laboratory	#000664	雄性 6 月龄小鼠
C57BL/10ScSn-Dmd/J (mdx)	Jackson Laboratory	#001801	雄性 6 月龄小鼠
mdx: utrophin-Tg（fiona）	由 James Ervasti 惠赠，并获 Kay Davies 授权		雄性 6 月龄小鼠