本方案描述了一种灵活且低成本的小鼠在开放场地活动实验中测量其行走能力的系统。我们证明，基于该系统的6分钟行走实验能够检测到mdx小鼠自主运动能力的下降，并能准确区分这些动物在肌肉特异性挽救后的功能改善。
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本文内容
摘要
摘要
在进行肌营养不良症治疗的临床前测试时，测量功能学结局指标是一项至关重要的环节。对小鼠模型自主行走能力的评估是一种非侵入性且可重复的行为检测方法，其原理直接类比于临床患者行走功能的评估手段，例如6分钟步行试验及相关活动能力评分。目前许多常用的小鼠行走速度与行走距离检测方法均基于开放场地实验（open field test），即在一段时间内记录动物在特定区域内的自由活动情况。该方法的一个主要缺点是，用于高分辨率运动追踪的商业软件和设备价格昂贵，且可能需要将小鼠转移至专门设施进行测试。本文中，我们介绍一种基于视频记录的低成本小鼠行走检测系统，该系统采用免费且开源的软件。通过本实验方案，我们证明了杜氏肌营养不良症（DMD）的dystrophin缺失型mdx小鼠模型的自主行走能力较野生型小鼠显著降低。而在表达utrophin转基因的mdx小鼠中，此类活动缺陷未被观察到，其总行走距离与野生型小鼠无显著差异。该方法能够有效检测与肌营养不良病理相关的自主行走能力变化，且提供了一个灵活多样的实验平台，可轻松适应不同的科研环境。
引言
对肌肉功能进行可靠且可重复的测量，对于评估杜氏肌营养不良症（DMD）潜在疗法的有效性至关重要。DMD 是一种由抗肌萎缩蛋白基因（dystrophin gene）突变引起的遗传性疾病，可导致进行性肌肉无力、丧失行走能力以及最终的心肺衰竭。目前最广泛使用的 DMD 动物模型是抗肌萎缩蛋白缺失的 mdx 小鼠。一系列功能检测方法已逐渐成为常规实验手段，用于评估 mdx 小鼠以及其他肌营养不良和肌病动物模型的疾病进展。常用的 体内 检测方法包括前肢握力测定、悬线悬挂时间、转棒仪最大转速、跑步机运动至力竭的时间以及运动活动轨迹追踪。该领域已投入大量努力以标准化这些检测方法，旨在减少临床前研究之间的变异性，并提高在小鼠中测试的治疗手段的转化潜力1,2。
一个重要的临床前检测类别是自主运动能力的测量，这一参数在小鼠肌营养不良模型中通常会发生改变。该检测通常通过基于开放场活动监测的实验方法进行，可评估数分钟至数小时内的水平运动（行走）或垂直运动（直立）。2,3,4许多研究已表明，自主运动在某些情况下会发生改变 mdx 小....
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方案
本研究所采用的方法已获得加州大学洛杉矶分校机构动物护理和使用委员会的批准（批准号：2000-029-43）。野生型（C57BL/6J）和mdx小鼠（C57Bl/10ScSn背景）购自商业来源。mdx:utrophin-Tg小鼠由James Ervasti惠赠，并经Kay Davies许可，维持在mdx背景上。行走能力实验在6月龄雄性小鼠上进行。小鼠饲养于加州大学洛杉矶分校Terasaki生命科学动物实验中心，遵循该校机构动物护理和使用委员会制定的指南，本研究亦获得加州大学洛杉矶分校动物福利保证（批准号：A3196-01）的批准。
1. 反应室的准备
- 在一天中固定的时间段内，于安静且温度受控的房间中进行数据采集9。对被测小鼠的基因型和处理方式保持盲法进行测试。
- 可采用任何开放场箱系统进行本项分析。
注意：本研究中使用的是由大型垃圾箱制成的低成本且易于搬运的记录箱。开放场区域为放置在笼子或类似高架平台上的托盘。 - 将摄像头置于箱体上方的金属网架上，以实现对整个区域的完整录制。
- 每次试验前均需使用消毒剂清洁记录箱。
2. 运动前方案与数据采集
- 可选步骤：在开始活动记录前，立即对每只小鼠实施一次肌肉激....
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结果
旷场实验的多种改良方法已被证明是检测肌营养不良症模型疾病进展的有效手段。在此，我们展示了一种多功能的视频追踪方法，用于分析小鼠的二维运动，该方法使用 readily available 录制设备和开源软件（图1A-B）。与类似实验报道的结果一致，我们发现，在测试前立即接受运动干预的mdx小鼠，在6分钟旷场任务中的自主活动量显著低于野生型小鼠（图1C，图2）。在经历握力测试引起的轻度体力消耗后，mdx小鼠通常在运动实验的最初几分钟内保持静止，到第4至5分钟时活动量仅有轻微增加（图3A）。当在未施加运动干预的条件下测试野生型和mdx小鼠时，我们未检测到两者在总移动距离上的差异（图.......
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讨论
旷场实验为肌肉疾病小鼠模型的运动功能检测提供了一种有效且非侵入性的方法，该实验的多种变体可作为临床前研究中有价值的终点评估指标。此类实验的一个主要局限在于活动监测系统的高成本和可及性有限。本研究展示了一种低成本的旷场活动分析系统，其结果可与现有的商业软件和设备相媲美。该系统可在动物饲养屏障内直接使用，无需将动物转移至核心设施。该实验的灵活性还使其可广泛应用于各类科研和教学场景，包括以动物生理学与行为学为核心的本科实验课程。
本研究发现，在运动加剧后，野生型小鼠与mdx小鼠在自主运动方面的差异可被轻易检测到。其他研究团队在观察类似活动指标时也报道过这种显著差异，包括持续一小时的开放场地实验和整夜的直立行为实验。尽管我们在未经运动干预的野生型小鼠与mdx小鼠之间未观察到自主行走的差异，但这一结果与其他团队的研究结果一致13。部分研究人员报告称，在未经运动干预的野生型小鼠与mdx小鼠之间，自主行走距离存在轻微差异7，而另一些研究则报告无差异.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究工作获得了美国国立卫生研究院 [R01 AR048179 和 R01 HL126204（授予 R.C.W.），T32 AR059033 和 F32 AR069469（授予 E.M.G）] 以及美国肌肉萎缩症协会 [274143 和 416364（授予 R.C.W.）] 的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 摄像机 | Apple Inc. | ME553LL/A | 用于记录行走视频，iPhone 5S Plus（或同等设备） |
| Kinovea 软件（版本 0.8.15） | Kinovea Association | 开源视频分析软件。可免费下载，兼容 PC（版本 0.8.15，www.kinovea.org） | |
| iMovie（版本 10.0.6） | Apple Inc. | 可使用任何类似软件降低视频帧率（可选） | |
| Roughneck 32 加仑黑色圆形垃圾桶（开放场装置） | Rubbermaid | # 1778013 | 可采用任何开放场装置系统进行记录。本研究使用的记录装置由置于平台上的托盘构成，位于一个大型垃圾桶底部。 |
| Avant 白色塑料托盘 15"W x 10"D x 1.45"H（开放场装置） | US Acrylic, LLC | 可采用任何开放场装置系统进行记录。本研究使用的记录装置由置于平台上的托盘构成，位于一个大型垃圾桶底部。 | |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | #000664 | 雄性 6 月龄小鼠 |
| C57BL/10ScSn-Dmd/J (mdx) | Jackson Laboratory | #001801 | 雄性 6 月龄小鼠 |
| mdx: utrophin-Tg（fiona） | 由 James Ervasti 惠赠，并获 Kay Davies 许可 | 雄性 6 月龄小鼠 |
参考文献
- Nagaraju, K., Carlson, G., De Luca, A. Behavioral and locomotor measurements using open field animal activity monitoring system. TREAT-NMD SOP Number M2.1.002. 2. 2, (2010).
- Tatem, K. S., et al. Behavioral and locomotor measurements using an open field activity monitoring system for skeletal muscle diseases. J ....
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重印与许可
