福尔马林固定样本用于基于肽的基质辅助激光解吸/电离质谱成像工作流程的最佳制备方法

摘要

本方案描述了一种基于升华法的可重复且可靠的制备福尔马林固定组织的方法，该组织用于成像质谱分析。

摘要

基质辅助激光解吸/电离质谱成像（MALDI MSI）技术的应用已迅速扩展，该技术可分析多种生物分子，从药物和脂质到N-糖链均可检测。尽管目前已存在多种样本制备方法，但从甲醛固定的组织中检测肽段仍是此类质谱分析中最具挑战性的难题之一。为此，我们建立并优化了一种稳健的方法，该方法在保留样本内部空间信息的同时，最大限度地释放可电离的肽段。我们还力求以经济、简便的方式实现这一目标，从而避免使用自动化仪器时可能产生的偏差或制备误差。最终形成了一套可重复且成本低廉的实验方案。

引言

基质辅助激光解吸/电离质谱成像技术（MALDI MSI）作为一种基于图像的分析方法，已应用了二十年^1,2，可用于分析多种生物分子，包括：脂质³、肽段^2,4、蛋白质^2,5、代谢物^6,7、N-聚糖⁸，以及合成分子如治疗性药物^9,10。在过去十年中，展示该技术实用性的出版物数量显著增长^6,11,12,13。某些分子（如脂质）由于其化学性质易于电离，因此通过MALDI MSI进行分析相对简单，通常无需复杂的前处理....

方案

警告：进行本操作时应遵循所有适用的安全预防措施，包括使用适当的个人防护装备（PPE）（例如，实验服、丁腈手套、护目镜、等）

1. 试剂与设备的准备

1. 溶液的配制
   1. 在洁净的玻璃肖特瓶中，按6:3:1的体积比混合100%乙醇（EtOH）、氯仿和冰醋酸，配制500 mL卡诺氏液。
   2. 制备液态硝化纤维素（NC）时，将NC膜（常用于蛋白质印迹实验）溶于纯丙酮中，通过轻柔振荡使其完全溶解，最终浓度为40 mg/mL。
2. NC包被载玻片的制备
   1. 采用类似于制备用于组织学检查的血涂片的技术²⁰ 制备NC包被载玻片。
   2. 移液 40 µ将液体NC的L滴加到导电的氧化铟锡（ITO）显微镜载玻片的一端边缘。使用普通的玻璃显微镜载玻片，利用表面张力将NC在载玻片表面均匀铺展，形成一层均匀的薄膜涂层。
   3. 让NC在室温下干燥20秒，然后于室温保存至需要时使用。在组织保持完整且无灰尘的条件下，样品可在此条件下长期保存。
      注意：该制备方法更广为人知的名称是 "薄膜" 并且会形成均匀的涂层，这依赖于NC的黏度及其缺乏表面张力的特性，从而在载玻片上自动....

结果

若严格按照本方案操作，所获得的图像能够清晰呈现组织的大体形态，且无任何划痕或其他形变（图1）。对样本制备是否成功进行理想验证的方法，是通过更换所观察的分子，能够区分不同的物理结构（图2）。

判断样本是否制备不当的一个良好参考标准是检查是否存在分子去定位或基质聚集现象；若肽段信号超出了组织的实际边界，则明确表明分子在样本制备过程中发生了移位。这一点在 O'Rourke 和 Padula（2017）¹⁵ 中有详细说明。

产生的肽谱应在所选质量范围内包含大量离散分子，且分布均匀^1,

讨论

本方案旨在最大化生成可电离的分子种类，同时消除分析物的离域现象。关键因素在于应用基质、消化样品或升华后重结晶时遵循相同的主导原则²⁴，即必须形成并维持均匀的蒸气沉积（无论是基质还是其他物质）。在样品正下方均匀地进行溶剂冲洗（用于重结晶和消化），可防止任何局部区域接收到过多的溶剂蒸气。这一点对于防止可见冷凝物的形成至关重要，同时也能有效抑制表面分子的离域，并确保样品被均匀消化和重结晶。实现基质的均匀沉积至关重要：基质过少会导致检测到的分子种类信号强度和多样性相对较低；而基质过多则会抑制样品离子的产生，同样降低信号强度和分子种类的多样性²⁵。为实现基质的均匀沉积，应确保在悬置显微镜载玻片的投影区域正下方，形成一层厚度均匀、晶体大小均一的薄层基质。若该层不均匀或过薄，则基质的升华过程将进行得过慢或不均匀²⁶。手动添加溶剂和酶所可能带来的问题主要取决于操作者的个人经验。需要一定程度的"练习"才能获得可重复的结果，初期可能会出现一些意外的操作失误。然而，只要谨慎操作，确保最终成像结果符合我.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
冷冻切片机	Leica	CM3050	用于组织的制备与切片。
氧化铟锡显微镜载玻片	Bruker	8237001	用于组织的制备与切片。
柯林斯瓶	Sigma Aldrich	S5516	用于组织的制备与切片。
压力锅	Kambrook	KPR620BSS	用于组织的制备与切片。
升华装置	Chem Glass	NA	用于升华步骤。设计类似于CG-3038，但为定制制作
沙浴装置	NA	NA	用于升华步骤。使用细粒河沙，包裹于折叠的铝箔中，来源为外部，非特定公司提供
玻璃培养皿	Sigma Aldrich	CLS70165100	用于升华步骤。
真空泵	NA	NA	用于升华步骤。从一台旧的质谱仪中获取的备用部件
冷阱	Chem Glass	CG-4510-02	用于升华步骤。
加热板	John Morris	EW-15956-32.	用于升华步骤。
塑料培养皿	Sigma Aldrich	Z717223	用于升华步骤。
37 °C 培养箱	NA	NA	用于升华步骤。不适用，该培养箱无菌条件无法保证且已使用超过30年
吸水纸	Sigma Aldrich	P7796	用于升华步骤。
硝酸纤维素	Sigma Aldrich	N8395	用于载玻片的清洗。
丙酮	Sigma Aldrich	650501	用于载玻片的清洗。
二甲苯	Sigma Aldrich	214736	用于载玻片的清洗。
100% 乙醇	Sigma Aldrich	1.02428	用于载玻片的清洗。
70% 乙醇	Sigma Aldrich	NA	用于载玻片的清洗。由实验室中95%乙醇储备液配制而成
氯仿	Sigma Aldrich	C2432	用于载玻片的清洗。
冰醋酸	Sigma Aldrich	ARK2183	用于载玻片的清洗。
Tris HCl pH 8.8	Sigma Aldrich	TRIS-RO	用于蛋白酶解切割。将粉末配制成1M溶液，再用32%盐酸调节pH至8.8
超纯水（Milli-Q）	Sigma Aldrich	NA	用于蛋白酶解切割。由Sartorius水纯化系统在实验室内部完成纯化
碳酸氢铵	Sigma Aldrich	A6141	用于蛋白酶解切割。
胰蛋白酶	Sigma Aldrich	T0303	用于蛋白酶解切割。
CHCA基质	Sigma Aldrich	C2020	用于重结晶。
乙腈	Sigma Aldrich	1.00029	用于重结晶。
三氟乙酸（TFA）	Sigma Aldrich	302031	用于重结晶。