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方法文章

福尔马林固定样本用于基于肽的基质辅助激光解吸/电离质谱成像工作流程的最佳制备方法

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DOI：

10.3791/56778

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2018年1月16日

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1Mass Spectrometry Core Facility, University of Sydney, 2Proteomics Core Facility, University of Technology Sydney, 3Neuropathology Group, Discipline of Pathology, School of Medical Sciences, University of Sydney, 4Redox Biology Group, Discipline of Pathology, School of Medical Sciences, University of Sydney

本文内容

摘要

本方案描述了一种基于升华法的可重复且可靠的制备福尔马林固定组织的方法，该组织用于成像质谱分析。

摘要

基质辅助激光解吸/电离质谱成像（MALDI MSI）技术的应用已迅速扩展，该技术可分析多种生物分子，从药物和脂质到N-糖链均可检测。尽管目前已存在多种样本制备方法，但从甲醛固定的组织中检测肽段仍是此类质谱分析中最具挑战性的难题之一。为此，我们建立并优化了一种稳健的方法，该方法在保留样本内部空间信息的同时，最大限度地释放可电离的肽段。我们还力求以经济、简便的方式实现这一目标，从而避免使用自动化仪器时可能产生的偏差或制备误差。最终形成了一套可重复且成本低廉的实验方案。

引言

基质辅助激光解吸/电离质谱成像技术（MALDI MSI）作为一种基于图像的分析方法，已应用了二十年1,2，可用于分析多种生物分子，包括：脂质3、肽段2,4、蛋白质2,5、代谢物6,7、N-聚糖8，以及合成分子如治疗性药物9,10。在过去十年中，展示该技术实用性的出版物数量显著增长6,11,12,13。某些分子（如脂质）由于其化学性质易于电离，因此通过MALDI MSI进行分析相对简单，通常无需复杂的前处理步骤3。然而，对于肽段等较难检测的目标分子，实现有效电离所需的步骤则较为繁多且通常复杂14。目前，极少有出版物致力于解决或展示该独特可视化技术在组织样本制备方法上的可重复性15。鉴于此，我们汇总了相关观察结果，并将优化措施整合为一种简便易行的统一方法，该方法在对甲醛交联组织来源的肽段进行分析时，应几乎无需任何修改即可直接应用14。

在本文中，我们描述了一种经过验证、低成本且可重复的方法，用于检测并进行肽段的空间定位，这些肽段来源于甲醛固定冷冻（FFF）和甲醛固定石蜡包埋（FFPE）组织切片。该方法无需依赖任何专用仪器3。具体而言，我们阐述了分析肽段所需的各种特殊样品制备步骤，包括抗原修复16和基质包被等环节。我们的方案还采用了价格低廉的设备和试剂，从而使该方法能够被更广泛的科研群体所采用，尤其适用于那些无法负担替代性自动化设备17的研究人员。

开发手动样品制备方法的原因有两点：首先，使用升华装置可形成一致且均匀的基质晶体涂层，晶体长度约为 1 µm18，而常见的喷雾技术无法达到这一效果。其次，设备搭建成本相对较低：定制装置的总成本低于<1500 澳元。我们注意到，从成本效益角度来看，不使用机器人机械时，每个样品的处理成本要低得多。尽管此前已有文献报道过升华技术的应用，但据我们所知，尚未有文献报道或描述该过程及样品制备的逐步操作方法。

本方案旨在帮助拥有基质辅助激光解吸电离（MALDI）质谱仪的研究人员，获取与目标生物分子相关的空间分布信息19。本质上，MALDI质谱成像（MSI）是一种组织学筛查方法，无需依赖抗体或染色剂2。

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方案

警告：进行本操作时应遵循所有适用的安全预防措施，包括使用适当的个人防护装备（PPE）（例如，实验服、丁腈手套、护目镜、等）

1. 试剂与设备的准备

  1. 溶液的配制
    1. 在洁净的玻璃肖特瓶中，按6:3:1的体积比混合100%乙醇（EtOH）、氯仿和冰醋酸，配制500 mL卡诺氏液。
    2. 制备液态硝化纤维素（NC）时，将NC膜（常用于蛋白质印迹实验）溶于纯丙酮中，通过轻柔振荡使其完全溶解，最终浓度为40 mg/mL。
  2. NC包被载玻片的制备
    1. 采用类似于制备用于组织学检查的血涂片的技术20 制备NC包被载玻片。
    2. 移液 40 µ将液体NC的L滴加到导电的氧化铟锡（ITO）显微镜载玻片的一端边缘。使用普通的玻璃显微镜载玻片，利用表面张力将NC在载玻片表面均匀铺展，形成一层均匀的薄膜涂层。
    3. 让NC在室温下干燥20秒，然后于室温保存至需要时使用。在组织保持完整且无灰尘的条件下，样品可在此条件下长期保存。
      注意：该制备方法更广为人知的名称是 "薄膜" 并且会形成均匀的涂层，这依赖于NC的黏度及其缺乏表面张力的特性，从而在载玻片上自动流平。制备载玻片时唯一需要注意的是不要操作过快，否则会导致NC出现条纹而非完全覆盖。
      ​警告：由于液态硝化纤维素（NC）干燥非常迅速，必须迅速操作，以避免溶液在未充分铺展前即干燥。处理液态NC时也应格外小心，因其为高能化合物，不得接触点火源，以防发生燃烧爆炸。NC在干燥过程中会发生吸热转变，若长时间接触皮肤或戴着手套的手部，可能引起低温灼伤。为最大限度降低相关风险，每次仅应制备少量<建议使用1 mL。干燥后可在室温下稳定保存。然而，当硝化纤维素（NC）大量存在时仍可能具有爆炸性。
  3. 定制化蒸汽室的制备
    1. 用剪刀裁剪一张厚吸水纸，使其大小足以放入标准塑料培养皿（直径94 mm，厚3 mm）的下半部分。
    2. 裁剪纸张，保留中央一个与显微镜载玻片尺寸相同的矩形条带，并留出足够的边缘余量，以确保纸张在培养皿中保持固定位置（补充图1).

2. 组织切片的制备

  1. 石蜡包埋组织（FFPE）21
    1. 选择所需的组织块，在标准手动切片机上以12 µm厚度进行切片，并将切片漂浮贴附于经NC预包被的ITO载玻片上。
    2. 将载玻片浸入新鲜的二甲苯中2分钟以去除残留石蜡，并重复该步骤一次。
      注：如果石蜡块中石蜡含量特别高，或组织相对于石蜡块较小，可在二甲苯洗涤前于60 °C加热以熔化大部分石蜡。
    3. 将脱蜡后的样品依次浸入梯度溶剂系列中清洗：70% v/v 乙醇/水、100% 乙醇、Carnoy固定液、100% 乙醇、超纯水和100% 乙醇。每次浸泡时间为30秒，Carnoy固定液除外，需持续2分钟。
      ​警告：Carnoy固定液和二甲苯必须在通风橱中储存和使用，因其吸入后具有高度毒性。
  2. 甲醛固定冷冻组织（FFF）
    注：样品应已根据组织类型适当冷冻。
    1. 将组织块在切片机工作温度下平衡20分钟22。
      注：平衡温度取决于组织类型。
    2. 使用切片机以12 µm厚度对组织进行切片，并将切片解冻贴附于预先制备的NC包被ITO载玻片上。
    3. 将载玻片置于避光处的真空干燥器中室温保存。
      注：样品在此条件下可保存数周。
    4. 按照石蜡包埋组织（2.1.3）所述的梯度溶剂系列清洗样品。
      注：由于样品未包埋于石蜡中，无需进行二甲苯脱蜡步骤。

3. 亚甲基交联水解

  1. 将样本载玻片（FFP或FFPE）放入塑料玻片盒中，并用20 mmol Tris-HCl（pH 8.8）溶液注满至顶部。密封盒子后，将其置于含有500 mL水的水浴中，使盒子底部接触水浴底部。然后在可达到70 kPa工作压力的压力锅中于120 °C加热15分钟。
  2. 取出载玻片，使其冷却，并在室温下干燥15分钟。

4. 组织消化

  1. 水解后，用10 µ10 μL 胰蛋白酶溶液（1 mg/mL）的超纯水中 µ将溶液的 L 加到组织切片的边缘，然后使用同一移液枪头，在表面张力作用下将液滴拖过组织的整个表面。
    注意：避免使用移液器吸头划伤组织表面，并防止酶液扩散超出组织边缘。
  2. 让样品在室温下干燥。
  3. 干燥后，用高压灭菌胶带将样本固定于先前制备的蒸气室顶部内侧（组织面朝下），胶带置于载玻片两侧边缘补充图2).
  4. 移液 600 µ将100%乙腈与50 mM碳酸氢铵按1:1 v/v比例混合的溶液小心地滴加到培养皿底部部分的吸水纸指上，直至吸水纸指均匀湿润。
  5. 将蒸气室的上半部分放置在下半部分上，确保滤纸条与样本载玻片完全对齐，并用石蜡膜在蒸气室赤道位置周围密封。
  6. 将样本在37℃下孵育过夜 °C 培养箱中孵育以确保完全消化。

5. 通过升华法进行基质包被

  1. 消化完成后，使用五位数微量分析天平称量样本载玻片。
  2. 将载玻片固定在升华装置的冷却指上，并用铜箔胶带固定，固定方式与气相室所述方法相同（补充图3）。
    注意：为确保冷却指与载玻片接触均匀，需在冷却指底部贴一层铜箔胶带以平整表面。这可保证载玻片均匀冷却，从而实现基质的均匀沉积。
  3. 将300 mg的α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）基质放入腔室底部的玻璃培养皿中，并均匀铺开，形成一层薄薄的基质晶体。
  4. 组装升华仪，并用马蹄形夹具固定上下两部分。将组装好的装置悬挂在金属环中，并通过铁架台将其置于预热至220 °C的沙浴上方15–20 cm处。
  5. 将腔室连接至真空源，启动真空泵，抽真空并稳定至约25 mTorr，持续5分钟。
  6. 用冰填满冷却指至顶部，并加入50 mL水。继续静置装置5分钟后再进行下一步操作。
  7. 将腔室 lowered 放至沙浴表面，确保沙子完全接触腔室底部，保持45分钟，以形成理想的0.22 mg/cm2涂层。
    警告：在高真空条件下操作玻璃器皿时应格外小心，因为在抽真空状态下若装置受损，可能导致玻璃腔室发生灾难性破裂。
  8. 45分钟后，通过提升金属环将腔室移离沙浴，并对腔室通气。
    注意：一旦腔室通气后，必须迅速取出载玻片，否则空气中的水分会开始在冷却指和样本载玻片上冷凝。
  9. 取下载玻片并称重，以确认是否达到预期的涂层厚度。
    注意：若涂层不足，可对同一载玻片重复升华过程，直至达到所需的涂层厚度。

6. 重结晶

  1. 升华完成后，将样本载玻片安装到先前构建的蒸气室顶部内，如前所述（组织面朝下）。
  2. 用移液器小心地将600 µL含有1:1（v/v）体积比的100%乙腈和0.1%（v/v）三氟乙酸水溶液滴加到培养皿底部的吸水纸上，以确保均匀覆盖。
  3. 组装好蒸气室，确保纸条与显微载玻片完全对齐，然后置于37 °C培养箱中孵育1小时。
    注意：切勿密封蒸气室。
    备注：基质正常情况下呈黄色，重结晶后应变为白色，光泽减弱，且表面非常均匀。这表明重结晶操作已正确完成。
  4. 样本现已准备好进行分析。

7. 仪器设备

  1. 使用平板扫描仪扫描载玻片，以生成数字图像。
  2. 将样品载入质谱仪，然后使用相应的软件平台进行分析。
  3. 采用正离子反射模式对样品进行分析，质荷比范围为750–3,500 Da，斑点分辨率应符合预期结果的要求。大多数情况下，20–50 µm的光栅宽度已足够，但也可使用低至10 µm的光栅宽度15。
    注意：MALDI紫外激光器是电离辐射源，切勿直接观察。操作前务必确保激光处于仪器屏蔽装置内部。

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结果

若严格按照本方案操作，所获得的图像能够清晰呈现组织的大体形态，且无任何划痕或其他形变（图1）。对样本制备是否成功进行理想验证的方法，是通过更换所观察的分子，能够区分不同的物理结构（图2）。

判断样本是否制备不当的一个良好参考标准是检查是否存在分子去定位或基质聚集现象；若肽段信号超出了组织的实际边界，则明确表明分子在样本制备过程中发生了移位。这一点在 O'Rourke 和 Padula（2017）15 中有详细说明。

产生的肽谱应在所选质量范围内包含大量离散分子，且分布均匀1,

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讨论

本方案旨在最大化生成可电离的分子种类，同时消除分析物的离域现象。关键因素在于应用基质、消化样品或升华后重结晶时遵循相同的主导原则24，即必须形成并维持均匀的蒸气沉积（无论是基质还是其他物质）。在样品正下方均匀地进行溶剂冲洗（用于重结晶和消化），可防止任何局部区域接收到过多的溶剂蒸气。这一点对于防止可见冷凝物的形成至关重要，同时也能有效抑制表面分子的离域，并确保样品被均匀消化和重结晶。实现基质的均匀沉积至关重要：基质过少会导致检测到的分子种类信号强度和多样性相对较低；而基质过多则会抑制样品离子的产生，同样降低信号强度和分子种类的多样性25。为实现基质的均匀沉积，应确保在悬置显微镜载玻片的投影区域正下方，形成一层厚度均匀、晶体大小均一的薄层基质。若该层不均匀或过薄，则基质的升华过程将进行得过慢或不均匀26。手动添加溶剂和酶所可能带来的问题主要取决于操作者的个人经验。需要一定程度的"练习"才能获得可重复的结果，初期可能会出现一些意外的操作失误。然而，只要谨慎操作，确保最终成像结果符合我...

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披露

作者声明无利益冲突或商业利益需披露

致谢

作者感谢悉尼医学院基金会和Blues以及基金会通过其阿尔茨海默病研究博士奖学金项目以及授予PKW的澳大利亚研究委员会发现项目基金（DP160102063）对本研究部分工作的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
冷冻切片机LeicaCM3050用于组织的制备与切片。
氧化铟锡显微镜载玻片Bruker8237001用于组织的制备与切片。
柯林斯瓶Sigma AldrichS5516用于组织的制备与切片。
压力锅KambrookKPR620BSS用于组织的制备与切片。
升华装置Chem GlassNA用于升华步骤。设计类似于CG-3038，但为定制制作 
沙浴装置NANA用于升华步骤。使用细粒河沙，包裹于折叠的铝箔中，来源为外部，非特定公司提供
玻璃培养皿Sigma AldrichCLS70165100用于升华步骤。
真空泵NANA用于升华步骤。从一台旧的质谱仪中获取的备用部件 
冷阱Chem GlassCG-4510-02用于升华步骤。
加热板John MorrisEW-15956-32. 用于升华步骤。
塑料培养皿Sigma AldrichZ717223用于升华步骤。
37 °C 培养箱NANA用于升华步骤。不适用，该培养箱无菌条件无法保证且已使用超过30年 
吸水纸Sigma AldrichP7796用于升华步骤。
硝酸纤维素 Sigma AldrichN8395用于载玻片的清洗。
丙酮Sigma Aldrich650501用于载玻片的清洗。
二甲苯Sigma Aldrich214736用于载玻片的清洗。
100% 乙醇Sigma Aldrich1.02428用于载玻片的清洗。
70% 乙醇Sigma AldrichNA用于载玻片的清洗。由实验室中95%乙醇储备液配制而成 
氯仿Sigma AldrichC2432用于载玻片的清洗。
冰醋酸Sigma AldrichARK2183用于载玻片的清洗。
Tris HCl pH 8.8Sigma AldrichTRIS-RO用于蛋白酶解切割。将粉末配制成1M溶液，再用32%盐酸调节pH至8.8
超纯水（Milli-Q）Sigma AldrichNA用于蛋白酶解切割。由Sartorius水纯化系统在实验室内部完成纯化
碳酸氢铵Sigma AldrichA6141用于蛋白酶解切割。 
胰蛋白酶Sigma AldrichT0303用于蛋白酶解切割。 
CHCA基质Sigma AldrichC2020用于重结晶。
乙腈Sigma Aldrich1.00029用于重结晶。
三氟乙酸（TFA） Sigma Aldrich302031用于重结晶。

参考文献

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