多肽基基质辅助激光解吸/电离质谱成像中福尔马林固定样品的优化制备工作流

Summary

本协议描述了一种可重现且可靠的方法, 用于 sublimation-based 制备用于成像质谱的福尔马林固定组织。

Abstract

基质辅助激光解吸/电离, 质谱成像 (MALDI MSI) 的使用迅速扩大, 因为这项技术分析了大量的生物分子从药物和血脂到 n-糖。尽管存在各种样品制备技术, 但从甲醛保存的组织中检测多肽仍然是这类质谱分析中最困难的挑战之一。基于这个原因, 我们创建并优化了一个健壮的方法, 它保留了样本中包含的空间信息, 同时引出了最大数量的电离肽。我们还旨在以成本效益和简单的方式实现这一目标, 从而消除在使用自动化检测时可能出现的潜在偏差或准备错误。最终结果是一个可重现且价格低廉的协议。

Introduction

基质辅助激光解吸/电离质谱成像 (MALDI MSI) 已被用作图像技术的二十年^1,2, 分析的生物分子范围包括: 脂类³, 多肽^{2 ,4},蛋白质²,⁵, 代谢物⁶,⁷, n-糖⁸, 以及合成分子, 如治疗药物 9^,10。显示此技术实用工具的出版物数量在过去十年中显著增长^{6、11、12、13}。某些分子, 如血脂, 是相对容易通过 MALDI MSI 分析, 因为它们电离容易由于其化学性质, 因此需要很少的前期准备³。然而, 对于更难的目标, 如肽, 有效电离这些分子所需的步骤是广泛的, 一般复杂的¹⁴。目前很少有出版物旨在处理或证明在使用这种独特的视觉技术的组织的方法¹⁵的重现性。出于这个原因, 我们已经将观察和实施的优化编译成一个单一的, 易于实施的方法, 不应该需要修改, 从甲醛交联组织来源的多肽的分析¹⁴。

在这份手稿中, 我们描述了一个验证的, 低成本的可重现性的方法, 用于检测和空间映射的多肽, 由福尔马林固定冷冻 (FFF) 和福尔马林固定石蜡嵌入 (FFPE) 组织切片。此方法不需要或依赖于任何专用的工具³。具体来说, 我们处理的许多方面的专业样品准备必要的分析多肽;步骤, 如抗原检索¹⁶和基体涂层。我们的协议还利用了廉价的设备和试剂, 从而使这种方法可供更广泛的社区使用, 否则将无法负担替代的机器人设备¹⁷。

开发人工样品制备方法的背后的原因是两个方面: 第一, 使用升华创建一个一致的和均匀的矩阵晶体的涂层, 是〜1µm 长度为¹⁸, 这是无法做到的, 更常见的喷涂技术.其次, 相对较小的设置成本: 自定义设备的总成本为 < 1500 澳元。我们注意到, 在成本效益方面, 当没有机器机器参与的时候, 每个样品的价格就会便宜得多。以前已经报告过升华的使用, 然而, 据我们所知, 在文献中没有报告也没有描述这一过程和样品制备的 step-by 步骤方法。

本协议旨在帮助研究人员获得 MALDI 质谱仪, 并意图生成与感兴趣的生物分子相关的空间信息¹⁹。在本质上, MALDI MSI 是一种组织学检查的形式, 不依赖于抗体或污点²。

Protocol

警告: 执行此过程时应遵循所有适用的安全措施, 包括使用适当的个人防护设备 (PPE) (例如,实验室大衣、腈手套、安全眼镜、等)

1. 试剂和设备的制备

1. 解决方案的准备
   1. 准备500毫升的 Carnoy 的液体, 混合100% 乙醇 (乙醇), 氯仿和冰醋酸在一个 6:3: 1 伏/v/v 的比例在一个干净的玻璃肖特瓶。
   2. 使液体硝化纤维 (nc), 溶解在整齐的丙酮的 nc 膜 (通常用于西部印迹), 由温和的搅拌, 最终浓度为40毫克/毫升。
2. 数控涂布滑轨的研制
   1. 使用类似于用于组织学检查的血液涂片制备的技术²⁰准备 NC 涂层幻灯片。
   2. 在导电铟锡氧化物 (ITO) 显微镜滑动的一条边上, 将液体 NC 40 µL。使用常规的玻璃显微镜滑动, 在滑动的表面张力下拖动 NC 以创建均匀的薄膜涂层。
   3. 允许 NC 在室温下干燥二十年代, 然后在室温下存储直到需要。在这些条件下的样品储存可以是无限期的, 只要组织保持和没有灰尘。
      注: 这种制备方法更被称为 "薄膜", 并将产生一种均匀的涂层, 它依赖于 NC 的粘度以及其表面张力在 self-level 上的缺乏。在准备幻灯片时, 唯一需要注意的是不要移动得太快, 这将创建 NC 的条纹而不是完整的覆盖范围。
      注意: 由于液态 NC 干燥得非常快, 所以必须迅速工作以避免溶液在适当扩散之前干燥。在处理 NC 时也应注意其液态状态, 因为它是一种高能的化合物, 不应与点火源接触以防止燃烧爆炸。NC 在干燥过程中也会发生吸热转变, 如果允许长时间接触皮肤或戴手套的手, 则会导致冷灼伤。为了尽量减少所有相关风险, 每次只应准备少量 (< 1 毫升建议)。一旦干燥, 它在室温下是稳定的。但是, NC 在大量存在时仍能保持爆炸性。
3. 定制蒸气室的创建
   1. 切一张厚的纸, 一把剪刀大到足以适合底部一半的标准塑料培养皿 (直径94毫米和3毫米厚)。
   2. 切纸, 在中心留下一个长方形的长条, 与显微镜幻灯片一样大小, 留下足够的过剩, 使纸张将保持其在培养皿中的位置 (补充图 1)。

2. 组织切片的制备

1. FFPE 组织²¹。
   1. 选择所需的组织块和它在12µm 厚度在标准的长凳上安装切片和浮动安装到 NC 预 ITO 幻灯片。
   2. 将新鲜的二甲苯中的玻片浸入, 去除剩余的石蜡2分钟, 再重复一次操作。
      注: 如果石蜡块特别普遍或组织相对于石蜡块比较小, 样品可以在60° c 加热, 以在二甲苯洗涤前融化大多数。
   3. 洗涤 deparaffinized 样品通过淹没幻灯片在一个分级的溶剂系列: 70% 伏/v 乙醇/水, 100% 乙醇, Carnoy 的液体, 100% 乙醇, 超纯水和100% 乙醇。每个浸没的持续时间应该是三十年代, 除了 Carnoy 的流体, 必须持续2分钟。
      注意: Carnoy 的液体和二甲苯必须储存在通风柜中使用, 因为它们在吸入时具有剧毒。
2. 福尔马林固定冷冻 (FFF) 组织
   注: 样品应已冻结, 并根据样品类型适当。
   1. 平衡在切片的工作温度下的组织块进行20分钟的²²。
      注意: 平衡温度取决于组织的类型。
   2. 节的组织使用切片在12µm 和解冻安装的部分到准备 NC 涂层 ITO 幻灯片。
   3. 将幻灯片放在黑暗中的长凳上的真空干燥里。
      注: 在这些情况下, 样品可以存放数周。
   4. 按 FFPE 组织 (2.1.3) 所述的分级溶剂系列清洗样品。
      注: 不需要二甲苯 deparaffinisation 步骤, 因为样品没有嵌入。

3. 亚甲基交联水解

1. 将示例幻灯片 (FFF 或 FFPE) 装入一个塑料滑动框, 其中填充有20摩尔三盐酸 (pH 8.8)。密封的盒子, 并把它放在一个水浴, 包含500毫升的水, 让盒子触摸底部。然后加热15分钟, 在120° c 的压力锅, 可以达到70人民军的操作压力。
2. 取出幻灯片, 让它们冷却, 让它们在室温下干燥15分钟。

4. 组织消化

1. 一旦水解, 用10µL 的胰蛋白酶溶液 (1 毫克/毫升) 在超纯水中涂上样品, 通过移10µL 溶液到组织切片的边缘, 然后使用同样的吸管尖端, 将液滴穿过表面的组织的整个表面。紧张.
   注意: 避免用吸管尖端刮伤组织表面, 并在组织边缘外扩散酶。
2. 允许样品在室温下干燥。
3. 一旦干燥, 将样品装入先前构造的蒸气室的顶部 (组织朝下), 在幻灯片的任一边缘 (补充图 2) 使用高压釜胶带。
4. 吸管600µL 的解决方案, 其中包含100% 乙腈和50毫米碳酸氢铵的混合物仔细到印迹纸手指在培养皿的底部, 直到手指似乎是均匀湿润。
5. 将蒸气室的上半部分放在下半部, 确保纸手指和样品滑动对齐, 并将其密封在其赤道周围与石蜡膜。
6. 在37° c 的恒温箱中过夜, 让样品完全消化。

5. 通过升华的基体涂层

1. 一旦消化, 在5位数的分析天平上称量样本幻灯片。
2. 将滑块安装在升华装置的冷却手指上, 用铜带固定, 与蒸汽室 (补充图 3) 所描述的方法相同。
   注意: 为确保滑块与冷却手指均匀接触, 将一层铜带放在冷却手指的底部, 使其表面平整。这保证了滑动均匀地被冷却, 导致甚而基体的证言。
3. 将α-氰基 4-肉桂酸 (CHCA) 基体的300毫克放入腔室底部的玻璃培养皿中, 均匀分布, 形成一层薄薄的基体晶体。
4. 组装的升华和安全的两个半马蹄形钳。将组装单元悬挂在一个沙浴上方15-20 厘米处, 预热于220° c, 将其放置在与反击架相连的金属环上。
5. 将腔室连接到真空源, 接触真空, 使其稳定下来至〜 25 mTorr 5 分钟。
6. 用冰把冷却手指放到顶部, 加50毫升的水。允许仪器在继续前5分钟再解决。
7. 将腔室放在沙子的表面上, 确保沙子完全接触到腔室的底部, 并使其保持45分钟以创建理想的0.22 毫克/cm²的涂层。
   警告: 在高真空处理玻璃器皿时应注意, 因为在疏散时, 设备受到的任何损坏都可能导致玻璃腔的灾难性故障。
8. 45分钟后, 通过提高金属环和排气室, 从砂浴中取出房间。
   注: 一旦腔室被排出, 当空气中的水开始凝结在冻结的手指和样品滑动时, 就必须迅速地移除幻灯片。
9. 卸下滑轨并称重, 以确保所需的涂层已实现。
   注: 如果涂层已达到不足, 只需重复升华过程的幻灯片, 直到所需的涂层厚度已经达到。

6. 再结晶

1. 一旦升华, 在先前建造的蒸气室的顶部安装试样滑动, 如前所述 (组织朝下)。
2. 吸管600µL 的溶液中含有 1:1 (v/v) 100% 乙腈和 0.1% v/v 乙酸酸在水中小心地涂抹在培养皿底部的印迹纸上, 以确保均匀的涂层。
3. 组装室, 确保纸张标签和显微镜滑动对准完美, 并留在37° c 孵化器1小时。
   警告: 不要密封会议厅。
   注: 一旦再结晶, 通常的黄色色调的矩阵应改为白色, 看起来不那么闪亮, 并出现非常均匀。这表明, 再结晶已正确执行。
4. 样品现在可以进行分析了。

7. 仪器仪表

1. 扫描平板扫描仪中的幻灯片以创建数字图像。
2. 将样品加载到质谱仪中, 然后使用相应的软件平台进行分析。
3. 分析了正离子 reflectron 模式的样品, 其质量范围为 750-3, 500 Da, 并对所需的结果进行了现场分辨。在大多数情况下, 20-50 µm 光栅宽度是充足的, 然而, 只需10µm 可以使用¹⁵。
   警告: MALDI UV 激光器是电离辐射的来源, 不应直接查看。在操作前, 确保激光器包含在仪器屏蔽内。

Results

如果正确遵循, 该协议将生成清晰地表示组织的大体形态的图像, 而不需要任何划痕或其他变形 (图 1)。正确执行样本准备的理想验证是通过改变被查看的分子 (图 2) 区分不同物理结构的能力。

一个很好的指南, 确定样本是否已不正确的准备是检查是否存在域或矩阵聚合;延伸到物理组织边界之外的多肽签名是分子在样品制备过程中移动的完美指示器。这在 O 的洛克和 Padula (2017)¹⁵中详细说明。

所产生的肽谱应包含高丰度的离散分子很好地分布在选择的质量范围^1,23<...

Discussion

该协议旨在最大限度地电离分子物种的生成, 同时消除域的分析。在应用矩阵、消化样本或升华²⁴后, 使用相同的覆盖原则是关键因素; 结晶。也就是说, 需要建立和维护一个均匀的蒸气、基体或其他的沉积物。移溶剂洗涤为再结晶和消化, 均匀地在样品之下, 防止任何单独区域接受更多溶剂蒸气比其他任何地方。这是重要的防止形成可见的冷凝和整体抑制域的表面分子, 以及确保样品是均匀消化和再结晶。必须实现矩阵的均匀沉积, 因为太少会显示出相对较低的强度和物种多样性, 而且过多的离子会从样品中压制出来, 同时也降低了物种的强度和多样性²⁵。为了实现均匀的基体沉积, 确保均匀的薄层基体晶体的大小, 直接放在悬浮显微镜滑动的脚印下面。如果该层不均匀或太薄, 则矩阵的升华将进行得太慢或将不均匀²⁶。手动应用溶剂和酶的潜在问题归结为用户的个人经验。为了确保可重复的结果, 需要某种程度的 "练习", 并且可能有一些最初的意外错误准备。但是, 如果要注意确保最后的图像符合我们提供的 "好" 样品的性质, 那么任何不适当的样品都不会...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
冷冻切片机	Leica	CM3050	用于组织制备和切片。
氧化铟锡显微镜载玻片	Bruker	8237001	用于组织制备和切片。
Coplin Jars	Sigma Aldrich	S5516	用于组织制备和切片。
压力锅	Kambrook	KPR620BSS	用于准备和切片组织。
Sublimator	Chem Glass	NA	用于升华程序。在设计上与 CG-3038 相似，但它是定制的
砂浴	NA	NA	用于升华程序。用折叠铝箔制成的细级河沙，来自外部，并非来自任何特定公司
玻璃培养皿	Sigma Aldrich	CLS70165100	用于升华程序。
真空泵	NA	NA	用于升华程序。作为旧质谱仪的备件
冷阱	Chem Glass	CG-4510-02	用于升华程序。
热板	John Morris	EW-15956-32.	用于升华程序。
塑料培养皿	Sigma Aldrich	Z717223	用于升华程序。
37 >C 培养箱	NA	NA	用于升华程序。不适用，培养箱未灭菌且年龄超过 30 年
印迹纸	Sigma Aldrich	P7796	用于升华程序。
硝酸纤维素	Sigma Aldrich	N8395	用于清洗载玻片。
丙酮	Sigma Aldrich	650501	用于洗涤载玻片。
二甲苯	Sigma Aldrich	214736	用于清洗载玻片。
100% 乙醇	Sigma Aldrich	1.02428	用于清洗载玻片。
70% 乙醇	Sigma Aldrich	NA	用于清洗载玻片。由 95% 的原液乙醇在实验室中制造
氯仿	Sigma Aldrich	C2432	用于洗涤载玻片。
冰醋酸	Sigma Aldrich	ARK2183	用于洗涤载玻片。
Tris HCL pH 8.8	Sigma Aldrich	TRIS-RO	用于蛋白水解切割。将粉末制成 1M，然后用 32% HCl 平衡至 PH 值 8.8
Milli Q 超纯水	Sigma Aldrich	NA	用于蛋白水解切割。通过结构性水净化系统在内部进行纯化
碳酸氢铵	Sigma Aldrich	A6141	用于蛋白水解切割。
胰蛋白酶	Sigma Aldrich	T0303	用于蛋白水解切割。
CHCA Matrix	Sigma Aldrich	C2020	用于重结晶。
乙腈	Sigma Aldrich	1.00029	用于重结晶。
三氟乙酸 （TFA）	Sigma Aldrich	302031	用于再结晶。