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一种基于动力学荧光的 Ca2+ 流动检测方法，用于鉴定 G 蛋白偶联受体激动剂、拮抗剂及别构调节剂

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DOI：

10.3791/56780

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2018年2月20日

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1Laboratory of Virology and Chemotherapy, Department of Microbiology and Immunology, Rega Institute for Medical Research, KU Leuven

本文内容

摘要

所述细胞检测旨在鉴定能够抑制或刺激CXC趋化因子受体4（CXCR4）相互作用的试剂，这些试剂可通过竞争性或变构方式抑制或激活由CXCR4激活引发的细胞内Ca2+ 释放。

摘要

G蛋白偶联受体（GPCRs）在制药行业中具有重要意义，因其参与多种人类疾病的发生发展，并包含多个已被充分验证的治疗干预靶点。发现能够特异性抑制受体功能的先导化合物（包括小分子合成化合物）是药物开发的重要初始步骤，依赖于灵敏、特异且稳健的基于细胞的检测方法。本文描述了一种以荧光信号为读数的动态细胞检测方法，主要用于鉴定特异性拮抗剂，这些拮抗剂可抑制由内源性配体CXC趋化因子配体12（CXCL12）激活CXC趋化因子受体4（CXCR4）所引发的细胞内Ca2+释放。该方法的一个关键优势在于，它还能用于筛选具有内在激动活性的化合物（即，在无CXCL12存在时可诱导细胞内Ca2+浓度升高的化合物），或通过结合变构位点来调节受体功能的化合物（即，正向和负向变构调节剂（PAMs和NAMs））。其局限性在于，具有自发荧光的化合物可能干扰检测信号，从而影响数据的可靠解读。该检测方法很可能只需极少的调整，即可作为通用药物筛选平台，适用于其他多种激活后可引起细胞内Ca2+释放的GPCRs。

引言

G蛋白偶联受体（GPCR）是一类重要的细胞表面蛋白超家族，可在胞外配体结合后激活信号转导级联反应。它们可被多种刺激物激活，包括肽类、蛋白质激素、生物胺和脂质，从而启动多种细胞内信号通路，并最终引发生物学反应1,2。此外，GPCR参与了大多数（如果不是全部）发育和生理过程，许多人类疾病与GPCR信号功能障碍或受体过度表达相关。因此，GPCR是医学领域中最为公认的药物靶点之一1,3。

通常，GPCR药物发现的工作流程始于细胞筛选实验，以鉴定能够调节特定GPCR活性的化合物，例如小分子、单克隆抗体和多肽。在GPCR药物发现中，存在多种不同类型的检测方法用于寻找此类化合物，其中大多数方法适用于中至高通量筛选项目。最常用的检测方法包括受体结合实验、基于荧光或发光检测所谓第二信使（例如，Ca2+、环磷酸腺苷（cAMP））水平变化的检测、表型筛选实验以及β-阻遏蛋白（β-arrestin）招募检测4。选择特定类型的检测方法可能取决于多种因素，但也受到对特定GPCR信号传导特性的已有知识的影响。激动剂与GPCR结合后会诱导构象变化，催化异源三聚体G蛋白α亚基上的鸟苷二磷酸（GDP）与鸟苷三磷酸（GTP）的交换。随后，Gα-GTP亚基从Gβγ亚基上解离，两个亚基均可启动进一步的信号通路。GTP分子水解后，Gα-GDP与Gβγ亚基重新结合，使G蛋白恢复至非活性构象5,6。根据Gα亚基的序列相似性，可将G蛋白分为不同类型（Gs、Gi、Gq、G12/13）7。通过Gα亚基的信号传导可引发多种典型反应，例如通过Gs增加或通过Gi减少环磷酸腺苷（cAMP）的生成，以及通过Gq引起细胞内Ca2+动员5,7。Gβγ亚基也能够激活细胞内效应通路。例如，在Gi偶联的GPCR被激活后，Gβγ可直接刺激磷脂酶C（PLC-β），产生三磷酸肌醇（IP3），从而触发细胞内储存库中Ca2+的释放7。受体激活后，GPCR会被GPCR激酶（GRKs）磷酸化，促进其与β-阻遏蛋白的相互作用。该过程终止G蛋白信号传导，并导致受体脱敏，最终发生内化。β-阻遏蛋白还能够形成多分子复合物，启动独立于G蛋白信号传导的其他信号通路8。

在趋化因子受体亚家族中，与Gi蛋白偶联的CXCR4是一种G蛋白偶联受体（GPCR），因其作为药物研发潜在靶点的重要前景而受到广泛关注。鉴于其在人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）病毒进入和感染过程中作为主要共受体的明确作用，靶向CXCR4的化合物最初被开发为抗HIV药物候选物9。近年来，越来越多的证据表明CXCR4在肿瘤发生及癌症转移中发挥重要作用，使其也成为肿瘤学领域一个经过充分验证的治疗靶点10。CXCR4在二十多种人类癌症中高表达，调控肿瘤细胞的存活、增殖和迁移，以及与肿瘤相关的血管生成10。此前已有多种化学类别的CXCR4拮抗剂被报道11,12，但目前仅小分子AMD3100被批准用于临床，作为治疗淋巴瘤和骨髓瘤患者时的干细胞动员剂13,14。目前正在进行多项临床试验，以评估其他多种CXCR4拮抗剂在不同人类疾病中的安全性和有效性，其中尤以肿瘤学为重点12。鉴于CXCR4拮抗剂具有广泛的潜在应用前景，寻找具有更优药代动力学特性、更高生物利用度或可能更少副作用的新型化合物仍十分必要。

本文描述了一种基于动力学荧光的细胞检测方法，主要用于筛选能够抑制 CXCR4 的化合物。该方法的荧光检测基于细胞内 Ca²⁺ 浓度在配体刺激后发生的瞬时升高。2+ 浓度在CXCR4受体被其内源性激动剂趋化因子配体CXCL12（旧称基质细胞衍生因子1α（SDF1-α））激活时发生变化，以及该CXCL12诱导的Ca2+ 特定化合物引起的反应。在本实验中，使用稳定表达人源CXCR4受体的U87人胶质母细胞瘤细胞。同时，这些细胞不表达内源性的CXCR7，CXCR7是一种相关的趋化因子受体，也能结合CXCL12。15,16,17CXCR7 之前还被证明能够与 CXCR4 形成异源二聚体，从而调控后者的信号传导特性18细胞内钙离子水平的波动2+ 由CXCR4介导的反应通过加载CXCR4进行监测+ 用对细胞具有通透性的高亲和力荧光钙指示剂Fluo-2乙酰甲酯（AM）酯标记细胞2+-结合染料。Fluo-2 AM 是一种单波长荧光分子，可在 490 nm 处激发，其发射荧光在 520 nm 处检测。当 Ca²⁺ 浓度升高时，其发射荧光强度随之增强。2+ 结合，具有较大的钙动态范围2+结合态与非结合态。荧光信号的增加是瞬时的，发生在数分钟的时间范围内，随后逐渐衰减。荧光发射的峰值高度进一步与受体激活水平相关。该检测使用配备增强型CCD（ICCD）相机的荧光酶标仪进行，该相机具有集成的移液系统，可实现检测中移液步骤的标准化（参见 材料表）。此外，所使用的荧光读板仪能够同时测量微孔板中所有孔的荧光信号，这是其另一项关键优势。在实验的第一阶段，待研究的化合物（例如，将一组固定浓度或梯度稀释的小分子化合物加入负载了Fluo-2 AM的CXCR4细胞中+ U87细胞随后进行约10分钟的孵育期，在此期间持续实时测量化合物的潜在激动作用。然后加入内源性激动剂（即，加入CXCL12以诱导由CXCR4介导的细胞内Ca水平 transient 升高2+在此部分实验中，可评估待测化合物的潜在拮抗活性。该实验总体流程的示意图如下所示： 图1.

尽管这种Ca2+ 迁移实验主要被用于鉴定并确定竞争性CXCR4拮抗剂的抑制效力（即，可阻止内源性激动剂结合并激活受体的化合物），它还可鉴定受体激动剂，以及通过结合变构位点而发挥功能的化合物即，这些位点在拓扑上不同于内源性激动剂占据的正构结合位点。后一类化合物的例子包括别构激动剂、正向别构调节剂（PAMs）和负向别构调节剂（NAMs）19,20. 而受体特异性拮抗剂以及负向别构调节剂（NAMs）将抑制CXCL12诱导的Ca2+ 反应，PAMs 将增强此反应（另见 讨论 部分）。尽管本文所述检测方法特异性靶向 CXCR4，但预计该方法经过极少优化后即可应用于其他 GPCR，至少适用于通过释放细胞内 Ca²⁺ 而介导信号传导的 GPCR。2+.

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方案

注意：第1和第2部分所述的所有步骤均须在超净工作台内的无菌条件下进行。

1. U87.CD4.hCXCR4 细胞的维持

  1. 在37 °C、5% CO₂条件下，于T75培养瓶中培养细胞2 在湿润的培养箱中。
    注意： 体外 本方案中使用的细胞系是一种稳定表达分化簇4（CD4）和人源CXCR4的U87胶质母细胞瘤细胞系，此前已有描述17细胞表面 CD4 和 CXCR4 的表达通过流式细胞术持续监测，表达水平随时间保持稳定（约 100% CD4）+ 和约 100% CXCR4+ 细胞）。本方案不涉及所用细胞系的建立及通过流式细胞术检测受体表达水平的详细操作步骤。
    1. 在细胞汇合度达到80-85%时进行传代培养。所有试剂在用于细胞培养前应恢复至室温（RT）。
    2. 从细胞中移除培养过的培养基，用 5 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）将细胞单层洗涤一次。
    3. 加入3 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA，并均匀覆盖于细胞单层表面。随后吸除多余的胰蛋白酶-EDTA，于37 °C孵育最多5分钟，直至细胞开始脱落。
    4. 加入10 mL新鲜的完全培养基（DMEM + 10%胎牛血清（FBS）+ 0.01 M HEPES + 适当的筛选试剂）。轻轻吹打重悬细胞。将细胞悬液转移至无菌的50 mL离心管中。
    5. 使用选择的方法对活细胞数量进行计数。对于U87胶质母细胞瘤细胞，其活力通常可达约100%。
      注意：细胞数量可通过多种方法测定。我们通常使用基于台盼蓝染色的自动细胞分析系统（参见 材料表）根据其标准操作流程进行处理即可，但其他方法也应同样有效。
    6. 加入 2 x 106 或 3 × 106 将（活细胞）重悬于T75培养瓶中，加入新鲜培养基至终体积25 mL，于37 °C、5% CO₂条件下培养2.
      注意：如果 3 x 106 细胞将用于实验，2天后细胞汇合度将达到80-90%。如果2 x 106 若使用其他细胞系，应首先通过实验确定细胞的生长速率，因为不同细胞系在3天后将达到相同的汇合度。

2. 细胞接种用于Ca2+ 迁移实验

  1. 在细胞传代当天（第0天），使用0.1%明胶溶液对带黑色壁、透明底的聚苯乙烯96孔板（见材料表）进行包被，以促进细胞贴壁。
    注意：如果使用 commercially available 的预包被板（见材料表），则可省略明胶包被步骤。建议在继续本实验方案前，针对每种待研究的细胞系评估使用预包被板替代手动包被的效果。
    1. 将1 g明胶加入100 mL PBS中，配制成1%明胶溶液。使用前用PBS稀释10倍。为提高明胶溶解度，可将溶液加热至37 °C。
    2. 使用多通道移液器向96孔板每孔加入100 µL 0.1%明胶溶液，在室温下孵育2 h。
  2. 在此期间，准备将细胞接种至已包被的96孔板。
    1. 从培养瓶中消化并收集细胞，重悬于新鲜培养基中，并使用台盼蓝染色法进行细胞计数。
    2. 将细胞在50 mL离心管中以400 × g离心5 min（室温）。
    3. 用新鲜生长培养基（DMEM + 10% FBS + 1% HEPES，不含抗生素）重悬细胞，调整细胞密度至0.1 × 106 个（活细胞）/mL。
  3. 将带黑色壁、透明底的96孔板倒置，用纸巾吸干明胶溶液，然后每孔加入200 µL PBS以去除残留明胶，再次倒置平板使液体完全排出。
  4. 向明胶包被的96孔板每孔加入200 µL细胞悬液（相当于0.2 × 105 个细胞）（从此处开始，该板将被称为"测量板"）。
  5. 将板置于37 °C、5% CO2条件下过夜培养。

3. 使用荧光 Ca2+ 敏感染料对细胞进行负载

  1. 第1天进行实际的Ca2+动员实验，首先将已接种的细胞加载荧光Ca2+结合染料fluo-2 AM。
    1. 通过将40 mL HEPES（1 M）加入200 mL Hank's平衡盐溶液（HBSS，10倍浓度，不含酚红，不含碳酸氢钠）中制备检测缓冲液。加入超纯水至终体积为2 L，并加入4 g牛血清白蛋白（BSA）。通过磁力搅拌溶解BSA。用NaOH调节pH至7.4，并过滤溶液。
      注意：在后续所有步骤中均使用同一种缓冲液，该缓冲液称为"检测缓冲液"。
    2. 制备荧光Ca2+敏感性染料fluo-2 AM的储存液（4 mM，溶于二甲基亚砜（DMSO）中）。避免长时间暴露于光线下。将1 mg fluo-2 AM（分子量：1,061 g/mol）溶于235.6 µL DMSO中。
    3. 制备fluo-2 AM的工作液。对于一块96孔检测板，取12.5 µL fluo-2 AM储存液（4 mM）与12.5 µL非离子型聚醇表面活性剂（例如，Pluronic F-127）溶液（20% 质量/体积，溶于DMSO中，参见材料表）混合。将22 µL该混合液加入11 mL检测缓冲液中，置于15 mL离心管内。fluo-2 AM的终浓度为4 µM。
      注意：非离子型表面活性剂作为分散剂使用，以提高fluo-2 AM在水中的溶解度，从而增强细胞摄取效果。为使表面活性剂充分溶于DMSO，需将样品在37 °C加热并定期混匀，直至形成均一溶液。
    4. 将96孔检测板中先前接种的细胞的培养基通过翻转培养板的方式去除，并将板倒置在纸巾上吸干残留液体。
    5. 使用多通道移液器向每孔加入100 µL染料加载溶液，在室温避光条件下孵育45分钟。

4. 含趋化因子配体CXCL12或待测化合物的96孔聚丙烯板的制备

  1. 获取圆底聚丙烯（PP）96孔板（参见 材料表).
    1. 将CXCL12储备液（1 mg/mL）和待测化合物的储备液在室温下平衡。
      注意：CXCL12 储存液用添加了 0.01% Tween20 的超纯水配制，并分装成单次使用量，于 -20 °C 保存。
    2. 在检测缓冲液中配制5倍浓度的CXCL12溶液（250 ng/mL，相当于31.25 nM）以及每种化合物的5倍浓度稀释液（用检测缓冲液稀释）。
    3. 根据预定义的孔板布局，将储备液加入相应的96孔板中。在含有CXCL12的孔板中，每孔加入75 µL。 "趋化因子板"），在含有化合物的孔板中每孔加入50 µL（ "复合板").
      注意：两种化合物和CXCL12在分配至检测板后最终均会被稀释5倍。在化合物板和趋化因子板中，均需设置仅含检测缓冲液的阴性对照孔。同时，还需设置阳性对照孔（即，趋化因子孔板中含有CXCL12的孔，而在化合物孔板的对应孔中则含有检测缓冲液）。

5. 荧光酶标仪上的实验方案设置

注意：本实验方案中使用的荧光微孔板读板仪见于材料表。

  1. 首先打开荧光酶标仪的制冷单元，然后开启荧光酶标仪主机。等待数分钟使其启动，随后打开仪器配套软件。
  2. 使用包含以下步骤的拖放式菜单创建检测方案：
    1. 在 "设置" 选择“Read_Mode”，激发波长：470-495 nM；发射波长：515-575 nM。
      注意：所选波长适用于与 Ca2+-敏感性染料 Fluo2。
    2. 包含 "与TF混合" （转移液体）盒用于化合物板中化合物的自动混合，该盒将放置在设备的源2位置（参见步骤6.4）。选择每个孔中15 µL溶液进行自动吸液，并重复混合三次。将移液吸头的高度调节至液面以下20 µL处。设定吸液和 dispensing 速度为50 µL/s。
      注意：移液枪头的高度指的是移液枪头下方残留的液体体积。例如，如果化合物板的孔中含有 50 µL 液体，则 30 µL 的高度对应于液面以下 20 µL 的位置。化合物溶液的取液体积、混匀速度、混匀过程中移液枪头的位置以及混匀循环次数均可通过软件进行调整。
    3. 在 "转移液体" 将化合物板中每个孔的 20 µL 液体转移至检测板中。将移液器吸头置于液面以下 20 µL 处 即，吸液时高度设为30 µL，向检测板中分液时高度设为60 µL。吸液速度设为50 µL/s，分液速度设为25 µL/s。
      注意：化合物板每孔含有 50 µL 溶液（见步骤 4.1.3），因此 30 µL 高度对应液面以下 20 µL 的位置。检测板每孔含有 80 µL 检测缓冲液（见步骤 6.3），因此 60 µL 高度对应移液头类似的位置。
    4. 选择 "使用 TF 进行读取" 按钮。在第一个区间内，设置60次读数（荧光检测），每次读数间隔时间为1秒。设定在向检测板中加入化合物之前记录10次读数，之后记录50次读数。第二个区间设置为读数间隔时间30秒，共18次读数。
      注意：此步骤将对荧光进行动力学测量（按设定的时间间隔），总时长约 10 分钟。
    5. 包含 "洗涤提示" 在方案中点击按钮三次。在每次洗涤步骤中，选择液体类型：液体A（超纯水）或液体B（70%乙醇）、洗涤循环次数（1次）、泵速（快速）以及每次洗涤步骤中的冲程次数（5次）。
      注意：第一次和最后一次洗涤步骤使用液体A，第二次洗涤步骤使用液体B。
    6. 包含 "暂停移液器" 功能。将移液器设置为暂停 300 s。
      注意：在本实验方案中加入此步骤后，荧光酶标仪设备中集成的移液器头将在继续后续步骤前暂停5分钟。
    7. 包含 "与TF混合" 将CXCL12溶液加入趋化因子板中，置于设备的源3位置（见步骤6.4），通过移液盒实现溶液的自动混合。选择每个孔中15 µL溶液，自动吸液并混合三次。吸液和混合过程中，移液吸头应位于液面以下20 µL处。吸液和排液速度设定为50 µL/s。
      注意：与步骤 5.2.2 类似，这些参数可以调整。
    8. 在随后的 "转移液体" 将趋化因子板中每个孔的25 µL液体转移至检测板中，并将吸头置于液面以下20 µL处 即，吸液时高度设为55 µL（趋化因子板每孔含75 µL，见步骤4.1.3），分配液体至检测板时高度设为80 µL。吸液速度设为50 µL/s，分配速度设为25 µL/s。
    9. 包含 "使用 TF 进行读取" 按钮。在第一个区间内，设置读取间隔时间为1秒，共读取145次；定义加样前记录5次读数，加入CXCL12后记录140次读数。第二个区间设置读取间隔时间为6秒，共读取20次。
      注意：在整个实验方案中，共记录 243 次读数（荧光测量值）：步骤 5.2.4 记录 78 次，步骤 5.2.9 记录 165 次。
    10. 与步骤 5.2.5 类似，包含 "洗涤吸头" 在方案中按下按钮三次。
      注意：在实验方案的最后包含此步骤，可使移液器吸头重复用于其他检测，而无需更换吸头。
  3. 将设备温度设置为 37 °C，方法是点击 "设置载物台温度" 按钮并选择 37 °C。

6. 运行荧光检测

  1. 在测量板与上样缓冲液孵育 45 分钟后（见步骤 3.1.5），将板翻转倒掉缓冲液，并在纸巾上干燥。
  2. 每孔加入 150 µL 检测缓冲液洗涤已接种的细胞，孵育 2 分钟。
  3. 再次将板翻转倒掉缓冲液，使用多通道移液器每孔加入 80 µL 检测缓冲液。
  4. 将所有板放入设备的相应位置：化合物板置于源 2 位置，趋化因子板置于源 3 位置，测量板置于读数位置。在源 1 吸头位置放置一盒黑色吸头。关闭设备门，孵育 5 分钟后再继续后续操作。
  5. 点击 "Protocol signal test" 按钮，以测定板上的背景相对光单位（RLUs）和荧光变异情况。此时将弹出一个新窗口，选择 "Test signal"。
    注意：在此步骤中，背景 RLUs 由集成在荧光读板仪光学部件中的 ICCD 相机测定。这些 RLUs 是由发光二极管（LEDs）（LED 输出波长 470–495 nm）激发 Ca2+ 敏感染料（fluo-2）所产生的。8,000–10,000 RLUs 的数值适用于本实验。如有必要，可通过调整激发强度（选择 Exc. Intensity）或相机门控时间（选择 Gate Open）来调节 RLUs。板内变异应理想地低于 7.5%。
  6. 若获得 8,000–10,000 RLUs 的背景值，则点击 "Update"。点击保存按钮以保存主程序。
    注意：执行此操作后，协议信号测试中的设置将被继承至主程序中。
  7. 点击 "RUN" 按钮运行检测。

7. 数据分析与质量

  1. 实验结束后，在系统软件中打开"分析"窗口。
    1. 进入"配置校正"，选择"相对于基线的响应"。将基线1定义为从第1次测量开始，至第5次测量结束；每孔中第1至第5次测量之间的平均荧光值将被计算。
      注：后续来自同一孔的所有测量值均将除以该孔特定的基线1。
      1. 将基线2定义为从第78次测量开始，至第83次测量结束（CXCL12在第83次测量后加入）；同样计算每孔中第78至第83次测量之间的平均荧光值，并将此校正因子应用于第83次测量之后的所有测量值。
    2. 勾选"以百分比显示"和"减去背景"复选框。
    3. 进入"配置动力学简化"。为评估化合物对CXCL12诱导的Ca2+反应的抑制作用，选择从第84次测量（即加入CXCL12后的第一次测量）至第243次测量（即最后一次测量）之间的最大值减最小值（Max-Min）。
      注：选择Max-Min后，将报告第84至第243次测量之间相对于基线的最大响应与最小响应之差。若Max-Min的起始点选择在第11至第78次测量之间，则报告相对于基线1的最大与最小响应之差。该数值可用于分析化合物的潜在激动活性，参见讨论部分。
    4. 数据将在系统软件中可视化。如有需要，可导出原始数据，以便在其他常用分析软件中进行进一步分析和可视化。

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结果

CXCL12 刺激对细胞内 Ca²⁺ 水平的影响2+ U87.CD4.CXCR4 中的动员+ 以及U87.CD4细胞通过Ca进行评估2+ 迁移实验。而不是 20 µL 在方案的第一步移液操作中通常要加入的待测化合物图1），将检测缓冲液加入负载了fluo-2 AM的U87.CD4.CXCR4细胞中+ 测量板中的细胞。在第二次加样步骤中，向测量板中加入不同浓度的CXCL12（终浓度为0.2–102.4 nM）。荧光信号呈剂量依赖性增强，与Ca释放的剂量依赖性增加相关2+，已展示（图2A）。此处，阴性对照样品代表在两次加样中仅向检测板加入测定缓冲液的孔即，0 nM CXCL12），导致无反应（图 2A）。CXCL12 浓度越高，诱导产生的荧光水平也越高，但荧光信号随时间逐渐衰...

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讨论

Ca2+-本文所述的趋化实验此前已被证明是识别和表征靶向CXCR4受体拮抗剂的有效工具17然而，预计该方法可更广泛地应用于大量其他可触发胞质 Ca2+ 激活后释放，如相关趋化因子受体 CCR5 所示。尽管在 CCR5 的情况下可应用完全相同的实验条件，但本方案中的多个步骤（例如，铺板时的细胞数量、细胞加载荧光染料的条件等参数在将该检测方法应用于其他G蛋白偶联受体（GPCR）之前，均需重新优化，以获得理想的信噪比。此处另一个重要问题是选择合适的 体外 允许目标G蛋白偶联受体高水平表达并实现与Ca功能偶联的细胞宿主2+ 通路。对于CXCR4，选择人胶质母细胞瘤U87细胞的原因如下：（1）该细胞不表达内源性CXCR7（一种与CXCR4共用相同激动剂的相关趋化因子受体）；（2）它们能够将CXCR4的激活与Ca2+信号通路，(3) 细胞负载Ca²⁺指示剂后获得的荧光响应具有良好的动态范围2+-敏感染料，以及（4）它们对检测板的良好黏附性，可在整个实验过程中...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者谨此感谢 Eric Fonteyn 和 Geert Schoofs 提供出色的技术支持。本工作得到了鲁汶大学（KU Leuven，资助号：PF/10/018）、比利时弗拉芒科学基金会（Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek，FWO，资助号：G.485.08）以及杜尔梅尔基金会（Fondation Dormeur Vaduz）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Fluo-2 AMAbcamab142775荧光性 Ca²⁺ 敏感性染料
Pluronic F-127SigmaP2443-250G泊洛沙酸
明胶SigmaG9391
AMD3100SigmaA5602-5 mg特异性 CXCR4 拮抗剂
马拉维若AnorMed 慷慨赠予抗逆转录病毒药物，CCR5 拮抗剂
趋化因子配体 CXCL12PeproTech300-28A
趋化因子配体 CCL5PeproTech300-06
胎牛血清（FBS）Gibco (Life Technologies)10270-106
牛血清白蛋白（BSA）SigmaA1933-25G
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）Gibco (Life Technologies)41965-039
HBSS（10 倍浓度），含钙、含镁，不含酚红Gibco (Life Technologies)14065-049
HEPES（1 M）Gibco (Life Technologies)15630-056
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红Gibco (Life Technologies)25200-056
杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）Gibco (Life Technologies)14190-094
Falcon 管，50 mLGreiner Bio-One227 261
组织培养瓶（T75）Corning353024
黑色 96 孔板，透明平底，带盖Costar/Fisher Scientific10530753用于细胞接种的检测板（96 孔）
聚丙烯（PP）板Thermo Scientific (VWR)732-2661用于制备化合物板和趋化因子板的圆底板
FLIPR Tetra 高通量细胞筛选系统Molecular Devices集成移液头和 ICCD 相机的荧光酶标仪
FLIPR Tetra LED 模块 470 - 495 nmMolecular Devices0200-6128用于激发荧光性 Ca²⁺ 敏感性染料的发光二极管
FLIPR Tetra 发射滤光片 515 - 575 nmMolecular Devices0200-6203与荧光染料兼容的发射滤光片
FLIPR Tetra 96 孔头Molecular Devices0310-4536集成于荧光酶标仪内的 96 孔移液头
ScreenWorksMolecular Devices用于 FLIPR Tetra 数据分析与可视化的软件包
Vi-CELLBeckman Coulter细胞活力分析仪
Corning CellBIND 96 孔平底透明黑色聚苯乙烯微孔板，带盖，无菌Corning3340预包被的 96 孔检测板，可作为检测板手动包被的替代方案。

参考文献

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