本文介绍了一种无需饲养层细胞的分化系统，用于大规模制备基因沉默的小鼠自然杀伤细胞，以进行机制研究 体外 和 体内.
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本文内容
摘要
摘要
自然杀伤（NK）细胞属于先天免疫系统，是抗肿瘤免疫防御的第一道防线；然而，它们在肿瘤微环境中受到抑制，其潜在机制在很大程度上仍不清楚。由于缺乏稳定且可靠的NK细胞来源，限制了NK细胞免疫研究的进展。本文报道了一种 体外 可在无饲养层条件下提供高质量和高数量的骨髓来源小鼠NK细胞的系统。更重要的是，我们还证明，利用该系统可通过siRNA介导的基因沉默有效抑制E4bp4依赖性的NK细胞成熟。因此，这一新型 体外 NK细胞分化系统是一种用于免疫学研究的生物材料解决方案。
引言
癌症的进展在很大程度上依赖于肿瘤微环境1,2，包括宿主来源的免疫细胞， 例如，自然杀伤细胞。多项研究表明，肿瘤内自然杀伤细胞与肿瘤进展呈负相关3,4此外，临床研究表明，自然杀伤细胞过继治疗是一种可能的癌症治疗策略5,6,7,8,9基于NK细胞的癌症免疫治疗最近被提出作为实体瘤的一种治疗选择，但由于实体瘤微环境中存在免疫抑制性细胞因子的分泌以及活化配体的下调，仍面临诸多挑战。10,11转化生长因子-β（TGF-β）被认为在致癌过程中发挥抑制作用，但具有悖论性的是，癌细胞也会产生TGF-β1以促进肿瘤的发展12,13,14,15TGF-β 信号通路可通过下调干扰素应答及 CD16 介导的干扰素-γ（IFN-γ）产生，抑制自然杀伤细胞（NK 细胞）的细胞溶解活性 体外16,17,18.
尽管破坏肿瘤微环境中的TGF-β信号通路可能是消除癌症的一种潜在方法，但由于TGF-β具有抗炎功能，完全阻断其信号通路将导致自身免疫性疾病。这一点已在小鼠模型中得到证实，这些模型出现了包括全身性炎症、心血管缺陷和自身免疫在内的不良副作用19。因此，深入理解TGF-β介导的免疫抑制作用机制，将有助于发现可用于癌症治疗的可及性治疗靶点。
为了阐明自然杀伤细胞发育所必需的分子事件，Williams 等 建立了一个 体外 小鼠骨髓造血干细胞向自然杀伤细胞分化的体系20该系统极大地促进了自然杀伤细胞发育机制的研究，包括鉴定自然杀伤细胞的新型前体细胞21然而，骨髓前体细胞应在含有支持性OP9基质细胞作为饲养层的体系中进行培养20,21，而这种异质性细胞群体在很大程度上限制了基因破坏工具的进一步应用（例如，siRNA介导的基因沉默）特异性应用于正在分化的NK细胞。
在此，我们描述了一种经过进一步改良的无饲养层培养系统 体外 Williams 系统 等20在我们的系统中，无需使用OP9基质饲养细胞，而是采用OP9条件培养基，且不影响NK细胞的分化。 体外，并且这一发现最近使我们揭示了TGF-β能够通过抑制肿瘤微环境中E4bp4依赖性的NK细胞发育来促进癌症进展22该新型系统成功提供了一种无背景干扰的方法，用于阐明自然杀伤细胞在特定条件下发育的分子机制（例如，高浓度TGF-β1，siRNA介导的基因沉默 等等.) 体外.
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方案
获取和分化骨髓来源的自然杀伤细胞（BM-NK）的方案基于先前发表的方法20,21,22。所有涉及小鼠的操作均已经过香港中文大学动物伦理实验委员会（AEEC）批准。
1. OP9 条件培养基的制备
- 在含有20% FBS、100 U/mL青霉素G和100 µg/mL链霉素的α-MEM培养基中，于37 °C、空气/CO2（95%:5%）的湿化气氛中培养小鼠基质细胞系OP9。
- 用血细胞计数板计数细胞，然后将2 × 106个OP9细胞接种至每个75 cm2的培养瓶中，每瓶加入15 mL培养基，培养48小时。
- 当细胞培养至约80%融合时，用10 mL PBS洗涤培养瓶，并向每瓶中加入20 mL普通α-MEM培养基（不含FBS和抗生素）。
- 在培养24小时后从培养瓶中收集OP9条件培养基，用0.25 µm聚醚砜（PES）滤膜去除细胞碎片，并于4 °C保存（两周内使用）。
2. 小鼠骨髓细胞的分离
- 通过腹腔注射过量戊巴比妥钠（100 mg/kg）处死一只12周龄的C57BL/6J小鼠。确认无呼吸后，使用手术刀在骨连接处切开，取出股骨，并用刀片轻轻刮除残留的肌肉组织。
- 将骨骼放入含有预冷无菌α-MEM的50 mL离心管中，随后在生物安全柜中进行以下操作。
- 弃去α-MEM培养基，用70%乙醇冲洗骨骼30秒。
- 用冰浴的无菌PBS洗涤骨骼两次，以清除残留的乙醇。
- 将骨骼转移至含有5 mL冰浴PBS的研钵中，用研杵轻轻捣碎骨骼（切勿研磨成粉末）。
- 轻轻旋转研杵搅动骨骼，使骨髓细胞释放到PBS中。将含有骨髓细胞的PBS收集至新的50 mL离心管中。
- 重复步骤2.6共四次，直至骨碎片呈现均匀的白色。
- 在4 °C条件下以465 × g离心5分钟，弃去上清液。
- 用18 mL无菌蒸馏水重悬沉淀，静置30秒以裂解红细胞。
- 加入2 mL冰浴的10倍浓度PBS以终止反应，然后将混合物通过70 µm细胞筛网过滤，去除裂解的红细胞。
- 在4 °C条件下以465 × g离心5分钟，用20 mL冰浴PBS重悬沉淀。
- 重复步骤2.11进行第二次洗涤。
- 将细胞沉淀转移至100 mm无菌培养皿中，加入10 mL来自步骤1.2的OP9条件培养基，该培养基补充有20% FBS以及含0.5 ng/mL小鼠IL-7、30 ng/mL小鼠SCF和100 U/mL小鼠flt3L的混合物。
- 将培养皿置于37 °C、5% CO2条件下孵育2小时。将未贴壁的细胞以5 × 105个活细胞/mL的密度（使用血细胞计数板结合台盼蓝排斥法计数）转移至新的培养容器中，使用与步骤2.13相同的培养基配方，并在37 °C、5% CO2条件下继续孵育。
- 第4天，更换培养条件为补充有20% FBS和2,000 U/mL小鼠IL-2的OP9条件培养基。
- 每3天更换一次培养基；成熟NK细胞可在第7天获得，并按第4节所述进行鉴定。
3. siRNA 介导的自然杀伤细胞分化过程中的基因沉默
- 根据产品说明书，将siRNA或无关对照（NC）与转染试剂预先混合。
- 在第0天之后的任意时间点执行步骤3.1。
- 将50 nM的siRNA或NC混合物加入步骤2.14的细胞中。
- 每次更换培养基时重复步骤 3.1（例如第0、4和7天，直至实验终点。
4. 使用流式细胞术分析自然杀伤细胞分化
- 在适当时间点，收集正在分化的细胞悬液，并用预冷的 PBS 洗涤。
- 根据产品说明书，使用细胞固定缓冲液固定细胞。
- 用预冷的 PBS 洗涤固定后的细胞，然后将 1 × 106 个细胞重悬于 100 µL 流式细胞术染色缓冲液中，其中加入 Cy3 标记的抗小鼠 NKp46 抗体和 PE 标记的抗小鼠 CD244 抗体，稀释比例为 1:100。
- 室温避光孵育 2 小时。
- 将染色后的样本用 300 µL PBS 重悬，随后获取 FACS 数据，并使用 Cytobank 平台20（http://cytobank.org/）进行分析。
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结果
按照所述方案获得的代表性结果如下。总骨髓悬浮细胞在无饲养层分化系统中培养11天；与第0天的总细胞数相比，第7天时增殖率显著增加（图1A）。在培养体系中，第6天即可观察到具有高核质比和富含颗粒的细胞质形态的成熟NK细胞（图1B）。
为了阐明 TGF-β1/Smad3 信号通路在 NK 细胞分化中的调控作用，在无饲养细胞体系中，于第 0 天和第 4 天使用针对 E4bp4 mRNA 的 siRNA（siE4bp4，可有效抑制 E4bp4 mRNA 水平，如图 2所示）或无关对照序列转染骨髓细胞。分化中的细胞在含有或不含 Smad3 抑制剂 SIS3 的体系中培养 6 天。流式分析结果显示，与转染阴性对照（NC）组...
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讨论
在本研究中，我们描述了一种制备骨髓来源的小鼠NK细胞的新方法 体外原始系统中的饲养细胞21,22 可被OP9细胞的条件培养基成功替代，这在很大程度上提高了分化系统的稳定性。此外，该系统能够产生大量且高纯度的成熟NK细胞，用于 体外 以及 体内 可促进NK细胞在人类疾病中机制研究及转化研究的检测方法。
所述方法已用于研究TGF-β1信号通路在癌症发展过程中对自然杀伤细胞抑制作用的调控功能23由于不存在饲养细胞的影响，siRNA介导的基因敲低以及抑制剂介导的抑制效率均显著提高。在缺乏OP9饲养细胞的条件下，我们能够通过敲低或抑制靶基因，清晰地揭示Smad3在E4BP4介导的自然杀伤细胞发育过程中的生物学功能。 体外23.
更重要的是，该系统可进一步用...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由香港研究资助局（GRF 468513、CUHK3/CRF/12R）、香港创新及科技基金（ITS/227/15、ITS InP/164/16、ITS-InP/242/16）、香港中文大学直接资助研究金（2016.035）以及香港学者计划资助。
H.-Y.L. 设计并监督了所有实验，并参与了手稿的撰写。P.M.-K.T. 进行了实验，分析了数据，并参与了手稿的撰写。P.C.-T. T.、J.Y.-F.C.、J.S.-C.、H.、Q.-M.W. 和 G.-Y.L. 收集了动物样本并参与了动物实验。J.S.、X.-R.H. 和 K.-F.T. 参与了手稿的撰写。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| OP9 细胞系 | ATCC | ATCC® CRL-2749™ | |
| MEM α，不含核苷酸 | 吉布科（Gibco） | 22561021 | |
| 胎牛血清 | 吉布科（Gibco） | 10500064 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4 | 吉布科（Gibco） | 10010049 | |
| 重组小鼠 IL-7 | PEPROTECH | 217-17 | |
| 重组小鼠 SCF | PEPROTECH | 250-03 | |
| 重组小鼠 Flt3 配体 | PEPROTECH | 250-31L | |
| 重组小鼠 IL-2 | PEPROTECH | 212-12 | |
| Lipofectamin RNAiMAX 转染试剂 | 英韦创（Invitrogen） | 1377815 | |
| IC 固定缓冲液 | eBioscience | 00-8222-49 | |
| 流式细胞术染色缓冲液 | eBioscience | 00-4222-26 | |
| PE 标记的抗小鼠 CD244 抗体 | eBioscience | 12-2441-83 | |
| Cy3 标记的抗小鼠 NKp46 抗体 | Bioss | bs-2417R-cy3 | |
| 无关对照（NC） | Ribobio | siN05815122147 | |
| 靶向小鼠 E4BP4 mRNA 的 siRNA | Ribobio | N/A | 5′-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3′ |
参考文献
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