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大鼠阴茎海绵体神经刺激及海绵体内压记录

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DOI：

10.3791/56807

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2018年4月23日

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1Biomedical Laboratory and the Research Unit of Urology, Department of Clinical Research, University of Southern Denmark, 2Department of Surgery, University of Vermont, 3Research Unit of Urology, Department of Clinical Research, University of Southern Denmark, 4Department of Urology, Odense University Hospital

本文内容

摘要

本研究介绍了一种简化的手术方法和技术，通过使用硅胶粘合剂分离神经-电极复合体并进行阴茎海绵体内压力测量，以实现海绵体神经刺激。

摘要

阴部海绵体神经（CN）的刺激及海绵体内压（ICP）的测量已被广泛用于阴茎勃起功能障碍治疗策略的测试与评估。然而，不同实验室所采用的方法存在差异，且仍存在一些技术缺陷。本研究旨在描述一种可提供可靠且可重复性模型的手术技术。通过暴露坐骨结节处的坐骨海绵体肌止点，可在最大程度减少对参与勃起功能结构的解剖损伤的前提下，实现对阴茎脚的插管。采用直径125 µm的双极银电极并结合生物相容性硅胶对电极-神经复合体进行隔离，可实现对CN的重复刺激，且无需反复抬起或干燥神经。该方法通过减少神经的牵拉与干燥，避免了神经暂时性功能障碍，同时实现了神经的完全隔离，有效防止电流泄漏并避免对其他通路的刺激。

引言

对实验动物阴茎勃起功能的体内研究始于1863年，由Eckhard开创性的实验工作启动1。当时通过电刺激盆腔神经以诱导犬类体内阴茎海绵体内压（ICP）升高。在整个20世纪，类似的实验方案被应用于狗、猴、猫和兔等较大的动物。1989年，Quinlan 等首次建立了在大鼠中评估勃起功能的方法2。此后，多个研究团队对该方法进行了改进和优化34。如今，大鼠已成为研究勃起功能障碍病理机制及评估新兴治疗手段最广泛使用的动物模型。该实验的主要步骤包括：通过颈动脉插管记录全身血压，对阴茎脚进行插管以测量阴茎海绵体内压（ICP），以及刺激阴茎海绵体神经（CN）以诱导ICP升高。尽管已有多个研究者对该模型进行了精细化改进，但其可重复性仍存在问题，不同实验室报告的结果存在差异。目前仍存在若干技术难点。

往期文章5,6,7,8,9,10 描述采用完全暴露阴茎并脱套阴茎皮肤以进行阴茎海绵体插管的方法。该方法并非理想选择，因为操作和破坏性解剖会损伤对勃起功能至关重要的结构。阴茎海绵体的解剖分离已有详尽描述。10,11，但由于多种可能影响实验结果的因素，神经刺激效果并不理想。颅神经（CN）刺激技术包括用置于神经周围的双极钩状电极牵拉神经，将其从周围组织中提起，并在每次刺激前将神经干燥。该操作可能导致不同程度的神经损伤以及电流泄漏，从而引起反应减弱，或通过激活其他通路导致颅内压（ICP）出现假性升高 例如盆底肌、膀胱和胃肠道12所有这些因素均会限制可重复性。

在我们的研究中观察到，麻醉的深度和类型对颅内压（ICP）具有显著影响。所使用的麻醉剂包括戊巴比妥钠、氯胺酮/赛拉嗪或氯胺酮/咪达唑仑注射剂，或异氟烷/氧气吸入剂。

本文介绍了一种简化的手术方法，并提供了支持实验方案标准化的数据。

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方案

动物饲养于南丹麦大学动物护理中心，遵循机构制定的指导原则。所有动物实验均按照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》进行。本实验为急性非存活性手术操作。 

1. 手术所需导管、电极及器械的准备

  1. 使用以下显微外科器械：手术剪、弯头显微剪、组织镊、Dumont #7 和 #5 弯曲显微镊、显微持针器以及牵开器。
    注意： 由于这是急性实验操作，器械无需灭菌。使用后用 70% 乙醇清洁并擦拭尖端。
  2. 将导管浸泡在 70% 乙醇中，然后在使用前用含 100 U/mL 肝素的无菌 0.9% NaCl 冲洗。保持导管充满液体，以避免向系统中引入气泡。
  3. 截取一段 20–30 cm 长的聚乙烯（PE）-50 导管，用于制作颅内压（ICP）测量用导管。应确保导管尽可能短，以减少压力信号的衰减。
  4. 将一支无菌 24G 针头左右反复弯折，直至其中部断裂。将带有斜面的一端连接至 PE 导管远端，用于插入阴茎脚；将另一段插入针座，用于连接压力传感器。用肝素化生理盐水（100 U/mL）充满整个系统。
  5. 制作双极聚四氟乙烯（Teflon）涂层电极时，将两根 125 µm 的银丝剪成等长。用胶带将银丝固定在桌边并使其并列排列，随后将电极固定在黑色板上。
  6. 在聚四氟乙烯涂层上做一小切口，使用 #5 显微镊剥离电极尖端 4–5 mm 长的涂层。用手术刀修剪尖端以确保长度一致，并通过在手术刀片钝缘上弯曲末端形成钩状结构。
  7. 将电极用胶带固定在黑色板上，使其末端略微伸出板缘，且钩端朝上。在塑料板上混合硅胶约 10 秒，然后在距钩部 1–2 mm 处包裹一个胶泡。
  8. 静置干燥约 5 分钟后即可使用（图 1）。在另一端较长的一段上剥离聚四氟乙烯涂层，以便连接刺激器。
    注意： 通过重新制作远端的钩部，该电极可多次重复使用。

2. 动物准备

  1. 麻醉动物后，剃除腹部下半部、颈部和会阴部的毛发。用70%酒精擦拭动物，再用聚维酮碘溶液擦拭，重复三次。将大鼠仰卧位放置在加热的手术垫上。涂抹兽用眼膏，并将麻醉方式切换为使用鼻罩吸入2.5%异氟烷和0.8 L/min氧气作为载气。
    注意：调整异氟烷和氧气的浓度，以达到合适的麻醉深度。

3. 术前准备

  1. 整个手术过程均需在手术显微镜下进行：3.15X 至 20X 的放大倍数已足够。手术过程中应佩戴手套，并始终保持无菌环境。将大鼠置于手术巾上。

4. 用于ICP测量的坐骨海绵体肌解剖

  1. 使用解剖刀、直剪刀和Dumont #7弯头显微镊，在阴茎基底部水平处开始，沿中线外侧5 mm处向下做一条长1 cm的垂直皮肤切口（图2A）。用棉签小心分离阴囊外侧的筋膜（图2B）。解剖筋膜后，安装牵开器，并用棉签触诊以定位坐骨结节（图2C）。
  2. 从此点向内侧解剖脂肪组织，直至观察到坐骨海绵体肌（图3A）。使用一对Dumont #7弯头显微镊纵向分离该肌肉。白膜将呈现为亮白色的结构（图3B）。利用显微镊和显微剪充分暴露白膜，以清晰观察其走行（图3C）。
  3. 在完成系统参数校准后，将导管经会阴部皮肤插入，确保其与阴茎脚平行（图4）。保持导管原位，并用生理盐水保持切口湿润。

5. 刺激用CN解剖

  1. 首先使用手术刀，然后使用直剪刀和显微镊子，沿腹中线在皮肤上做一个2 cm的下腹部正中切口。沿腹白线及下方肌肉组织做相应的切口，以暴露膀胱和前列腺。
  2. 使用牵开器以获得良好的术野暴露。用棉签将前列腺与周围脂肪组织分离，清晰显露位于前列腺背外侧的主要盆腔神经节（MPG）和阴部神经（CN）（图5）。
  3. 在显微镜下确认MPG和CN后，使用斜面显微剪刀在MPG远端2–5 mm处切开覆盖神经的筋膜（图6a）。使用#5显微镊子向神经两侧及下方分离组织，游离出约4 mm长的一段神经（图6b），并将一根9-0缝线从神经下方穿过（图6c）。
  4. 借助缝线轻轻抬起神经（图7a），以便将双极电极的钩子放置于神经周围（图7b）。让助手用胰岛素针头尖端混合双组分硅胶胶水，持续5秒。将神经干燥后，将胶水涂抹于电极钩周围及神经表面（图7c，d）。轻轻牵拉电极，保持神经抬高状态约1分钟，使胶水充分固化。
  5. 移除所有牵开器，仅保留右侧牵开器，以避免电极受到牵拉或扭转。用生理盐水润湿暴露的器官，并在切口处覆盖浸有生理盐水的纱布。

6. 用于 ICP 测量的海绵体插管

  1. 使用拉钩恢复白膜的可视化。注意不要将拉钩固定在坐骨海绵体肌上，以免造成阴茎脚变形。
  2. 连接针头，并在插入白膜前用肝素化生理盐水冲洗管路。用非优势手持Dumont #7弯头显微镊子，将白膜及其插入点远端的覆盖肌肉拉紧；用优势手持直头显微镊子夹住针头，确保针头平行于海绵体走行方向插入白膜（图8）。
  3. 将针头推入海绵体5–8 mm。冲洗管路，并按压阴茎脚以测试管路通畅性（图9），确认无渗漏。用胶带将管路固定于实验台，防止意外牵拉。移除拉钩。

7. 刺激 CN

  1. 使用记录程序（例如，Spike 2）运行期间，持续记录阴茎海绵体内压和平均动脉压。
  2. 在刺激器上设置以下参数（例如，SD9 草类仪器，参见 材料表用于前庭神经（CN）刺激的参数：电流1.5 mA，频率16 Hz，电压3 V，脉宽5 ms。每次刺激持续50秒，两次刺激之间至少休息1分钟。
    注意： 首次刺激通常会导致反应减弱（图10).

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结果

采用本方案并按照推荐的刺激参数，在吸入式异氟烷麻醉（2.0%异氟烷，氧气流速0.8 L/min）条件下操作，应获得如图11和图12所示的结果，其中在75–80 mm Hg范围内出现多个连续的刺激反应。图13显示在持续20分钟的刺激过程中反应稳定，压力维持在73–77 mm Hg。通过冲洗导管并对阴茎脚轻敲（图9）来检测颅内压（ICP）测量导管的通畅性，快速恢复至基线水平是导管位置良好的标志。若白膜结构完整性受损，则冲洗和轻敲后的测试将表现为峰值压力降低、返回基线的速度变慢，且在刺激时反应减弱（图14）。此外，在冲洗时会出现肝素化NaCl溶液渗漏，刺激过程中亦可能发生出血。

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讨论

本研究的主要目的是描述一种简化的阴茎脚插管手术技术，用于记录阴茎海绵体内压（ICP）以及分离阴部神经（CN）以进行电刺激。我们对海绵体的解剖方法进行了改良，以简化手术操作，并在刺激阴部神经时获得可重复的阴茎海绵体内压升高记录。通过在阴茎基底部外侧作1 cm的垂直皮肤切口，并以可触及的坐骨结节作为定位指引，能够良好暴露坐骨海绵体肌和白膜。该手术操作比文献中报道的方法更快速（耗时少于15分钟），且对组织的损伤最小2,3,4。

目前使用的面神经（CN）刺激技术包括在每次电刺激前钩住、提起并干燥面神经10。该技术无法保证每次刺激的条件保持一致。此外，提起神经需要使用显微操作器，并反复牵拉和释放神经，可能导致神经失用性损伤。与当前的面神经刺激技术相比，使用生物相容性硅胶隔离神经-电极复合体可将神经牵拉次数减少至两次：第一次是在神经周围放置双极电极时，第二次是使...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
阿德森镊子Fine Science Tool11006-12
杜蒙特 #7 镊子Fine Science Tool11271-30
杜蒙特 #5 镊子Fine Science Tool11273-20
ToughCut Mayo 剪刀Fine Science Tool14110-15
微型 Vannas 弹簧剪刀Fine Science Tool15006-09
超细止血钳Fine Science Tool13020-12
克里尔止血钳Fine Science Tool13004-14
Kwik-Sil 粘合剂World Precision InstrumentsKWIK-SIL
特氟龙涂层银丝 0.125 mmWorld Precision InstrumentsAGT0510
弹性导线牵开器定制
手术刀片Fine Science Tool10023-00
PE-50 管Warner Instruments64-0753
23 G 针头Kruuse121272
SD-9 方波脉冲刺激器Somatco1077/183
血压换能器及电缆World Precision InstrumentsBLPR2
Raucotupf 棉签Lohmann-Raucher11966
Pro-ophta 眼科棉棒Lohmann-Raucher16515
0.9% 氯化钠溶液 100 mL本地药房
肝素本地药房
25 mL 注射器欧登塞大学医院
兽用眼膏 - Viscotears本地药房
银丝 Science Products GmbH, Heidelberg, Germany
硅胶粘合剂 Kwik-Sil, World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA

参考文献

  1. Eckhard, C. Untersuchungen über die Erektion des Hundes In: Beiträge zur Anatomie und Physiologie. , Vol. Band III Giessen: Ferber 123-166 (1863).
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  3. Heaton, J. P., Varrin, S. J., Morales, A. The characterization of a bio-assay of erectile function in a rat model. J Urol. 145 (5), 1099-1102 (1991).
  4. Martinez-Pineiro, L., et al. Rat model for the study of penile erection: pharmacologic and electrical-stimulation parameters. Eur Urol. 25 (1), 62-70 (1994).
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