利用三色单分子FRET研究蛋白质相互作用的相关性

摘要

本文介绍了一种获取三色单分子FRET数据并利用三维系综隐马尔可夫模型进行分析的实验方案。通过该方法，科研人员可以从复杂的蛋白质系统中提取动力学信息，包括协同效应或相关联的相互作用。

摘要

单分子荧光共振能量转移（smFRET）已成为研究生物分子动态变化的一种广泛应用的生物物理技术。在细胞中，许多分子机器需要蛋白质与其相互作用伙伴在功能循环中协同作用 才能完成其功能。将双色smFRET扩展至多色smFRET，使得能够同时检测多个相互作用或构象变化。这不仅为smFRET实验增加了新的维度，而且在使用固定样品和全内反射荧光显微镜（TIRFM）时，还提供了直接研究事件发生顺序以及检测相关相互作用的独特可能性。因此，多色smFRET是一种功能强大的工具，可用于以定量方式并以前所未有的细节水平研究生物分子复合物。

本文展示了如何克服蛋白质多色单分子FRET实验中的特殊挑战。我们提供了获取数据并提取动力学信息的详细方案，包括轨迹选择标准、状态分离，以及利用三维系综隐马尔可夫模型（HMM）从噪声数据中恢复状态轨迹的方法。与其他方法相比，动力学信息并非来自停留时间直方图，而是直接从HMM中提取。最大似然框架使我们能够对动力学模型进行严格评估，并为速率提供有意义的不确定性分析。

通过将我们的方法应用于热休克蛋白90（Hsp90），我们能够解析其核苷酸结合过程与蛋白质整体构象变化之间的关系。这使我们能够直接观察Hsp90二聚体中两个核苷酸结合位点之间的协同性。

引言

许多蛋白质通过在多种时间尺度上的构象变化和瞬时相互作用，与其他分子形成动态复合物，从而实现其功能^1,2,3。当与外部能量源（例如，ATP）偶联时，这些动态相互作用可赋予功能循环以方向性，并最终维持细胞内的非平衡稳态，这是生命存在的前提。

为了充分理解这些分子机器，仅依靠结构研究提供的静态描述是不够的。此外，必须了解其背后的动力学模型，并确定动力学速率常数。目前已有多种方法可使研究人员研究两种目标分子之间二元相互作用的动力学过程。 例如， 表面等离子共振，具有光谱读出的弛豫方法（例如， 跳跃或停流技术）以及核磁共振。然而，在大多数情况下，这些方法仅适用于简单的两态系统（例如， 一种结合态和一种未结合态）由于体相实验固有的平均效应所致。当涉及更多状态或中间态时，这些方法仅能提供一系列复杂的速率常数混合信息。单分子方法，如光镊、磁镊或双色单分子荧光共振能量转移（two-color smFRET）， 即， 一个供体和一个受体荧光团，结合表面固定的样品，可恢复所有观察到的构象变化的速率常数。然而，当涉及影响多个结合位点的相互作用时，这些方法仍然存在局限性，对于两个（或多个）相互作用之间可能存在的相关性信息，只能通过一系列实验的间接推论获得。

多色单分子FRET^4,5,6,7,8,9 提供了在接近生理条件下实时直接研究这些组分之间相互作用的机会¹⁰。这使得研究人员能够探究例如配体或其他蛋白质的构象依赖性结合过程^8,9,11。本文所介绍的整体方法是在目标蛋白的特定位点进行标记，将其中一种蛋白固定在测量腔室的表面，并在棱镜型全内反射荧光显微镜（TIRFM）上随时间追踪荧光强度（具体细节见^9,12）。随后可通过染料之间的能量转移来确定不同荧光染料之间的空间接近程度。不同蛋白的标记策略可能有所不同（详见文献¹³），并且已有避免单分子FRET测量中产生伪影的指导原则¹⁴。

在多色单分子FRET实验中，由于供体染料可能将能量转移至不同的受体染料，仅通过激发单一染料无法获得所有染料之间的相对位置^15,16。然而，结合交替激光激发（ALEX¹⁷，详见¹⁸）技术，该方法可在亚秒级和亚纳米级分辨率下提供完整的时空信息。

原则上，通过在多色ALEX单分子FRET实验中结合所有荧光强度计算出的染料间距离，可以获得高分辨率的结构信息。然而，本文的重点是多色smFRET在状态识别与分离以及动力学模型提取方面的不可替代作用。当仅需通过三角定位法确定结构时，可进行一系列信噪比较高的简单双色单分子FRET实验^12,19。

我们使用部分荧光（）作为两种荧光团之间能量转移的替代指标⁷。PF 通过荧光强度计算，类似于双色实验中的 FRET 效率：

其中， 是发射通道中的强度 em 激发后 ex，以及 c 是波长最长的受体。检测通道代表样品室中的相同位置，但记录荧光光的不同光谱范围。本方案中对激发和发射使用相同的标识符即， “蓝色”、“绿色”和“红色”

由于实验上的局限性，测得的荧光强度不仅依赖于能量转移，还受到荧光团和实验装置特性的影响。为了获得两个荧光团之间真实的能量转移效率，必须对测得的强度进行校正。以下步骤基于参考文献⁹. 表观渗漏的校正因子（lk, 即， 来自一种荧光染料的光子在为另一种染料指定的通道中被检测到）以及表观伽马值ag, 即， 染料的荧光量子产率和通道的检测效率是通过显示受体漂白事件的单分子轨迹获得的。

从记录的荧光轨迹中所有受体染料发生漂白但供体染料仍具有荧光的数据点计算供体染料泄漏到每个可能的受体通道的情况（）：

以渗漏直方图的中位数作为表观渗漏因子。校正渗漏后，从同一组轨迹中确定表观伽马因子。该因子通过计算受体通道荧光变化量与供体通道荧光变化量在受体染料漂白后的比值得到：

其中 c 再次表示波长最长的受体检测通道。所得分布的中位数被用作表观校正因子。

通过以下方法获得每个通道的校正后强度：

然后根据以下公式计算 PF：

不同的群体可以在由PF构成的多维空间中被区分开。每个状态的位置和宽度通过使用多维高斯函数对数据进行拟合来确定。随后基于所有PF轨迹优化一个全局隐马尔可夫模型（HMM），从而对观测到的动力学提供定量描述。即使速率的微小变化也能被检测到。

隐马尔可夫模型（HMM）提供了一种从一系列含噪声的时间轨迹中推断状态模型的方法。在任意给定时刻，系统被认为处于一组离散的隐状态中的某一个，而实际观测值（即发射值）是该隐状态的概率函数²⁰。对于全内反射荧光显微镜（TIRFM）单分子FRET数据，每个状态 i 的发射概率 b_i 可通过连续的高斯概率密度函数建模。在规则间隔的离散时间点上，系统可根据与时间无关且仅依赖于当前状态的转移概率，在不同状态之间发生跃迁。转移矩阵 A 包含所有隐状态之间的转移概率 a_ij。初始状态分布 给出了时间轨迹第一个时间点各状态的特异性概率 。通过最大似然法，可利用前向-后向算法和Baum-Welch算法对这些参数进行优化，以最佳拟合数据^20,21，从而得到最大似然估计值（MLE）。最后，可通过Viterbi算法推断出最可能产生观测轨迹的状态序列。与其它smFRET数据的HMM分析方法^24,25,26不同，我们并非将HMM仅用作数据的“平滑”处理，而是直接从数据集中提取动力学状态模型，无需拟合停留时间直方图²⁷。HMM分析通过自主编写的Igor Pro脚本完成，代码实现基于文献²¹。我们已在网页上提供了软件包及示例数据，以便读者复现本实验方案的第5和第6节（https://www.singlemolecule.uni-freiburg.de/software/3d-fret）。完整软件可应要求提供。

在任何检测通道中，数据中 PF <-1 或 PF >2 的时间点被赋予所有状态的最小发射概率（10^-200）。这可以防止在这些数据点处出现人为的转移。

发射概率的参数是通过使用高斯函数拟合三维 PF 直方图获得的，具体方法如步骤 5.7 所述。这些参数在隐马尔可夫模型（HMM）优化过程中保持固定。

在所提出的方法中，初始状态分布向量和转移矩阵被全局用于描述整个轨迹集合。它们根据数据集中所有 N 个分子的信息进行更新，参见参考文献²⁷。

初始状态分布的起始参数由 PF 直方图的二维投影（步骤 5.3）确定，转移概率均设为 0.05，但停留在同一状态的概率除外，这些概率的选择需确保离开某一特定状态的总概率归一化为 1。

采用似然剖面法为所有转移速率提供置信区间（CIs），以作为其不确定性的有意义估计^21,22。为了计算某一特定速率的置信区间边界，需将感兴趣的转移概率固定为一个不同于最大似然估计值（MLE）的数值，从而得到检验模型 λ'。根据以下公式，对给定数据集 0 的似然度 进行似然比（LR）检验：

当似然比（LR）超过自由度为1的χ²分布的95%分位数3.841时，即达到该参数的95%置信界限^22,23。

通过 Hsp90 展示了该方法的强大之处。这种丰富的蛋白质存在于细菌和真核生物中，是细胞应激反应的一部分²⁸。它在癌症治疗中是一个有前景的药物靶点²⁹。Hsp90 是一种同源二聚体，每个亚基的N端结构域含有一个核苷酸结合口袋³⁰。它能够在至少两种全局不同的构象之间发生转变，分别为闭合构象和N端开放的V形构象^19,31,32。其二聚体特性直接引出了Hsp90中两个核苷酸结合位点之间相互作用的问题。

下文提供了一种针对酵母Hsp90与核苷酸的三色单分子FRET实验的数据采集与分析的逐步操作方案。该方案用于分析荧光标记的AMP-PNP（AMP-PNP*，一种不可水解的ATP类似物）依赖于构象的结合行为。通过应用所述方法，可同时研究Hsp90的核苷酸结合及其构象变化，从而揭示Hsp90两个核苷酸结合位点之间的协同性。

方案

1. 设置与先决条件

1. 在棱镜型全内反射荧光显微镜（TIRFM）上进行多色单分子FRET（smFRET）测量。关于双色装置的描述可参见JoVE出版物参考文献¹²。
   1. 构建一个多色TIRFM系统。通用布局详见参考文献⁹。
   2. 使用可切换的二极管泵浦固态连续波激光器，从而无需在激发光路中使用机械快门。
   3. 采用非对称、拉长的棱镜，以防止激发光束从棱镜背面反射后进入物镜。
   4. 在检测光路中使用2英寸消色差非球面熔融石英透镜，以尽可能多地收集光信号，并避免自荧光和像差，例如图像离中心区域的畸变。
   5. 使用独立的透镜将每条检测光路聚焦到EMCCD芯片上，从而实现每个检测通道的最佳聚焦。
      注意： TIRFM中使用的是3B类激光器。这意味着激光直射眼睛具有危险性，但漫反射无害。在系统运行前，必须确保符合当地政府规定的激光安全防护要求。
2. 使用双链DNA（dsDNA）样品预先测定装置和荧光染料特性的校正因子。
   1. 针对每种染料，使用一种高FRET效率的dsDNA样品，并与激发波长最长的受体组合（本装置中为：Atto488-Atto647N、Atto550-Atto647N、Atto594-Atto647N）。确保该DNA还经过生物素修饰。
   2. 用TNM缓冲液（5 mM Tris pH 7.5，5 mM NaCl，20 mM MgCl₂）将样品稀释至5 nM，并加入2 mM Trolox（测量时也使用此缓冲液）。
   3. 按照第2.5和2.7步中所述方法，将dsDNA固定在表面。
   4. 从显示受体漂白事件的单分子轨迹中计算表观串扰（lk）和表观gamma（ag）的校正因子。
3. 构建一个流动池，其结构为聚乙二醇（PEG）/生物素-PEG钝化的石英载玻片、双面粘附薄膜和盖玻片的三明治结构。有关石英载玻片清洗和钝化的详细方案，请参见参考文献⁹。
   1. 使用较厚（3 mm）的石英载玻片，以几何方式避免收集棱镜与功能化石英载玻片之间石英-甘油-石英界面散射的激光。
   2. 使用一层薄（40 µm）密封膜，其非粘附侧喷涂有粘合剂。该薄膜可缩短表面固定分子与物镜之间的距离。加热至80 °C并压合。
   3. 在顶部放置盖玻片，加热至80 °C并压合。将流动池置于棱镜上时，使用一滴甘油。
      注：棱镜、石英载玻片材料以及甘油的折射率是匹配的。
4. 表达来自Saccharomyces cerevisiae的Hsp90蛋白，构建在D61或Q385位点含有单一半胱氨酸突变的两种突变体。在C端添加卷曲螺旋结构域，以防止在皮摩尔浓度下发生二聚体解离。分别对突变蛋白进行标记，并交换单体，获得在氨基酸位置61处标记Atto488、在氨基酸位置385处标记Atto550的异源二聚体⁹。

2. 测量

1. 启动相机软件，并按以下要求设置成像参数：
   1. 将传感器冷却温度设置为尽可能低（使用外部水冷时可至 -95 °C），以降低暗电流噪声。
   2. 使用针对单分子记录优化的相机设置：3.3 µs 垂直移位速度、正常垂直时钟电压、17 MHz 16 位水平读出、前置放大增益为 3、电子倍增器增益为 1,000。
   3. 将采集触发模式设为“外部”，曝光时间为 70 ms。录制包含 750 个采集周期的视频。
      注意：相机采集时请关闭室内灯光，以防止 EMCCD 传感器饱和。
2. 在本地固态硬盘（SSD）上创建一个用于测量的文件夹。在软件设置中进入 <自动保存> 选项卡，启用 <自动保存> 功能，选择文件格式为“Tiff”以用于视频采集，并将 SSD 上的该文件夹设为自动保存位置。
3. 启动控制声光可调滤波器（AOTF）的软件、控制激光器运行的软件，以及同步激光器、AOTF、检测光路快门和相机的触发软件。通过 AOTF 调节激光功率（进入棱镜前约为 3 mW），并加载正确的触发模式。
4. 安装带有棱镜和流动池的样品架，连接管路，将进样管插入微型离心管中，出样管连接至注射泵。用约 150 µL 缓冲液冲洗样品池，调整激发光束并聚焦。使用所有激光器在约 10 mW 的激光功率下，缓慢移动覆盖载玻片整个检测范围，以漂白表面任何荧光污染物。此过程约需 1 小时。
   注意：除非另有说明，所用缓冲液含有 40 mM HEPES（pH 7.5）、150 mM KCl 和 10 mM MgCl₂。
5. 将约 300 µL 的 NeutrAvidin 溶液（0.25 mg/mL，溶于缓冲液）注入样品池，孵育 1 分钟。用缓冲液冲洗未结合的 NeutrAvidin，再用约 300 µL 的 BSA 溶液（0.5 mg/mL，溶于缓冲液）冲洗样品池。
   注意：此步骤通过 BSA 在表面的非特异性吸附，封闭残留的表面功能化缺陷。
6. 通过向流动池中加入约 150 µL 生物素化并标记的 Hsp90（用含 0.5 mg/mL BSA 的缓冲液稀释至逐渐升高的浓度），实现样品固定，直至达到足够的表面密度，通常在浓度为 5–10 pM 时即可实现。用约 300 µL 含 0.5 mg/mL BSA 的缓冲液洗去未结合的蛋白。
7. 注入 150 µL 含 25 nM AMP-PNP* 的缓冲液（含 0.5 mg/mL BSA）。孵育 5 分钟后重复此步骤一次，以确保核苷酸浓度正确。
   注意：若实验需额外添加未标记的 AMP-PNP，还需加入 250 µM AMP-PNP。
8. 开始数据采集。为获得足够数据量，采集约 20 段视频，总时长约 1.5 小时。
   1. 使用压电步进器将样品池沿垂直于激发光束的方向移动，以更换视野。
   2. 如有需要，使用控制物镜高度的 z 向压电陶瓷调节焦距。若样品池安装时无倾斜，则此操作通常无需频繁进行。
   3. 在相机软件中点击 <采集信号> 准备相机记录，并在触发软件中点击 <开始> 按钮，启动激发/采集循环。此操作将开始荧光强度的采集。
9. 首先录制一段含有在装置所有检测通道光谱范围内均有荧光发射的荧光微球的视频，以进行通道校准。然后，在校准视频中通过寻找最亮的点来确定微球位置，并对强度分布进行高斯拟合以确定其中心位置。保存在所有通道中均被检测到的微球坐标，并使用三阶二维多项式拟合 x 和 y 方向的映射偏移量⁹。

3. 单分子轨迹的筛选

1. 使用 Igor Pro 中的内部脚本进行数据分析。通过打开 "iniTIRF.ipf" 加载所有必要的脚本，并选择正确的实验类型。
   注意：以下内容中，<按钮> 指的是菜单或用户界面中的可点击元素。函数调用以引号表示，例如 "Print "Hello World""。这些命令可以复制到 Igor Pro 的命令行中（无需包含外层引号）。
2. 确保已加载检测通道配准所需的参数。
3. 通过点击 启动图形用户界面（GUI）。
4. 加载影片（即以 16 位 TIFF 堆栈格式存储的 512 × 512 像素帧序列），其中包含各检测通道的强度信息。通过点击 按钮，依次选择“主”和“从”相机的文件来完成此操作。
5. 通过在特定检测通道的前五帧之和中寻找最亮的点，确定潜在单分子的位置。根据通道映射关系，计算该位置在所有其他检测通道中的对应坐标。为获得荧光强度轨迹，对每一帧中中心位置周围像素方块内的强度进行求和。在 GUI 中点击 按钮执行此操作。
   注意：该方块的边长（以像素为单位）由以下公式给出：2 × + 1。
6. 对每个分子，将同一激发颜色下该位点所有轨迹的强度求和，得到联合原始强度轨迹。根据以下标准评估该分子在所有通道中的强度分布：
   1. 联合原始强度轨迹大致呈平坦平台状，且所有激发颜色下均出现单一漂白步骤；在相应检测通道中呈现反相关行为；在轨迹中至少出现一次红色荧光（表明发生了向结合态 AMP-PNP* 的 FRET）；红色荧光无多重跃迁，否则可能提示一个 Hsp90 二聚体上结合了两个 AMP-PNP* 分子。
7. 若满足上述标准，则保存该位点的荧光轨迹以供进一步分析。操作方法为：用光标选中轨迹，然后点击“timelines”图中的 按钮。每部影片中，需手动检查约 200 个分子在蓝光激发后三个检测通道中的强度轨迹。

4. 部分荧光轨迹的计算

1. 显示其中一个已保存分子的所有荧光强度轨迹。使用图表中的光标选择时间范围。
2. 选择一个所有荧光团均已漂白的时间区间。该区间的平均背景强度将被计算，并从每个通道的强度轨迹中扣除。通过点击 按钮执行此操作。
3. 选择FRET效率范围，确保至少Hsp90上连接的两种染料（Atto488和Atto550）均存在。务必排除包含闪烁事件的轨迹（见图3B）。此类事件的特征是某一通道的荧光强度下降，而其他任何通道均无相应增强。
4. 计算 PF 轨迹。点击 按钮进行计算。系统将应用预定义的校正因子，对表观串扰（lk）和表观伽马值（ag）进行校正，以消除光物理效应和仪器设置特性带来的影响。

5. 群体选择与三维直方图拟合

1. 移除在 PF 轨迹中显示低信噪比的分子。在任意 PF 轨迹中，若分子在超过 10% 的帧中超出区间 [-1; 2]，则将其从数据集中剔除。通过在命令窗口中执行“RemoveTracesLowSNR()”来完成此操作。
2. 计算 PF 数据的分箱二维投影。在区间 [-0.5; 1.5] 内，以 100 × 100 个分箱的分辨率，绘制 对 的图像，以及 对 的图像。执行以下操作：
   1. “HistFret2D("r_b", "r_g", binHist=100)”
   2. “HistFret2D("r_b", "g_b", binHist=100); MoveWindow 553.5, 42.5, 1055.25, 508.25”
3. 确定二维投影中每个可区分状态的相对占比。
   1. 将相应的图形调至前端，并执行“panelHist2DCount()”。
   2. 按下 按钮，围绕峰位手绘一个多边形。
   3. 点击 按钮。多边形内数据点的数量以及投影中总数据点数将显示在命令窗口中。
4. 通过执行“HistFret3D("g_b", "r_b", "r_g")”生成 PF 数据的三维直方图。
5. 将三维直方图归一化，使其积分为 1。执行以下命令：
   1. “NewDataFolder/S fit0”
   2. “Duplicate/O ::FRET:Hist3D, Hist3D”
   3. “Variable /G div = sum(Hist3D)*(DimDelta(Hist3D,0))^3”
   4. “Hist3D /= div; Print div”
6. 为三维高斯拟合提供初始参数，并准备必要的数据结构。
   1. 执行“Gauss3D_initParam(); edit W_coef_old”。
   2. 将各状态的占比添加到参数向量的末尾。
   3. 执行“Gauss3D_prepareFit()”。
      注意： W_coef_old 是一个包含拟合初始参数的向量。每个状态对应 以及附加在向量末尾的状态占比。请确保协方差矩阵是对称的。
7. 将 S 个三维高斯函数的和拟合到三维 PF 直方图上，其中 S 为可区分状态的数量。
   1. 执行“do3D()”。在普通办公电脑上，此过程可能需要一小时或更长时间，具体取决于初始参数的质量。
   2. 执行“postprocessFitMultiGauss3D(); evalFitMultiGauss3D(); edit W_coef”。
8. 显示拟合结果。对每个二维投影，使用以下命令：
   1. “contourPF3D_new(0); contourPF3D_new(1); contourPF3D_new(2); contourPF3D_new(3); contourPF3D_new(4)”
   2. “contourPF3D_colorize()”

6. 利用三维集成隐马尔可夫模型进行动力学分析

1. 准备进行集成隐马尔可夫模型（HMM）运行以提取动力学信息。从数据集中所有分子优化出一个HMM。利用前一步骤中获得的信息，定义每个状态在三维空间中的位置和宽度 PF 空间
   1. 初始化HMM用户界面（）并选择合适的状态数（对于 Hsp90 数据而言，这意味着 <状态数> = 5），输入信号的维度数量（<维度数> = 3），以及输入的类型（<输入类型> FRET 三维背景扣除
2. 通过让软件收敛隐马尔可夫模型（HMM）的似然性（执行 "prepENS_CONVERGE_gB(GetDataFolder(1), -14)"），优化HMM的参数，直至转移矩阵相对于前一次迭代的变化低于设定阈值（10⁻⁶）^-14 （针对每次转移概率的绝对变化量之和）。在普通办公用电脑上，约一小时内即可得到转移概率的最大似然估计值。
3. 对数据的子集重复进行群体筛选、高斯拟合以及隐马尔可夫模型（HMM）优化例如， 完整数据集的75%）。如果完整数据集来自不同的实验，则还需对每个单独的实验重复进行优化。子集分析有助于评估手动群体选择的不确定性以及数据集内部的变异性。
4. 计算转移概率的置信区间（CI），以反映数据集的异质性及隐马尔可夫模型（HMM）的精确度。
   1. 通过执行“cd $(root:path3Dimport + "HMM"); loop_getCI_estimate_limits().”来粗略估计置信区间界限。
   2. 通过执行以下操作计算置信区间的精确界限：
   3. loop_getCI_HMM_converge(1)
   4. CIresults_conv_new()
   5. cd ::HMM_CIresult; reportCI_conv()
   6. cd ::cmp_CI_conv; CI_plot2("HMM", doAppend=0)
5. 浓缩可用的动力学信息，以简化解读。
   1. 收集标记核苷酸与Hsp90结合状态的停留时间信息。通过合并与AMP-PNP*结合的状态来实现即， S₁，S₂ 和 S₃，另见 图2）并生成停留时间直方图。执行“cd $(root:path3Dimport +"HMM"); collapse_states_get_DT({0,1,1,1,0})”，该命令将合并状态 S 的停留时间₀ 和 S₄ 以及 S₁，S₂，以及 S₃.
   2. 从维特比路径中提取每个目标状态的停留时间，并比较不同实验条件下的停留时间直方图。执行“plot_collapsed_DT_Hist (wDTo_01110_record1)”。
   3. 为了获得更详细的图像，折叠具有不同状态的 PF 但在功能上完全相同，以便于后续数据分析， 例如在使用标记的 Hsp90 和核苷酸进行三色实验的情况下，状态 S₂ 和 S₃ 可以折叠。执行“collapse_states_get_DT({0,1,2,2,4})”。

结果

多色单分子FRET测量能够直接检测两个或多个不同相互作用位点之间的相关性。这使得该技术在研究多组分系统（如蛋白质复合物）时具有独特优势。本文重点介绍一个三色单分子FRET实验，作为示例加以说明。

该方法的总体工作流程如图1所示。第一部分包括在棱镜型全内反射荧光（TIRF）显微镜上记录多色单分子FRET（smFRET）数据。表面固定策略及实验装置示意图见图2A。有关装置的更详细描述，请参见参考文献⁹。所介绍方法的第二部分侧重于数据分析。典型的荧光强度轨迹如图2B所示。合格的时间轨迹应具备以下特征：(i) 连接在Hsp90上的两种荧光团均表现出清晰的漂白步阶，(ii) 平坦的强度平台期，(iii) 对应通道之间呈现反相关行为，以及 ...

讨论

我们介绍了获取复杂蛋白质系统三色单分子FRET数据的实验步骤，以及对这些测量结果进行分析的逐步说明。该方法提供了直接评估多个相互作用位点或构象变化之间相关性的独特可能性。

为了获得适用于蛋白质研究的高质量多色单分子数据，必须在低噪声水平下进行可重复的测量。这可以通过采用高效且可靠的流动池表面钝化方案来实现。⁹表面固定的分子应达到足够密度，以提高每段录制视频中捕获的分子数量。这意味着单个分子的荧光信号应覆盖所记录图像中约5%–10%的像素。同时应避免过度负载，以防相邻分子信号重叠。当标记物在溶液中自由存在时（如本研究中的AMP-PNP*），需确保其浓度足够低，以免被较短波长的激光直接激发而干扰检测结果。即， 通常远低于微摩尔浓度）。同时，需确保这些化合物的浓度不会因非特异性结合到界面而低于预期。此外，最佳激发功率需在信噪比与荧光染料的光漂白之间进行权衡。

本方案中未使用任何除氧系统。所用的Atto-Tec染料在实验时间尺度上（每个激发周期照射70 ms）未表现出明...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
装置
减振光学平台	Newport, Irvine, CA, USA	RS2000
OBIS 473nm LX 75mW 激光器	Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA	1185052
OBIS 532nm LS 50mW 激光器	Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA	1261779
OBIS 594nm LS 60mW 激光器	Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA	1233470
OBIS 637nm LX 140mW 激光器	Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA	1196625
激光控制单元	Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA	1234465	Scientific Remote
非球面望远镜透镜	Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA		d=25.4mm, f=50mm 和 f=100mm
CF ex1	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	ZET 473/10	激发清理滤光片
CF ex2	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	ZET 532/10	激发清理滤光片
CF ex3	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	ZET 594/10	激发清理滤光片
CF ex4	Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA	FL635-10	激发清理滤光片
DM ex1	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	ZQ594RDC	激发二向色镜
DM ex2	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	570DCXR	激发二向色镜
DM ex3	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	ZQ491RDC	激发二向色镜
AOTFnC-Vis	AA Opto-Electronic, Orsay, France
λ/4 波片	Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA	AQWP05M-600
CFI Apo TIRF 100x	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA		高数值孔径物镜
压电聚焦定位器 MIPOS 250 CAP	piezosystem jena GmbH, Jena, Germany		Piezo Controller NV 40/1 CLE
压电步进器	Newport, Irvine, CA, USA	PZA12	PZC200-KT NanoPZ 执行器套件
消色差非球面透镜	Qioptiq Photonics GmbH & Co. KG, Göttingen, Germany	G322-304-000	d=50mm, f=200mm
可调光学狭缝	Owis GmbH, Staufen i. Br., Germany	27.160.1212	最大孔径 12 x 12 mm
DM det1	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	T 600 LPXR	检测二向色镜
DM det2	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	H 560 LPXR superflat	检测二向色镜
DM det3	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	HC BS R635	检测二向色镜
BP det1	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	525/40 BrightLine HC	带通滤光片检测
BP det2	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	586/20 BrightLine HC	带通滤光片检测
BP det3	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	631/36 BrightLine HC	带通滤光片检测
BP det4	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	700/75 ET 带通	带通滤光片检测
检测用光学快门	Vincent Associates, Rochester, NY, USA	Uniblitz VS25S2T0
EMCCD iXon Ultra 897	Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland
数字 I/O 卡，PCIe-6535	National Instruments, Austin, Texas, USA
注射泵	Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA	PHD22/2000
名称	公司	目录编号	备注
流动池
石英载玻片	G. Finkenbeiner Inc, Waltham, MA, USA		Spectrosil2000, h=3mm
TEGADERM 薄膜	3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany	1626W	10 x 12cm
喷雾粘合剂	3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany	Photo Mount 050777
甘油	Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany	Immersol G
浸油	OLYMPUS EUROPA SE & CO. KG, Hamburg, Germany	IMMOIL-F30CC
棱镜	Vogelsberger Quarzglastechnik GmbH, Hauzenberg, Germany		Suprasil1
铝制棱镜支架			定制
空心内六角螺钉	Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA		带定制钻孔
Tygon S3 E-3603 软管	neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	2-4450	ACF00001
PTFE 软管	Bohlender GmbH, Grünsfeld, Germany	S1810-08
名称	公司	目录编号	备注
样品
酵母 Hsp90 D61C, Q385C_biotin			UniProt ID P02829
Atto488、Atto550 的马来酰亚胺衍生物	ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany
AMP-PNP*	Jena Bioscience, Jena, Germany		γ-[(6-氨基己基)-亚氨基]-AMP-PNP-Atto647N
Fluospheres	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	F8764	氨基修饰，0.2 μm，黄绿色荧光
名称	公司	目录编号	备注
软件
Andor Solis	Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland		版本 4.30
LabVIEW	National Instruments, Austin, Texas, USA		版本 2012，32 位；多种硬件控制
MDS 控制软件	AA Opto-Electronic, Orsay, France		版本 2.03a
Coherent Connection	Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA		版本 3
Igor Pro	WaveMetrics Inc, Portland, OR, USA		版本 6.37