方法文章

利用三色单分子FRET研究蛋白质相互作用的相关性

DOI：

10.3791/56896

⸱

2018年1月30日

 ,  ,  , 
1Institute of Physical Chemistry, University of Freiburg, 2Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience Delft, Delft University of Technology

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种获取三色单分子FRET数据并利用三维系综隐马尔可夫模型进行分析的实验方案。通过该方法，科研人员可以从复杂的蛋白质系统中提取动力学信息，包括协同效应或相关联的相互作用。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

单分子荧光共振能量转移（smFRET）已成为研究生物分子动态变化的一种广泛应用的生物物理技术。在细胞中，许多分子机器需要蛋白质与其相互作用伙伴在功能循环中协同作用 才能完成其功能。将双色smFRET扩展至多色smFRET，使得能够同时检测多个相互作用或构象变化。这不仅为smFRET实验增加了新的维度，而且在使用固定样品和全内反射荧光显微镜（TIRFM）时，还提供了直接研究事件发生顺序以及检测相关相互作用的独特可能性。因此，多色smFRET是一种功能强大的工具，可用于以定量方式并以前所未有的细节水平研究生物分子复合物。

本文展示了如何克服蛋白质多色单分子FRET实验中的特殊挑战。我们提供了获取数据并提取动力学信息的详细方案，包括轨迹选择标准、状态分离，以及利用三维系综隐马尔可夫模型（HMM）从噪声数据中恢复状态轨迹的方法。与其他方法相比，动力学信息并非来自停留时间直方图，而是直接从HMM中提取。最大似然框架使我们能够对动力学模型进行严格评估，并为速率提供有意义的不确定性分析。

通过将我们的方法应用于热休克蛋白90（Hsp90），我们能够解析其核苷酸结合过程与蛋白质整体构象变化之间的关系。这使我们能够直接观察Hsp90二聚体中两个核苷酸结合位点之间的协同性。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

许多蛋白质通过在多种时间尺度上的构象变化和瞬时相互作用，与其他分子形成动态复合物，从而实现其功能1,2,3。当与外部能量源（例如，ATP）偶联时，这些动态相互作用可赋予功能循环以方向性，并最终维持细胞内的非平衡稳态，这是生命存在的前提。

为了充分理解这些分子机器，仅依靠结构研究提供的静态描述是不够的。此外，必须了解其背后的动力学模型，并确定动力学速率常数。目前已有多种方法可使研究人员研究两种目标分子之间二元相互作用的动力学过程。 例如， 表面等离子共振，具有光谱读出的弛豫方法（例如， 跳跃或停流技术）以及核磁共振。然而，在大多数情况下，这些方法仅适用于简单的两态系统（例如， 一种结合态和一种未结合态）由于体相实验固有的平均效应所致。当涉及更多状态或中间态时，这些方法仅能提供一系列复杂的速率常数混合信息。单分子方法，如光镊、磁镊或双色单分子荧光共振能量转移（two-color smFRET）， 即， 一个供体和一个受体荧光团，结合表面固定的样品，可恢复所有观察到的构象变化的速率常数。然而，当涉及影响多个结合位点的相互作用时，这些方法仍然存在局限性，对于两个（或多个）相互作用之间可能存在的相关性信息，只能通....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 设置与先决条件

  1. 在棱镜型全内反射荧光显微镜（TIRFM）上进行多色单分子FRET（smFRET）测量。关于双色装置的描述可参见JoVE出版物参考文献12。
    1. 构建一个多色TIRFM系统。通用布局详见参考文献9。
    2. 使用可切换的二极管泵浦固态连续波激光器，从而无需在激发光路中使用机械快门。
    3. 采用非对称、拉长的棱镜，以防止激发光束从棱镜背面反射后进入物镜。
    4. 在检测光路中使用2英寸消色差非球面熔融石英透镜，以尽可能多地收集光信号，并避免自荧光和像差，例如图像离中心区域的畸变。
    5. 使用独立的透镜将每条检测光路聚焦到EMCCD芯片上，从而实现每个检测通道的最佳聚焦。
      注意： TIRFM中使用的是3B类激光器。这意味着激光直射眼睛具有危险性，但漫反射无害。在系统运行前，必须确保符合当地政府规定的激光安全防护要求。
  2. 使用双链DNA（dsDNA）样品预先测定装置和荧光染料特性的校正因子。
    1. 针对每种染料，使用一种高FRET效率的dsDNA样品，并与激发波长最长的受体组合（本装置中为：Atto488-Atto647N、Atto550-Atto647N、Atto594-Atto647N）。确....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

多色单分子FRET测量能够直接检测两个或多个不同相互作用位点之间的相关性。这使得该技术在研究多组分系统（如蛋白质复合物）时具有独特优势。本文重点介绍一个三色单分子FRET实验，作为示例加以说明。

该方法的总体工作流程如图1所示。第一部分包括在棱镜型全内反射荧光（TIRF）显微镜上记录多色单分子FRET（smFRET）数据。表面固定策略及实验装置示意图见图2A。有关装置的更详细描述，请参见参考文献9。所介绍方法的第二部分侧重于数据分析。典型的荧光强度轨迹如图2B所示。合格的时间轨迹应具备以下特征：(i) 连接在Hsp90上的两种荧光团均表现出清晰的漂白步阶，(ii) 平坦的强度平台期，(iii) 对应通道之间呈现反相关行为，以及 .......

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们介绍了获取复杂蛋白质系统三色单分子FRET数据的实验步骤，以及对这些测量结果进行分析的逐步说明。该方法提供了直接评估多个相互作用位点或构象变化之间相关性的独特可能性。

为了获得适用于蛋白质研究的高质量多色单分子数据，必须在低噪声水平下进行可重复的测量。这可以通过采用高效且可靠的流动池表面钝化方案来实现。9表面固定的分子应达到足够密度，以提高每段录制视频中捕获的分子数量。这意味着单个分子的荧光信号应覆盖所记录图像中约5%–10%的像素。同时应避免过度负载，以防相邻分子信号重叠。当标记物在溶液中自由存在时（如本研究中的AMP-PNP*），需确保其浓度足够低，以免被较短波长的激光直接激发而干扰检测结果。即， 通常远低于微摩尔浓度）。同时，需确保这些化合物的浓度不会因非特异性结合到界面而低于预期。此外，最佳激发功率需在信噪比与荧光染料的光漂白之间进行权衡。

本方案中未使用任何除氧系统。所用的Atto-Tec染料在实验时间尺度上（每个激发周期照射70 ms）未表现出明.......

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明无利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作由德国研究基金会（INST 39/969-1）和欧洲研究理事会通过ERC资助协议编号681891资助。

....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
装置
减振光学平台  Newport, Irvine, CA, USARS2000
OBIS 473nm LX 75mW 激光器Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA1185052
OBIS 532nm LS 50mW 激光器Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA1261779
OBIS 594nm LS 60mW 激光器Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA1233470
OBIS 637nm LX 140mW 激光器Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA1196625
激光控制单元Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA1234465Scientific Remote
非球面望远镜透镜Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USAd=25.4mm, f=50mm 和 f=100mm
CF ex1AHF analysentechnik AG, Tübingen, GermanyZET 473/10激发清理滤光片
CF ex2AHF analysentechnik AG, Tübingen, GermanyZET 532/10激发清理滤光片
CF ex3AHF analysentechnik AG, Tübingen, GermanyZET 594/10激发清理滤光片
CF ex4Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USAFL635-10激发清理滤光片
DM ex1AHF analysentechnik AG, Tübingen, GermanyZQ594RDC激发二向色镜
DM ex2AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany570DCXR激发二向色镜
DM ex3AHF analysentechnik AG, Tübingen, GermanyZQ491RDC激发二向色镜
AOTFnC-VisAA Opto-Electronic, Orsay, France
λ/4 波片Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USAAQWP05M-600
CFI Apo TIRF 100xNikon Instruments Inc, Melville, NY, USA高数值孔径物镜
压电聚焦定位器 MIPOS 250 CAPpiezosystem jena GmbH, Jena, GermanyPiezo Controller NV 40/1 CLE
压电步进器Newport, Irvine, CA, USAPZA12PZC200-KT NanoPZ 执行器套件
消色差非球面透镜Qioptiq Photonics GmbH & Co. KG, Göttingen, GermanyG322-304-000d=50mm, f=200mm
可调光学狭缝Owis GmbH, Staufen i. Br., Germany27.160.1212最大孔径 12 x 12 mm
DM det1AHF analysentechnik AG, Tübingen, GermanyT 600 LPXR检测二向色镜
DM det2AHF analysentechnik AG, Tübingen, GermanyH 560 LPXR superflat检测二向色镜
DM det3AHF analysentechnik AG, Tübingen, GermanyHC BS R635检测二向色镜
BP det1AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany525/40 BrightLine HC带通滤光片检测
BP det2AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany586/20 BrightLine HC带通滤光片检测
BP det3AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany631/36 BrightLine HC带通滤光片检测
BP det4AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany700/75 ET 带通带通滤光片检测
检测用光学快门Vincent Associates, Rochester, NY, USAUniblitz VS25S2T0 
EMCCD iXon Ultra 897Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland
数字 I/O 卡，PCIe-6535National Instruments, Austin, Texas, USA
注射泵Harvard Apparatus, Holliston, MA, USAPHD22/2000
名称公司目录编号备注
流动池
石英载玻片G. Finkenbeiner Inc, Waltham, MA, USASpectrosil2000, h=3mm
TEGADERM 薄膜3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany1626W10 x 12cm
喷雾粘合剂3M Deutschland GmbH, Neuss, GermanyPhoto Mount 050777
甘油Carl Zeiss AG, Oberkochen, GermanyImmersol G
浸油OLYMPUS EUROPA SE & CO. KG, Hamburg, GermanyIMMOIL-F30CC
棱镜Vogelsberger Quarzglastechnik GmbH, Hauzenberg, GermanySuprasil1
铝制棱镜支架定制
空心内六角螺钉Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA带定制钻孔
Tygon S3 E-3603 软管neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany2-4450ACF00001
PTFE 软管Bohlender GmbH, Grünsfeld, GermanyS1810-08
名称公司目录编号备注
样品
酵母 Hsp90 D61C, Q385C_biotinUniProt ID P02829
Atto488、Atto550 的马来酰亚胺衍生物ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany
AMP-PNP*Jena Bioscience, Jena, Germanyγ-[(6-氨基己基)-亚氨基]-AMP-PNP-Atto647N
FluospheresThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAF8764氨基修饰，0.2 μm，黄绿色荧光
名称公司目录编号备注
软件
Andor SolisAndor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland版本 4.30
LabVIEWNational Instruments, Austin, Texas, USA版本 2012，32 位；多种硬件控制
MDS 控制软件AA Opto-Electronic, Orsay, France版本 2.03a
Coherent ConnectionCoherent Inc, Santa Clara, CA, USA版本 3
Igor ProWaveMetrics Inc, Portland, OR, USA版本 6.37

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. Diversity of protein-protein interactions. EMBO J. 22 (14), 3486-3492 (2003).
  2. Marsh, J. A., Teichmann, S. A. Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes. Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).
  3. Henzler-Wildman, K.,....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

FRET Hsp90

相关文章