我们介绍一种利用Bacillus subtilis作为示例的微流控分析单个细菌细胞谱系的方法。该方法通过在高度可控且均一的生长条件下观察数百代细胞，克服了传统微生物学分析方法的局限性。
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摘要
摘要
微流控技术克服了传统微生物学分析方法的诸多局限性。与批量培养方法不同，它能够实现单细胞分辨率，并支持跨越数百代的长期观察；与基于琼脂糖凝胶垫的显微镜技术相比，它能提供高度可控且均一的生长条件。由于在微流控装置中，培养基的持续流动使细胞与细胞生长和代谢所引起的局部化学环境不可预测变化相隔离，因此可以更可靠地观察基因表达和细胞生长对特定刺激的真实响应。Bacillus subtilis 被用作模式细菌物种，以演示一种"母系机器"类型的细胞分析方法。我们展示了如何构建和连接微流控装置，将细胞加载到装置中，启动显微成像，并通过切换培养基来对细胞施加刺激。以一个应激响应报告系统为例，说明该方法可获得的数据类型。我们还简要讨论了该方法在其他类型实验中的进一步应用，例如细菌孢子形成分析。
引言
地球上生命最显著的特征之一是其强大的适应力和多样性。分子生物学的一个核心目标是理解细胞如何利用基因和蛋白质，在各种环境条件下最大限度地实现生长和适应性。为实现这一目标，科学家必须能够可靠地观察单个细胞在特定条件下的生长、分裂及基因表达情况，并记录细胞对其环境后续变化的响应。然而，传统微生物学分析方法存在技术局限性，限制了可研究问题的范围。例如，基于群体培养的分析方法多年来虽十分有用，但仅能提供群体水平的数据，可能掩盖细胞间的显著差异或总体中较小亚群的行为。基于光学显微镜的活体细菌单细胞分析虽能揭示单个细胞的行为，但也存在技术上的限制。通常将细菌固定在含有培养基的琼脂糖凝胶垫上，但随着细胞生长和分裂，显微视野会变得拥挤，且仅经过几个细胞周期后营养物质即被耗尽，从而显著限制了观察时间1,2。此外，细胞生长导致局部营养物质的消耗以及代谢副产物的同步积累，不断改变着细胞周围的微环境，而这些变化难以测量或预测。使用琼脂糖垫所引发的此类环境变化，给稳态行为的研究以及细胞对特定生长条件变化响应的研究带来了挑战3。
微流控技术通过在微加工装置中持续流动液体介质，为传统实验的局限性提供了解决方案。微流控装置能够将单个细胞固定在特定位置，以便进行活细胞显微观察；同时，培养基的流动可不断为细胞提供新鲜营养物质，并清除代谢副产物和多余的细胞，从而构建高度均一的生长环境。在恒定的生长条件下，细胞行为可摆脱环境因素的干扰而被独立观察，从而清晰揭示细胞内部的调控机制。由于流体流动可防止装置内细胞过度堆积，因此能够对单个细胞谱系进行数十甚至数百代的持续观察4,5。如此长时间的观察使得原本难以察觉的长期性或稀有细胞行为得以被检测。最后，流经装置的培养基成分可随意调节，从而能够观察细胞在受到应激刺激，或特定化合物加入或移除时的响应过程。
微流控技术已获得诸多重要应用。例如，该技术已被用于组织芯片、器官芯片或人体芯片装置中，在这些装置中共同培养多种人类细胞类型以模拟体内环境6；用于研究线虫在微结构环境中的运动行为7；用于检测细菌生物膜之间的相互作用（例如，8）；以及用于包裹和操控微量细胞或化学物质（例如，9）。微流控装置在微生物学领域也日益流行（有关优秀综述，请参见10和11），尤其是因为其物理和流动特性与天然微生物生态位高度匹配12。例如，微生物学家近年来已利用微流控技术实现多种目的，包括精确测量细胞生长与分裂13,14,15、分析病原体运动16、监测群体感应17和生理状态转变18，以及蛋白质计数19等众多实例。本文所介绍的方法专为分析单个细菌细胞谱系而设计，而非菌株或物种的组合。本文展示的微流控装置采用了一种“"母系装置"”设计的变体4，其中细胞在具有一个封闭端和一个开放端的微流控沟道中以单列方式生长；细胞的生长与分裂将子代细胞沿沟道推向开放端并进入流体流中。我们的分析通常仅关注被限制在沟道封闭端的“"母细胞"”。我们认为该方法相较于以往基于光学显微镜的单细胞分析技术（如在琼脂糖垫上固定细胞）是一种进步。尽管本文以B. subtilis作为模式生物，但该方法同样适用于其他细菌物种（Escherichia coli是另一种常用模型；某些细胞大小或形态不同的物种可能需要制造具有不同尺寸的新装置）。若使用荧光报告基因标记细胞并可视化基因表达变化，则需采用遗传操作可行的物种；然而，即使没有荧光标记物，也可进行细胞生长和形态的分析。
本方案不包括使用光刻技术制备硅模板的过程，该过程已在其他文献中得到详尽描述5；硅模板也可方便地由微加工机构外包制备。本方案包括使用增强型硅模板浇铸PDMS装置；将该装置键合至一片盖玻片上；组装微流控装置的进样和出样管路，包括使用夹管阀以实现培养基切换；对装置进行钝化处理，制备细菌细胞并将细菌细胞载入装置；将管路连接至装置并使细胞达到平衡状态；最后将装置装载到荧光显微镜上进行成像。由于可使用多种不同的图像采集与处理软件工具来观察和分析各类目标数据4,5，本文展示了示例图像，但未包含具体的图像采集方法。
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方案
1. PDMS 装置浇铸
- 在无尘环境中，按10:1的比例混合PDMS聚合物与固化剂，并在真空条件下脱气至少10分钟。
- 将硅胶母模（或其环氧树脂或聚氨酯复制品）置于聚苯乙烯培养皿中一张完整的铝箔上。将脱气后的PDMS混合物倒入母模上，厚度约为5 mm。将培养皿再次置于真空环境中脱气至少10分钟。使用轻微的气流吹破表面气泡。
注意：所用双层装置的尺寸详见随附的CAD文件5（见补充文件1）。塑料复制品母模在脱气过程中可能部分浮起；若发生此情况，可用洁净的塑料涂布棒轻轻压下复制品。 - 将PDMS在60 °C的烘箱中固化至少1小时，随后冷却至室温。将带有母模和已固化PDMS的铝箔从培养皿中取出。小心地从母模背面剥离铝箔，再小心地将PDMS从母模上剥离。
注意：也可选择在室温下过夜固化PDMS。为克服硅片母模相对易碎的问题，可使用环氧胶将硅片永久粘合至一个厚度为1/16英寸、尺寸相同的铝盘上。 - 由于单个硅片通常包含多个尺寸略有不同的微流控装置（见补充文件1），需使用洁净锋利的手术刀将单个装置切割至所需尺寸。
注意：常规进行B. subtilis实验时，应选用细胞沟道宽度为1.0 µm的装置，此类装置在随附CAD文件中标记为C或F。
2. 装置冲孔与键合
- 将一片半透明办公胶带（参见材料表）覆盖在装置的图案面，以增强图案特征的可见性。进样口和出样口位于可见流体通道两端的圆形区域（图1）。为在装置上打孔以安装进样和出样针时提高其可见性，可使用细头记号笔在进样口和出样口位置标记圆点。
注意：为确保进样针和出样针之间留有足够空间，应从设备字母标识正下方的通道开始，每隔一个通道打一个孔。 - 将PDMS装置翻转，使图案面朝下，使用0.75 mm的活检打孔器对准已标记的点进行打孔，并丢弃打下的PDMS碎片。
注意：将装置图案面朝下打孔的原因是，活检打孔器在进入聚合物时通常会在入口处形成轻微的喇叭形孔。以倒置方向打孔可确保图案面上的孔具有清晰锐利的边缘。 - 在体视显微镜下检查，确保打孔位置与装置的进样口和出样口区域准确重叠。使用细头镊子清除孔洞中残留的任何多余PDMS碎片。
- 使用胶带清除装置两面的灰尘，并将其放入洁净的聚苯乙烯培养皿中。取一块22 mm × 40 mm的盖玻片，用100%异丙醇润湿后，用无尘擦拭布擦拭；再用无尘空气或氮气流吹干。
- 将打孔后的PDMS装置（图案面朝上）与清洁的盖玻片一同放入氧气等离子体清洗机中。
- 采用以下参数进行等离子体处理：真空度70 mTorr；O2压力200 mTorr；处理时间15 s；功率30 W。等离子体处理结束后立即取出装置和盖玻片。
- 将PDMS装置翻转，使其图案面朝下，置于盖玻片中心，确保图案面与玻璃接触；同时使进样口与出样口之间的供液通道与盖玻片的长轴对齐。轻轻按压，确保PDMS与玻璃之间形成密封。
- 将组装好的装置置于烘箱中，在60 °C下烘烤至少1小时。烘烤完成后，通过轻轻按压装置一角，手动检查PDMS是否已牢固键合至玻璃。
注意：装置键合后应在24小时内使用，因为随着时间推移，聚合物在等离子体处理后会逐渐恢复疏水性。
3. 微流控管路准备
- 将聚合物管（内径（ID）0.02 英寸，外径（OD）0.06 英寸）切成适当长度，使其能够从注射泵连接至切换装置（如使用）以及安装在显微镜上的芯片。根据微流控通道的数量，切割相应数量的管段。
- 组装用于夹管阀的Y型接头（若使用）：将2厘米长的柔性硅胶管（内径0.03英寸，外径0.065英寸）剪切并连接至顶部卡口 "Y" 以及将1厘米长的硅胶管连接到底部的凸缘上 "Y."
- 剪取10厘米（或适当长度）的聚合物管；将一端插入底部接头下方的1厘米长硅胶管段中，连接至切换接头 "Y.” 将另一端连接至已从塑料注射器接头拆下并距离针尖约9 mm处弯曲约90°的21G针头。
- 将21G钝头针插入管路的一端，连接至从注射器通向切换装置的管路段；将每段管路的另一端插入Y型接头进样锥上的硅胶管段内。
注意：使用某种装置将夹管阀和连接处固定到位；该装置可轻易由微量移液器吸头盒制成图 2D). - 将聚合物管剪成适当长度，用于将装置出口的废液导入废液杯中。将管的一端连接至上述方法制备的弯头21G针头，另一端用胶带固定在废液杯内。
- 配制含有0.1 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）的适量培养基，填充至所需规格和数量的注射器中。将装有BSA的注射器连接至已安装在进液管路上的21G针头，并将注射器装入注射泵中。
注意：典型的实验使用该装置的5个通道，每个通道配有一个20 mL注射器。若实验中需要更换培养基，则需使用两组注射器，每组5个。此处，装有第一组注射器（含切换前培养基）的泵称为第一阶段泵，而装有第二组注射器（含切换后培养基）的泵称为第二阶段泵。 - 通过以高流速运行注射泵，从入口管路中排出空气（>500 µL/min），首先将注射泵垂直放置，并轻敲注射器以使气泡上升至顶部。待注射器中的空气排尽后，将注射泵水平放置，并从注射器开始沿聚合物管路逐步轻敲或弹击，经切换装置向上排出气泡。若需更换培养基，则对第二组注射器重复上述操作。
- 在排除气泡后，设置第二相注射泵（即，将用于切换后的第二种培养基）调整为1.5 µL/min，然后暂停流体流动。在Y型接头分支上对应第二种培养基相的柔性管路段上夹上小型文件夹夹子。继续以适中的流速运行第一相注射泵（例如以10 µL/min的流速持续灌注至少30分钟，以清除Y型接头下游进样管路中的第二种培养基。
4. 细胞培养准备
- 在所需的培养基中过夜培养目标菌株，使其进入稳定期。所用细菌菌株应携带一种使细胞失去运动能力的突变，以防止细胞游出装置的通道。
注意：本实验方案中使用的菌株为 B. subtilis 3610，携带 hagA233V 突变（该突变使鞭毛呈直线状而非螺旋状，从而阻止细胞运动），并含有 PrsbV-mNeonGreen 报告系统用于检测细胞应激，以及组成型表达的 Phyperspank-mNeptune（红色）报告系统以标记细胞。示例实验中使用 LB Lennox 培养基。微流控实验常用的菌株通常包含一个或多个荧光转录报告系统，以及一种持续表达的胞质荧光蛋白，以利于细胞的自动识别。使用 LB Lennox 富集培养基时未观察到生长缺陷，但在微流控条件下，B. subtilis 在最低培养基中的生长可能受到抑制，原因是分泌的铁载体被培养基流动冲走。在此类情况下，可参考 S750 培养基的报道方法，在培养基中添加柠檬酸钠和三氯化铁以恢复其生长11。 - 实验当天早晨，将 B. subtilis 细胞按 1:50 的比例接种至装有 25 mL 培养基的带挡板 250-mL 三角瓶中。在 37 °C 条件下振荡培养 5–6 小时，使细胞密度达到光密度大于 1。
注意：高密度的细胞培养更理想，因为处于稳定期的 B. subtilis 细胞体积较小，且较少形成细胞链，有利于装置的加载。不同细菌种类可能需要不同的培养基或生长条件以实现最佳加载效果。 - 使用装有孔径为 5 µm 滤膜的注射器，将约 15 mL 细胞培养物过滤至 15-mL 锥形管中，以去除 B. subtilis 细胞链（此步骤对 E. coli 无需进行，其他菌种也可能不需要）。
注意：应仅有少量细胞被截留；滤液应保持浑浊。 - 将过滤后的培养物在室温下以 4,000 × g 离心 10 分钟。弃去上清液，并用管内残留的少量上清液重悬细胞沉淀，必要时可加入约 500 µL 新鲜培养基，以便于移液操作。
5. 设备装载
- 将空的细胶加样微量移液器吸头（参见材料表）轻轻插入微流控装置的出口孔中。
- 使用细胶加样吸头和P200微量移液器，向入口孔中注入含有1 mg/mL BSA的培养基以对装置进行钝化处理，并观察出口孔中的吸头，以监测微流控通道的填充情况（图2A）。将装置在室温下孵育约5分钟。
注意：BSA通常用作封闭或钝化试剂，可结合PDMS聚合物的疏水表面，增加其亲水性，减少其他蛋白质或细胞（通过细胞表面分子）的非特异性结合。 - 使用细胶加样吸头，将重悬的细胞（来自第4节）加入每个通道中，并利用出口通道中的吸头监测细胞在装置内的流动进程（图2B）。
注意：可通过将P200微量移液器调至最大200 µL体积，先吸取一段空气垫，再吸取少量细胞悬液（约等于吸头细端部分体积的一半）来促进加样。由于PDMS装置的体积相对于移液器较小，因此重悬细胞的体积无需精确。只要细胞悬液能够顺利移入装置，目前尚未发现细胞重悬浓度的上限。细胞团块可能堵塞装置，应通过充分吹打或涡旋混匀避免。 - 逐一轻轻地将出口孔中的加样吸头取出，以防止损坏装置。
- 将装置放入台式微量离心机中，使用合适的转子适配器，在约6,000 × g条件下离心10分钟（图2C）。
注意：本实验使用了定制加工的铝制转子适配器，可嵌入微量离心机转子中（图2C）；不同型号的离心机可配合相应的转子适配器使用。适配器的关键特性是能提供朝向细胞沟槽封闭端的侧向力，从而推动细胞进入侧通道。 - 在显微镜下检查加样是否成功（图3），但此时无需将装置固定在载物台支架/插片上。
注意：本方案中使用60倍、数值孔径1.4、Ph3相衬油镜物镜，用于此阶段的验证以及后续成像。
6. 装置组装、平衡与安装
- 将已加载的装置小心地安装到载物台插件上，方法是用胶带将PDMS两侧的盖玻片固定在载物台插件底部（即，在安装装置前先将载物台插件翻转）。翻转载物台插件-装置组件，使PDMS面朝上，并将其放置在柔软的表面上，例如无尘擦拭布（图2D）。
- 调节第一阶段注射泵的流速至35 µL/min。每次操作一个通道，先插入进样针，再插入出样针（即，连接至废液烧杯；图2E）。
- 用干净的无尘擦拭布擦去多余的培养基，并目视检查装置是否泄漏。检查出样管路中是否有过多细胞（通常表现为浑浊条带）以及培养基弯月面，其将缓慢向废液烧杯方向移动。
- 让装置在35 µL/min下运行约15–30分钟，直至所有连接的通道均流入废液烧杯。
- 将第一阶段注射泵设置为1.5 µL/min并暂停流速。将整个泵和装置组件移至显微镜处（此过程可通过将其放置在带轮推车上辅助完成），并在显微镜下以1.5 µL/min重新启动第一阶段培养基流动。使用胶带等必要手段，小心地将带有装置的载物台插件安装到倒置荧光显微镜上，并引导进样和出样管路。
- 在装置上定位所需的成像位置，并按需开始成像。请注意，细胞通常需要数小时（约10个世代）才能达到稳态指数生长期，可根据需要延迟图像采集的开始时间，以便在平衡期结束后再开始成像。
注意：在后续图像分析过程中，应通过追踪细胞分裂时间并确认其已达到恒定最小值，来验证处于指数生长期的细胞是否实现了稳态生长。
7. 培养基更换
- 在连续成像的间隔期间，暂停第一相注射泵的流体流动。小心地将夹子从第二相硅胶管上取下，并将其移至Y型接头第一相分支的硅胶管上。恢复第二相注射泵的流动（该流速已在步骤3.8中设定为1.5 µL/min），并继续成像。
注意：当流速为1.5 µL/min，且Y型接头下游连接有10 cm长的聚合物管时，第二相培养基约需50分钟到达芯片。可通过含有荧光示踪微粒的培养基进行实测以确定到达时间。
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结果
通过相差显微镜在将微流控管路连接至装置前评估，成功的初始细胞加载应表现为所有或几乎所有的微流控侧通道中均含有一个或多个细菌细胞（图3A）。理想加载状态下，每个通道中应可见多个细胞，但由于平衡期间细胞的生长，通道仍会逐渐被细胞填充（图3B）。对于加载效果较差的通道，即仅有较少（<50%）侧通道含有细胞的情况，仍可继续使用，但因在每个成像位置所捕获的细胞谱系数量较少，最终获得的数据密度将较低。
设备初次装入后，通过连接微流控管路并以相对较高的流速（35 µL/min）向设备内灌注培养基进行平衡。该平衡步骤旨在去除进样通道中的气泡和多余的细胞，并促进侧通道中的细胞开始生长。在培养基流动过程中，常可肉眼观察到被冲出设备的细胞形成浅色条带，沿出口管路向废液容器移动；此类条带的移动可作为流体在管路和设备中正常流动的视觉指示。对已完成平衡的设备进行...
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讨论
该微流控实验方案具有较高的灵活性，许多步骤均可进行修改，以优化其在特定物种、菌株或特定用途中的应用。事实上，本方案已对原始的"母机"概念4进行了改进，以优化其在B. subtilis中的使用。通常情况下，用于限制细胞的沟道为单层结构，而本方案采用的是双层细胞沟道，即在细胞周围设置浅层通道。双层结构的设计旨在最大化营养物质向B. subtilis细胞的输送以及代谢产物的排出，尤其适用于较长（>75 µm）的沟道5；然而，对于细胞的最佳生长，单层结构通常已足够，且在E. coli实验中更为常见，尤其是在沟道较短（约25 µm）的情况下4。我们通常使用较长的沟道，因为这可以降低由主供液通道中培养基流动所导致的B. subtilis细胞链被随机拉出沟道的频率5。
进一步的修改，例如使用具有不同特征尺寸的装置...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本项目由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为 GM018568。本实验方案部分在哈佛大学的纳米系统中心（CNS）完成，该中心是国家纳米技术协调基础设施网络（NNCI）的成员，由美国国家科学基金会（NSF）资助，资助编号为 1541959。CNS 隶属于哈佛大学。我们衷心感谢 Thomas Norman 和 Nathan Lord 在设计和制造本研究中所用器件的主模板以及搭建装置初始版本方面所做的工作。我们还感谢 Johan Paulsson 提供宝贵的协作建议，并感谢其实验室成员在细菌微流控装置方面的建议和持续改进。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Sylgard 184 硅酮弹性体试剂盒 | 道康宁 | (240)4019862 | 这在方案中称为PDMS。有两种组分，按10:1的比例混合。 |
| 0.75毫米活检打孔器 | World Precision Instruments | 504529 | |
| 22 x 40 mm 1.5号盖玻片 | VWR | 48393 172 | |
| Plasma Etch PE-50 | Plasma Etch 公司 | PE-50 | 使用氧气等离子体处理将PDMS与玻璃键合的仪器 |
| Tygon 柔性管，内径 0.02"，OD 0.06" | Saint-Gobain PPL 公司 | AAD04103 | 对于管路的主体部分，例如连接针头的部分 |
| 硅胶管，0.04" ID，0.085" OD | HelixMark 标准硅胶管 | 60-795-05 | 用于夹管阀和Y型接头连接 |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A7906-100G | 用作钝化剂 |
| ART凝胶加样吸头（P200） | 分子生物产品 | 2155 | 用于向装置中加入培养基和细胞 |
| Acrodisc 32-mm 注射器滤器，孔径 5-μm Supor 膜 | Pall Life Sciences | 4560 | 用于在上样至装置前过滤培养物 |
| 21 号钝针，1 个" | McMaster-Carr | 75165A681 | |
| Y型连接器，带200系列接头，1/16" ID导管，聚丙烯 | Nordson Medical | Y210-6005 | 该公司为 AKA Value Plastics |
| Eclipse Ti-E 倒置显微镜 | 尼康 | 该设备已由制造商停产，由 Ti 2 E 型号替代。 | |
| LB 肉汤（Lennox） | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Microfuge 18 | 贝克曼库尔特 | 367160 | |
| 枯草芽孢杆菌 菌株 NCIB3610 | 枯草芽孢杆菌遗传保藏中心 | 3A1 | 用于本实验方案所示实验的野生型亲本菌株 |
| 重力对流烘箱 | VWR | 414005-106 | 用于固化PDMS及烘烤组装后的装置 |
| Scotch-Weld 环氧树脂试剂盒 | 3M | 2216 B/A | 可用于将硅晶圆键合至铝制背板 |
| Scotch 透明胶带，3/4英寸" 宽度 | 3M | 用于清除PDMS装置上的灰尘，并覆盖在特征结构上以增强可见性（标记为 "办公胶带" 或 "胶带" 在方案中 | |
| 体视显微镜 | 尼康 | SMZ800N | 此处仅以该型号为例；几乎任何体视显微镜均可使用 |
| 异丙醇 | Sigma-Aldrich | W292907 | 清洁盖玻片 |
| 6通道注射泵 | New Era Pump Systems Inc. | NE-1600 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34120 | 一种无尘擦拭布品牌 |
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