通过变形性测量和红细胞异质性分析的ektacytometry方法研究血液中的红细胞特性

摘要

本文介绍了通过ektacytometry测量红细胞变形能力及细胞异质性的技术。这些技术适用于红细胞变形能力的常规研究，以及针对某些血液疾病的特定研究，这些疾病的特点是循环血液中同时存在刚性红细胞和可变形红细胞，例如镰状细胞贫血。

摘要

红细胞变形能力下降是多种疾病的特征。在某些情况下，变形能力缺陷的程度可以预测疾病的严重程度或严重并发症的发生。ektacytometry（激光衍射粘度法）通过测量红细胞在逐渐增加的剪切应力下，或在恒定剪切应力下经受渗透梯度时的变形能力来评估其变形性。然而，当检测含有刚性与可变形红细胞的异质性血液时，直接测量变形性难以解释，因为刚性细胞无法在剪切应力作用下正常排列，导致衍射图样发生扭曲，表现为表观变形性显著降低。对这种扭曲程度的测量可作为血液中红细胞异质性的指标。在镰状细胞贫血中，该指标与刚性细胞所占百分比相关，反映了红细胞内的血红蛋白浓度和血红蛋白组成。除了测量变形性外，渗透梯度ektacytometry还可提供有关红细胞渗透脆性和水合状态的信息。这些参数同样反映了镰状细胞患者红细胞的血红蛋白组成。ektacytometry测量的是红细胞群体的变形性，因此无法提供单个红细胞的变形性或力学特性的信息。尽管如此，本文所述技术的目标是提供一种便捷且可靠的血液变形性和细胞异质性测量方法。这些技术可用于监测多种疾病的时间变化、疾病进展以及对治疗干预的反应。镰状细胞贫血是一个已被充分表征的示例。其他可能需要关注红细胞变形性或异质性测量的潜在疾病包括血液储存、糖尿病、Plasmodium感染、缺铁性贫血以及由膜缺陷引起的溶血性贫血。

引言

变形红细胞计提供了一种便捷的方法，用于测量红细胞在剪切应力（单位为帕斯卡（Pa））或悬浮介质渗透压改变下的变形能力。与红细胞变形能力相关的关键参数包括最大伸长指数（EI Max），该参数反映红细胞在逐渐增加的剪切应力作用下所能达到的最大变形程度，以及剪切应力 ½ （SS ½达到半数最大变形所需剪切应力。¹ 渗透梯度变形红细胞计具有多个具有信息价值的参数。其中包括变形指数最小值（EI Min），用于反映细胞表面积与体积的比值，以及出现该最小值时的渗透压（O Min），后者用于评估红细胞的渗透脆性。变形指数最大值（EI Max）及其对应的渗透压（O (EI Max)）可提供有关细胞膜柔韧性和细胞表面积的信息。在渗透梯度高渗段中，半最大变形指数以EI hyper表示。EI hyper及其对应的渗透压（O hyper）可反映红细胞内黏度，后者主要由血红蛋白浓度决定。^2,3 在异质性血液中测量变形性具有挑战性，其原因在于刚性细胞（如镰状红细胞）在剪切应力增加时无法像可变形细胞那样沿流动方向正常排列。刚性细胞不会产生特征性的椭圆形衍射图像，而是形成球形衍射模式，当其与可变形细胞产生的椭圆图案叠加时，最终呈现为菱形衍射图样。^4,5,6 已通过密度梯度离心分离细胞组分后进行变形性测定（ektacytometry）证实，球形模式对应于不可逆镰状红细胞。⁶ 长轴指数的计算包含椭圆长轴和短轴的测量值；因此，菱形会通过增加短轴的宽度，导致伸长率出现明显的降低。⁷ 先前的研究表明，衍射图样畸变程度与镰状细胞贫血患者血液中镰状血红蛋白（HbS）的百分比以及镰状红细胞的百分比均存在相关性。⁵ 衍射图样畸变的程度可通过复杂的数学分析获得。⁸ 也可以通过调节ektacytometer上相机光圈的开度或拟合软件的灰度级别来改变衍射图样的高度。⁵ 然而，关于如何调整灰度级别的具体细节尚不明确，且最新一代商用变形红细胞计中的相机光圈不易接触。为解决这些问题，可利用易于调节的相机增益来调整衍射图样的高度。⁹ 利用该方法评估细胞异质性，衍射图样畸变程度可与镰状细胞贫血患者血液中胎儿血红蛋白的百分比相关联。¹⁰ 多种渗透梯度变形红细胞测定参数亦与镰状细胞贫血患者血液中胎儿血红蛋白或镰状血红蛋白百分比相关。衍射图样畸变的相关性可能反映了血红蛋白组成对循环中刚性、不可变形红细胞比例的影响。此外值得关注的是，整个渗透梯度变形红细胞测定曲线呈现双相性变化，与镰状细胞危象期间循环中高密度红细胞的百分比相对应。¹¹

变形红细胞测定法在其他多种疾病的研究所中同样具有重要价值。渗透梯度变形红细胞测定法可用于诊断遗传性红细胞膜病，如遗传性球形红细胞增多症、遗传性椭圆形红细胞增多症和遗传性热异形红细胞增多症。^3,12,13,14 铁缺乏时，红细胞变形能力下降。¹⁵ 特征描述 "储存损伤" 血液的病变性质及干预措施以防止其在储存过程中形成的研究，未来有望受益于本文所介绍的技术。¹⁶ 红细胞变形能力下降也与糖尿病中的微血管病变相关。¹⁷ 近期研究发现高血糖、红细胞内抗坏血酸浓度与渗透脆性之间存在关联，提示这些因素可能在微血管病变的发生发展中起重要作用。¹⁸ 正在进行的ektacytometry研究旨在验证这一假设（Parrow和Levine，未发表数据）。红细胞变形性的研究另一个有趣的方向是疟疾红细胞期感染。细胞变形性 恶性疟原虫 感染红细胞在疟原虫从环状体阶段发育至裂殖体阶段的48小时胞内成熟过程中，其变形能力显著下降。有证据表明，这种变形能力的降低在寄生虫成熟后会得到逆转，且逆转时机与感染红细胞释放入血液循环相一致。变形能力下降被认为是由 疟原虫 促进红细胞隔离的蛋白质¹⁹ 这些研究仅是临床重要疾病中与红细胞变形能力及渗透梯度参数测量相关的一小部分示例。此外还存在多个其他研究领域。

测量红细胞变形能力的其他替代技术包括光镊技术（也称为激光捕获），该技术利用光子的物理特性，沿一个或多个方向拉伸单个红细胞。²⁰ 此方法的优势在于可测量单个红细胞的变形能力，但由于施加力的校准存在一定不确定性，导致不同研究之间的结果差异较大²¹，且数据处理过程较为耗时，除非采用自动化分析²²。微吸管抽吸技术通过负压将红细胞吸入微吸管中，也被用于测量红细胞的变形能力^7,23。该方法可进行多种测量，例如吸入红细胞所需的压强，每一项测量参数均可反映红细胞的不同特性²³。原子力显微镜是一种高分辨率技术，通过量化激光束的偏转程度来反映悬臂在红细胞表面移动时的偏转，从而测定细胞膜的刚度²⁴。这些技术可提供有关单个红细胞的信息，但难以适用于红细胞群体变化的测量，且通常需要较高的专业技术水平。

同时获取单个细胞及细胞群体样本的需求推动了自动化技术的发展，并促进了微流控技术和基于阵列方法的进步。与ektacytometry类似，rheoscopy也通过显微镜直接成像来测量细胞在剪切应力作用下的变形能力²⁵。为了实现更高通量的分析，已采用自动细胞成像技术，利用rheoscope生成细胞变形能力的分布图²⁶。如果可以获得健康对照个体的数据，该方法可用于量化细胞异质性²⁷。微流控技术同样支持对单个细胞进行高通量分析；目前已开发出多种设计，包括基于过滤原理的装置²⁸、细胞通过时间分析仪²⁹（用于测量红细胞通过微孔所需的时间），以及测量红细胞通过所需压力而非时间的替代方法³⁰。另一种用于单细胞高通量分析的平台是单细胞微室阵列芯片，其额外优势在于可对细胞进行后续基于荧光的表征分析³¹。尽管上述每种技术都具有潜在应用价值，并可能在特定应用场景中表现更优，但ektacytometry的比较优势在于其高灵敏度、操作简便性和精确性³²。最新一代商用ektacytometer还具备高度灵活性，可执行多种不同类型的检测。

方案

本研究的所有受试者均按照《赫尔辛基宣言》的要求签署了书面知情同意书，研究方案经美国国立卫生研究院机构审查委员会批准。

1. 开启ektacytometer

1. 将清洗液的管路连接至低渗和高渗聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶液。注意将0渗透压管路连接至低渗溶液，500渗透压管路连接至高渗溶液。
   注意： 低渗PVP溶液的渗透压应为每千克35至55毫渗透摩尔（mOsm/kg），在25 °C时pH值为7.25–7.45，在37.0 ± 0.5 °C时黏度为27.0至33.0厘泊（cP）。高渗PVP溶液的渗透压应为764至804 mOsm/kg，在25 °C时pH值为7.25–7.45，在37.0 ± 0.5 °C时黏度为27.0–33.0 cP。
2. 确保转子完全浸入杯中。启动软件并进行仪器预冲洗（硬件检查 | 仪器输入/输出）。让仪器完成预冲洗循环。循环完成后，将转子从杯中取出，并使用低絮状清洁纸巾彻底擦干转子和杯体。
   注意： 残留水分会导致红细胞裂解，产生干扰。

2. 测量随剪切应力增加而变化的变形能力

1. 采集血液（少于 1 mL 的血量即可满足这些技术的重复实验需求），置于含有适当抗凝剂的试管中。
   注意：优先选择 EDTA 而非肝素，因为 EDTA 对血液流变学参数的影响较小。³³ 若在采血后 6 小时内进行测量，应将血液保存在室温条件下。
2. 测试前轻轻混匀全血样本，通过反复倒置试管数次实现。使用移液器将 25 µL 全血加入 5 mL 等渗 PVP 溶液中，盖紧试管并轻轻倒置数次以混匀。等渗 PVP 溶液的渗透压应在 284 至 304 mOsm/kg 之间，在 25 °C 时 pH 值为 7.3–7.4，在 37.0 ± 0.5 °C 时黏度为 27.0–33.0 cP。
3. 在软件主菜单中选择“变形性”（deformability）。创建新分析并添加实验细节（变形性 | 添加所需信息 | 确定）。
   1. 打开变形粘度计的盖子，确认浮子已完全降入杯中，且杯子正在旋转。
   2. 使用移液器将 1 mL PVP 血液溶液加入杯与浮子之间的空隙中。
   3. 轻微提起浮子使样品下沉。等待所有气泡从溶液中排出后，关闭变形粘度计的盖子。如有需要，按下抽吸按钮以帮助去除气泡。
4. 通过软件中的滚动条调节增益至 200（见注释）。当温度稳定在 37 °C 且衍射图像稳定时，按下开始按钮（开始）。
   注意：对于许多研究而言，使用增益设为 200 的相机，可从健康血液（血红蛋白浓度 > 12.0 g/dL，平均红细胞体积为 80–96 fL，平均红细胞血红蛋白浓度为 33–36 g/dL）获得良好的衍射图像。对于镰状细胞贫血患者的血液研究，建议将相机增益调整至生成 4.5 cm 的衍射图像，作为默认设置，以便在不同研究和实验室之间进行结果比较。⁹
5. 在数据采集过程中观察衍射图样，确保其保持圆形、椭圆形或菱形。数据采集完成后，保存或打印报告（文件 | 保存 或 文件 | 打印）。EI Max 和 SS ½ 值将自动报告，同时报告对应于用户指定或默认剪切应力的伸长指数。软件也将自动保存数据。
6. 实验结束后，在计算机显示器上的对话框中点击“清洗”选项（清洗）。待样品被抽吸后，在仪器处于清洗循环状态时，将去离子水喷入杯与浮子之间的空隙进行冲洗。清洗循环完成后，将浮子从杯中取出，并使用低绒清洁纸彻底擦干浮子和杯（关键：残留水分会导致红细胞裂解，产生干扰）。
7. 点击软件上的“主菜单”按钮返回主页面（主菜单）。

3. 测量细胞异质性

1. 检测前轻轻翻转采血管数次，使全血样本混匀。用移液器吸取25 µL全血加入一个新的含有等渗PVP溶液的5 mL试管中，盖紧管盖，轻轻翻转混匀，直至混合液均匀。
2. 从主菜单中选择“变形性”（Deformability）。创建一项新分析并添加实验细节（变形性 | 添加所需信息 | 确定）。
   1. 打开ektacytometer的盖子，确认转子已完全降入杯中，且杯子正在旋转。
   2. 将1 mL PVP血液溶液用移液器加入杯与转子之间的空隙中。
   3. 等待所有气泡从溶液中排出后，关闭ektacytometer的盖子。
   4. 确保屏幕上出现稳定的衍射图像。通过软件中的滚动条调节相机增益，移动箭头直至衍射高度达到3.8 cm。使用直尺测量计算机屏幕上图像的高度以确认。
3. 当温度稳定在37 °C且衍射图像稳定时，按下开始按钮（开始）。
4. 在数据采集过程中观察衍射图样，确保其保持圆形、椭圆形或菱形。数据采集完成后，保存或打印报告（文件 | 保存 或 文件 | 打印）。
5. 实验结束后，点击计算机显示器上对话框中的“清洗”选项（Clean）。待仪器将样品吸出后，在清洗循环持续进行时，用洗瓶向杯与转子之间的空隙喷入去离子水进行冲洗。清洗循环完成后，将转子从杯中提起，并使用低绒擦拭纸彻底擦干转子和杯体（关键：残留水分会导致红细胞破裂，产生干扰）。
6. 重复步骤2.1–2.5，并调节相机增益以获得4.5 cm的衍射图样高度（步骤2.2）。
7. 重复步骤2.1–2.5，并调节相机增益以获得5.4 cm的衍射图样高度（步骤2.2）。
8. 实验结束后，点击主菜单按钮返回软件主界面（主菜单）。
9. 为根据EI Max以百分比形式确定衍射图样畸变程度，请使用以下公式（如需要，也可使用4.5 cm衍射图样高度的数据进行相同计算）：
   
10. 同理，为根据SS1/2确定衍射图样畸变程度，可使用相同公式代入报告的SS1/2数值进行计算：
    

4. 渗透梯度变形红细胞测定法

1. 按照1.1所述方法获取样本。检测前将全血样本轻轻颠倒数次以混匀。使用移液器将250 µL全血加入5 mL等渗PVP小瓶中，盖紧瓶盖后轻轻颠倒混匀，直至混合物均匀。
2. 从主菜单中选择osmoscan（Osmoscan）。将含有血液-PVP溶液的小瓶置于仪器左侧针头正下方。降低针头直至接触小瓶底部。确保管道已正确连接至低渗和高渗溶液，以形成渗透梯度。关闭ektacytometer的盖子，并打开下半部分的门，以便观察血液进入管道的过程。
3. 按下“新建分析”并输入实验信息（Osmoscan | 新建分析 | 输入所需信息 | 确定）。在软件界面上调节相机增益至200，运行仪器直至在计算机屏幕上观察到血液从仪器下方管道进入杯中。
   1. 当血液进入杯中且计算机屏幕上出现稳定的衍射图样时，点击对话框中的“立即开始”按钮以启动数据采集（开始现在）。
4. 让ektacytometer持续采集数据至约500 mOsm/kg，然后停止仪器。保存或打印报告（文件 | 保存 或 文件 | 打印）。数据也将自动保存。
5. 移除旧的PVP-血液小瓶。更换为一个洁净并装有去离子水的小瓶。将其置于针头下方，降下针头使其接触小瓶底部，然后按下对话框中的“冲洗”按钮以冲洗梯度系统（Rinse）。
6. 冲洗完成后，按下计算机显示器上对话框中的“清洁”选项（Clean）。清洁循环结束后，将转子从杯中取出，并使用低绒毛清洁纸巾彻底擦干转子和杯体（关键：残留水分会导致红细胞溶血，产生干扰）。
   注意： osmoscan报告提供在整个渗透梯度范围内的伸长指数。EI Min, O（EI Min）、EI Max, O（EI Max）、EI hyper 和 O hyper 由系统自动生成并包含在报告中。来自9名健康志愿者血液样本测得的渗透梯度ektacytometry参数范围如下：EI Min 0.12–0.196任意单位（a.u.）；O Min 117–144 mOsm/kg；EI Max 0.551–0.573 a.u.；O (EI Max) 272–312 mOsm/kg；EI hyper 0.278–0.286；O Hyper 454–505 mOsm/kg。

5. 关闭ektacytometer

1. 关闭仪器前应正确清洁仪器。
   1. 为此，请将低渗和高渗溶液的管路连接到通向清洗液的Y型接头。将一个装有清洗液的小瓶放在机器左侧针头下方，并降低针头直至接触小瓶底部。确保转子完全浸入杯中。
   2. 关闭软件，然后按下计算机显示器上“每日结束清洁”对话框中的“开始”按钮（关闭 | 开始）。让仪器完成整个清洗循环过程。
2. 断开通向废液瓶的管路，并将其从仪器上取下以处理废液。彻底干燥转子。关闭仪器电源。

结果

本手稿中描述的ektacytometry结果可用于测量任何条件下红细胞的变形能力。图1展示了ektacytometer的一般设置示意图。在逐渐增加的剪切应力作用下，均一的红细胞群体将产生椭圆形的衍射图样，据此可计算伸长指数，如图2所示。在异质性血液样本中，由于刚性红细胞无法与可变形细胞正常对齐，会产生球形图样并叠加于椭圆之上，从而形成菱形的衍射图样，导致衍射图样发生畸变。随着相机增益的调整使衍射图样尺寸增大，这种畸变图样将更易被检测到，如图3所示。在健康志愿者中所见的均一血液群体，当测量不同大小的衍射图样时，并不会产生不同的变形能力曲线（图4A）。相比之下，异质性血液群体（如镰状细胞贫血患者的血液）则显示出变形能力测量值随衍射图样尺寸增大而显著下降（图4）。在镰状细胞血液中，当...

讨论

所描述的ektacytometry技术简便且高度自动化，可确保获得有效且可重复的结果。然而，仍存在一些关键步骤。血液温度的适当控制至关重要。血液在室温下储存超过八小时可能会影响SS ½值。³⁴ 确保仪器温度稳定在37 °C同样重要，因为悬浮介质的黏度具有温度依赖性。血液样本应充分氧合，以避免因未氧合或部分氧合样本导致的变形能力降低，除非这些状态是实验关注的参数。³⁵ 从仪器操作角度来看，仪器的彻底清洁至关重要，以确保管道或转子入口处无残留的聚乙烯吡咯烷酮（PVP），因为PVP在干燥后会硬化，从而堵塞仪器内的液体流动。关注这些细节将有助于获得准确的结果，并保持仪器的良好运行状态。

细胞异质性的量化可能需要进行调整。在3.8 cm的衍射图样中，某些样品在最高剪切应力下可能出现伸长指数急剧下降的情况。这种情况有时可通过使用新鲜样品重复测量来克服。否则，可采用较低剪切应力下的伸长指数值来测量衍射图样畸变的程度，或改用4.5 cm的衍射图样。⁹ 此外...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
LoRRca MaxSis 标准版	机电一体化	LORC109000
LoRRca MaxSis Osmoscan	机电一体化	LORC109001
聚乙烯吡咯烷酮溶液 (PVP) 0 mOsm	机电一体化	QRR030910
聚乙烯吡咯烷酮溶液 (PVP) 500 mOsm	机电一体化	QRR030930
聚乙烯吡咯烷酮溶液 (PVP) 5 mL 小瓶	机电一体化	QRR030901
X clean	机电一体化	QRR010946
P1000	MilliporeSigma	Z646555
P200	MilliporeSigma	Z646547
P200 滤芯吸头	MidSci	AV200-H
P1250 滤芯吸头	MidSci	AV1250-H
Kimwipes 纸巾	MidSci	8091
1.5 mL 离心管	MidSci	AVSS1700
15 mL 锥形管	MidSci	C15R