本文介绍了通过ektacytometry测量红细胞变形能力及细胞异质性的技术。这些技术适用于红细胞变形能力的常规研究，以及针对某些血液疾病的特定研究，这些疾病的特点是循环血液中同时存在刚性红细胞和可变形红细胞，例如镰状细胞贫血。
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方法文章
通过变形性测量和红细胞异质性分析的ektacytometry方法研究血液中的红细胞特性
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
红细胞变形能力下降是多种疾病的特征。在某些情况下，变形能力缺陷的程度可以预测疾病的严重程度或严重并发症的发生。ektacytometry（激光衍射粘度法）通过测量红细胞在逐渐增加的剪切应力下，或在恒定剪切应力下经受渗透梯度时的变形能力来评估其变形性。然而，当检测含有刚性与可变形红细胞的异质性血液时，直接测量变形性难以解释，因为刚性细胞无法在剪切应力作用下正常排列，导致衍射图样发生扭曲，表现为表观变形性显著降低。对这种扭曲程度的测量可作为血液中红细胞异质性的指标。在镰状细胞贫血中，该指标与刚性细胞所占百分比相关，反映了红细胞内的血红蛋白浓度和血红蛋白组成。除了测量变形性外，渗透梯度ektacytometry还可提供有关红细胞渗透脆性和水合状态的信息。这些参数同样反映了镰状细胞患者红细胞的血红蛋白组成。ektacytometry测量的是红细胞群体的变形性，因此无法提供单个红细胞的变形性或力学特性的信息。尽管如此，本文所述技术的目标是提供一种便捷且可靠的血液变形性和细胞异质性测量方法。这些技术可用于监测多种疾病的时间变化、疾病进展以及对治疗干预的反应。镰状细胞贫血是一个已被充分表征的示例。其他可能需要关注红细胞变形性或异质性测量的潜在疾病包括血液储存、糖尿病、Plasmodium感染、缺铁性贫血以及由膜缺陷引起的溶血性贫血。
引言
ektacytometry 可便捷地测量红细胞在剪切应力（单位为帕斯卡（Pa））或悬浮介质渗透压改变下的变形能力。红细胞变形能力的相关参数包括最大伸长指数（EI Max），即红细胞在递增剪切应力作用下所能达到的最大变形程度，以及剪切应力 ½ （SS ½达到最大变形度一半所需的剪切应力。1 渗透梯度变形指数测定法具有多个信息性参数。包括最小伸长指数（EI Min），用于反映细胞表面积与体积的比值，以及其对应的渗透压（O Min），用于评估红细胞的渗透脆性。EI Max及其对应的渗透压（O (EI Max)）可提供关于细胞膜柔韧性和细胞表面积的信息。在渗透梯度的高渗支中，半最大伸长指数以EI hyper表示。EI hyper及其对应的渗透压（O hyper）可反映红细胞内黏度，后者由血红蛋白浓度决定。2,3 在异质性血液中测量变形能力较为复杂，其原因是刚性红细胞（如镰状红细胞）在受到逐渐增加的剪切应力时，无法像可变形红细胞那样沿流动方向正常排列。刚性红细胞不产生特征性的椭圆形衍射图像，而是形成球形图案，当其与可变形红细胞产生的椭圆图案叠加时，最终呈现为菱形的衍射图样。4,5,6<....
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方案
本研究的所有受试者均按照《赫尔辛基宣言》的要求签署了书面知情同意书，研究方案经美国国立卫生研究院机构审查委员会批准。
1. 开启ektacytometer
- 将清洗液的管路连接至低渗和高渗聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶液。注意将0 osmolar管路连接至低渗溶液，将500 osmolar管路连接至高渗溶液。
注意： 低渗PVP溶液的渗透压应介于35至55毫渗摩尔/千克（mOsm/kg）之间，pH值为7.25–7.45，于 25 °C 黏度在 37.0 ± 0.1 °C 下介于 27.0 至 33.0 厘泊（cP）之间 0.5 °C高渗PVP溶液的渗透压应介于764至804 mOsm/kg之间，pH值为7.25–7.45。 25 °C 黏度测定值为 27.0–33.0 cP 37.0 ° 0.5 °C. - 确保摆锤完全放入杯中。启动软件并初始化仪器（硬件检查 | 仪器输入输出）。让仪器完成引灌循环。循环完成后，将转子从杯中取出，并使用低絮纤维擦拭纸彻底擦干转子和杯。
注意： 残留的水会裂解红细胞，从而产生干扰。
2. 测量随剪切应力增加而变化的变形能力
- 在含有适当抗凝剂的试管中采集血液（少于 1 mL 的血量足以完成这些技术的重....
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结果
本论文中描述的ektacytometry结果可用于测量任何条件下红细胞的变形能力。图1展示了ektacytometer的一般设置示意图。在逐渐增加的剪切应力作用下，均一的红细胞群体将产生椭圆形的衍射图样，据此可计算延长指数，如图2所示。在异质性血液样本中，由于刚性红细胞无法与可变形细胞正常对齐，会产生球形图样并叠加在椭圆上，从而形成菱形的衍射图样，导致衍射图样发生畸变。随着相机增益的调整使衍射图样尺寸增大，这种畸变图样将更易被检测到，如图3所示。在健康志愿者中所见的均一血液群体，当测量不同大小的衍射图样时，其变形能力曲线不会出现差异（图4A）。相反，异质性血液群体（如镰状细胞贫血患者血液）的变形能力测量值则会随着衍射图样尺寸的增大而显著降低（图4）。在镰状细胞血液中，当以EI .......
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讨论
所描述的ektacytometry技术简便且高度自动化，可确保获得有效且可重复的结果。然而，仍存在一些关键步骤。血液温度的适当控制至关重要。血液在室温下储存超过八小时可能会影响SS ½值。34 确保仪器温度稳定在37 °C同样重要，因为悬浮介质的黏度具有温度依赖性。血液样本应充分氧合，以避免因未氧合或部分氧合样本导致的变形能力降低，除非这些状态是实验关注的参数。35 从仪器操作角度来看，仪器的彻底清洁至关重要，以确保管道或转子入口处无残留的聚乙烯吡咯烷酮（PVP），因为PVP在干燥后会硬化，从而堵塞仪器内的液体流动。关注这些细节将有助于获得准确的结果，并保持仪器的良好运行状态。
细胞异质性的量化可能需要进行调整。在3.8 cm的衍射图样中，某些样品在最高剪切应力下可能出现伸长指数急剧下降的情况。这种情况有时可通过使用新鲜样品重复测量来克服。否则，可采用较低剪切应力下的伸长指数值来测量衍射图样畸变的程度，或改用4.5 cm的衍射图样。9 此外.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由美国国立糖尿病、消化与肾脏疾病研究所和国立心肺血液研究所（隶属于美国国立卫生研究院）的院内研究计划资助。文中表达的观点仅为作者个人观点，不代表美国国立卫生研究院的官方立场。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| LoRRca MaxSis 标准版 | 机电一体化 | LORC109000 | |
| LoRRca MaxSis Osmoscan | 机电一体化 | LORC109001 | |
| 聚乙烯吡咯烷酮溶液 (PVP) 0 mOsm | 机电一体化 | QRR030910 | |
| 聚乙烯吡咯烷酮溶液 (PVP) 500 mOsm | 机电一体化 | QRR030930 | |
| 聚乙烯吡咯烷酮溶液 (PVP) 5 mL 小瓶 | 机电一体化 | QRR030901 | |
| X clean | 机电一体化 | QRR010946 | |
| P1000 | MilliporeSigma | Z646555 | |
| P200 | MilliporeSigma | Z646547 | |
| P200 滤芯吸头 | MidSci | AV200-H | |
| P1250 滤芯吸头 | MidSci | AV1250-H | |
| Kimwipes 纸巾 | MidSci | 8091 | |
| 1.5 mL 离心管 | MidSci | AVSS1700 | |
| 15 mL 锥形管 | MidSci | C15R |
参考文献
- Bessis, M., Mohandas, N., Feo, C. Automated ektacytometry: a new method of measuring red cell deformability and red cell indices. Blood Cells. 6 (3), 315-327 (1980).
- Clark, M. R., Mohandas, N., Shohet, S. B. Osmotic gradie....
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