Ektacytometry 血中红细胞异质性的测定

Summary

在这里, 我们提出的技术, 以测量红细胞变形性和细胞异质性的 ektacytometry。这些技术适用于红细胞变形性的一般调查和血液疾病的具体调查, 特点是刚性和变形红细胞在循环中存在, 如镰状细胞贫血。

Abstract

红细胞变形性降低是几种疾病的特点。在某些情况下, 缺陷变形的程度可以预测疾病的严重性或严重并发症的发生。Ektacytometry 使用激光衍射粘测量红细胞的变形性, 受剪切应力或渗透梯度的作用。然而, 在测量具有刚性和可变形红细胞的特征的异质血液时, 直接变形测量很难解释。这是由于刚性细胞不能适当地对齐, 以响应剪应力和结果在扭曲的衍射模式, 显着减少明显的变形。畸变程度的测量提供了血液中红细胞异质性的指标。在镰状细胞性贫血中, 这与刚性细胞的百分比相关, 这反映了红细胞的血红蛋白浓度和血红蛋白组成。除了测量变形性外, 渗透梯度 ektacytometry 还提供了有关红细胞渗透脆性和水合状态的信息。这些参数也反映了镰状细胞患者红细胞的血红蛋白组成。Ektacytometry 测量红细胞的变形性, 因此不提供单个红细胞的变形性或力学性质的信息。无论如何, 本文所描述的技术的目的是为测量血液的变形性和细胞非均质提供一种方便和可靠的方法。这些技术可能有助于监测时间变化, 以及疾病进展和治疗干预的反应, 在一些疾病。镰状细胞性贫血是一个良好的例子。其他可能的疾病, 如红细胞变形性和/或异质性的测量感兴趣的是血液储存, 糖尿病,疟原虫感染, 铁缺乏, 和溶血贫血由于膜缺陷。

Introduction

Ektacytometry 提供了一个方便的测量红细胞变形性的反应, 改变剪切应力 (测量在帕斯卡 (Pa)) 或悬浮介质渗透。红细胞变形性的相关参数包括最大伸长指数 (EI 最大值), 一种对红细胞最大变形性的测量, 以响应增加的剪应力, 剪切应力½ (SS ½), 所需的剪切应力达到半最大变形.¹渗透梯度 ektacytometry 有几个信息参数。这些包括伸长指数最小值 (EI 最小值)、表面积比的测量和发生的渗透 (O min), 这是渗透脆性的量度。ei 最大和渗透的发生 (O (ei max)) 提供了有关膜的灵活性和细胞表面积的信息。渗透梯度高渗臂的半最大伸长率以 EI 超高为代表。EI 超和渗透, 它发生, O 超, 提供信息的细胞内粘度的红细胞, 这是由血红蛋白浓度确定。^2,3测量异质血液中的变形性是复杂的, 因为刚性细胞, 如镰红细胞, 不能与流动方向 (如变形细胞) 相适应, 以增加剪切应力。刚性细胞不是产生一个特征性的椭圆形衍射图像, 而是产生一个球形图案, 当叠加在变形细胞产生的椭圆上时, 会形成菱形衍射图样。^4,5,6通过对密度离心后分离的细胞片段进行 e....

Protocol

本研究的所有科目都根据《赫尔辛基宣言》和国家卫生研究院机构审查委员会批准的议定书, 给予书面知情同意。

1. 打开 ektacytometer

1. 将清洗液的油管连接到低、高渗酮 (PVP) 解决方案。小心连接0渗管到低渗溶液和500渗管到高渗溶液。
   注意:低渗 PVP 解决方案应该有一个渗透在35和 55 milliosmoles 每千克 (mOsm/千克), pH 7.25-7. 45 在25° c 和黏度在27.0 和33.0 厘 (cP) 之间在37.0 ±0.5 ° c。高渗 PVP 解决方案应该有一个渗透在764和 804 mOsm/千克之间, pH 值为 7.25-7. 45 在25° c 和黏度措施 27.0-33.0 cP 在37.0 °0.5 ° c。
2. 确保鲍勃被完全调到杯子里。启动软件和素数的机器 (硬件检查 |仪器 IO)。允许仪器完成启动周期。一旦循环完成, 把鲍勃从杯中取出, 并完全干燥的鲍勃和杯与低皮棉清洁组织。
   注意:残余水会溶解红细胞, 产生干扰。

2. 测量变形性作为增加剪切应力的函数

1. 获得血液 (少于1毫升是足够的执行这些技术与复制) 在瓶中含有适当的抗凝剂。
   注意:

Results

本手稿中描述的 ektacytometry 结果可用于测量任何条件下的红细胞变形能力。ektacytometer 的一般设置示意图如图 1所示。红细胞的均匀种群将产生一个椭圆形的衍射模式, 以响应增加的剪切应力, 可用于计算伸长率指数, 如图 2所示。在异质血样中, 由于刚性红细胞与变形细胞不协调, 产生了一个球面图案, 覆盖椭圆, 形成菱形衍射图样, 所以衍射模式失真。随着相机增益被调整以生成更大的衍射图案尺寸, 如图 3所示, 这种失真的模式越来越被检测到。在健康志愿者中发现的均匀血量, 在测量不同的衍射尺寸时不会产生不同的变形曲线 (图 4A)。相比之下, 来自镰状细胞性贫血患者的血液等异质性血液的数量在变形测量中表现出显著的降低, 如衍射图样大小的函数 (图 4)。在镰.......

Discussion

所描述的 ektacytometry 技术简单明了, 自动化程度很好, 确保了有效和可重现的结果。尽管如此, 还是有一些关键的步骤存在。正确的血液温度控制是很重要的。室温贮存超过八小时可能影响 SS ½值。³⁴确保机器的温度在37° c 时保持稳定也很重要, 因为悬浮介质的粘度是温度依赖性的。血液应充分含氧, 以避免因 non-oxygenated 或部分含氧样品而降低变形, 除非这些都是实验性的兴趣参数。³⁵从仪器的角度来看, 适当的清洗仪器是至关重要的, 以确保没有 PVP 留在油管或入口点的鲍勃, 因为它会硬化后, 干燥和堵塞流体流经仪器。注意这些细节将促进准确的结果, 并保持仪器在良好的运行状态。

细胞异质性的量化可能需要修改。在 3.8 cm 衍射模式中, 一些样品可能在最高剪应力下的伸长指数出现陡峭的下降。这有时可以通过重复测量与一个新鲜的样本来克服。否则, 可使用较低剪应力的伸长指数值或 4.5 cm 衍射图样来测量衍射图样失真的程度。^9.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
LoRRca MaxSis 标准型	机电一体化	LORC109000
LoRRca MaxSis 渗透式	机电一体化	LORC109001
聚乙烯吡咯烷酮溶液 （PVP） 0mOsm	机电一体化	QRR030910
聚乙烯吡咯烷酮溶液 （PVP） 500mOsm	机电一体化	QRR030930
聚乙烯吡咯烷酮溶液 （PVP） 5mL西林瓶	Mechatronics QRR030901
X 洁净	Mechatronics	QRR010946
P1000	MilliporeSigma	Z646555
P200	MilliporeSigma	Z646547
P200 滤芯吸头	MidSci	AV200-H
P1250 滤芯吸头	MidSci	AV1250-H
Kimwipes	MidSci	8091
1.5 mL eppendorf 管	MidSci	AVSS1700
15 mL 锥形瓶	MidSci	C15R