本文介绍一种无需使用新设备即可提高嵌合体生产效率的实验方案。通过简单改变胚胎注射时的方位,可增加所获得胚胎的数量,并可能缩短种系传递的时间进程。
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本文介绍一种无需使用新设备即可提高嵌合体生产效率的实验方案。通过简单改变胚胎注射时的方位,可增加所获得胚胎的数量,并可能缩短种系传递的时间进程。
为了提高通过胚胎干细胞技术制备基因修饰小鼠的效率,我们对现有的囊胚注射方案进行了改进。本文报道,通过简单旋转胚胎,并经由穿过内细胞团(Trans-Inner cell mass, TICM)的路径进行注射,可将嵌合小鼠的比例从31%提高至50%,且无需额外设备或进一步的专业培训。在为期9个月的时间内,共对26种不同的近交系克隆及总计35个克隆进行了注射。传统注射方法与TICM方法在妊娠率和胚胎回收率方面均无显著差异。因此,在不显著改变注射流程的前提下,仅需简单调整囊胚的位置并通过内细胞团注射,将胚胎干细胞释放至囊胚腔内,就有可能提高嵌合体小鼠的产量及其后续的种系传递效率。
近25年来,构建基因靶向小鼠的过程一直较为缓慢,通常受限于囊胚期胚胎干细胞显微注射阶段,该步骤在产生可种系传递的嵌合体小鼠过程中形成了瓶颈。近年来的技术进步,包括在胚胎干细胞中应用CRISPR/Cas91,2进行靶向编辑,以及KOMP等高通量胚胎干细胞构建联盟的建立,已显著改善了基因修饰胚胎干细胞的生成与可获得性。然而,从这些胚胎干细胞产生可种系传递的嵌合体小鼠仍是构建基因修饰小鼠过程中的主要瓶颈3,4。高通量胚胎干细胞构建项目一直受到胚胎干细胞质量差异较大的困扰,而细胞质量对于成功生成可种系传递的嵌合体至关重要。此外,一些常用的胚胎干细胞系已知存在较高的非整倍性,且难以产生具有种系传递能力的嵌合体5。
人们已开发出多种方法来制备嵌合程度更高或完全由胚胎干细胞(ES细胞)来源的小鼠6,7,8,9,
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所有操作均在国家环境健康科学研究所基因敲除小鼠核心设施的正常运行过程中完成。所有小鼠均维持在12小时光照:12小时黑暗的循环条件下,并可自由摄取NIH-31饲料和水。ad libitum. 所有实验均依照国家环境健康科学研究所动物护理与使用委员会的规定进行。
1. 动物准备
2. 胚胎干细胞准备
3. 胚胎收集
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将细胞系作为随机效应,使用混合效应线性模型在软件中分析数据(例如 SAS(版本 9.2))。每次分析均对移植的胚胎数量和细胞系进行校正。第二次分析还对存活的仔鼠数量进行了校正。
本研究中,每种ES细胞系及克隆均采用传统方法和TICM技术分别进行注射,每次注射后交替使用两种方法。注射完成后,将胚胎在培养皿中分开,并按移植批次分组,通常每只受体雌鼠移植12至15枚胚胎。若胚胎无明显可见的囊胚腔、缺少透明带,或显微注射的ES细胞未能进入囊胚腔,则从实验中剔除。
首先检测的数据是妊娠率。如图3所示,TICM组与对照组的妊娠率没有差异。此外,两组幼仔存活至断奶的比例也相同(P = 0.50,图4)。最重要的是,尽管断奶时小鼠.......
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长期以来,人们一直认为内细胞团(ICM)的任何扰动都可能导致胚胎死亡,事实上,目前的囊胚显微注射方案仍然对此提出警示12,13。我们在此证明,通过内细胞团进行显微注射并不会对胚胎造成损害,并且能够提高嵌合体的获得率。
这种效应的确切机制尚未明确。然而,对内细胞团(ICM)及其伴随的下胚层进行机械性扰动,可能会增加显微注射后外源胚胎干细胞整合到新形成内细胞团中的概率。近期在诱导多能干细胞(iPSC)领域的研究表明,机械刺激有助于人类iPSC的重编程过程14。如果机械操作对小鼠胚胎的内细胞团具有类似作用,则可能使那些已开始分化的内细胞团细胞恢复至多能状态,从而消除囊胚供体来源细胞在形成胚胎组织时可能具有的“先发优势”。最后,显微注射穿过内细胞团的过程可能导致部分内细胞团细胞死亡,从而降低基因修饰胚胎干细胞在植入后所面临的竞争水平。
该方法改进的主要优势在于无需学习新技.......
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作者无任何竞争利益需要披露。
本研究得到了美国国立卫生研究院(NIH)国家环境健康科学研究所内部研究计划的部分支持。特别感谢Shyamal Peddada提供的统计分析。我们还要感谢Humphrey Yao、Gary Bird和Yuki Arao对本文手稿的审阅,以及Franco DeMayo持续的支持与指导。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| ES细胞注射针 | Humagen | MSC-20-0 | |
| NSET装置 | Paratechs | 60010 | |
| DMEM | Gibco (life technologies) | 11965-092 | |
| FBS | Gibco (life technologies) | 10439-024 | 每批应单独测试其对ES细胞的兼容性。 |
| HEPES | Sigma | H0887 | |
| β-巯基乙醇 | Sigma | M7522 | |
| 显微操作仪 | Leica | Micro manipulator | |
| 显微注射仪 | Eppendorf AG | Cell Tram Air 5176 | |
| 显微镜 | Leica | DM IRB | |
| 4孔培养皿 | Thermo Scientific | 176740 | |
| 60 mm培养皿 | Sarstedt | 83.3901 | |
| B6(Cg)-Tyr<c-2J>/J | Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA | 000058 | |
| Swiss Webster小鼠 | Taconic, USA | Tac:SW | |
| 注射用培养皿 | MatTek Corp. | P50G-0-30-F |
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