本文介绍了一种优化的高通量染色质免疫沉淀测序（ChIP-sequencing）实验方案及相应的计算分析流程，用于从冻存的肿瘤组织和细胞系中确定全基因组范围内的染色质状态模式。
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本文内容
摘要
摘要
组蛋白修饰是表观基因组的重要组成部分，在决定相关基因座转录状态方面发挥着关键的调控作用。此外，特定修饰的存在已被用于确定非编码功能元件（如增强子）的位置和性质。近年来，染色质免疫沉淀联合高通量测序（ChIP-seq）已成为绘制全基因组范围内单个组蛋白修饰图谱的有力工具。然而，越来越多的研究表明，染色质修饰的组合模式（即染色质状态）决定了相关基因组位点的身份和特性。因此，需要建立包含高效高通量（HT）实验方法的工作流程，以同时分析多种组蛋白修饰标记，并结合能够处理大量ChIP-Seq数据集的计算分析流程，从而在大量样本中全面确定表观基因组状态。本文所介绍的高通量ChIP-Seq工作流程包含两个模块：1）一种可在96孔板格式下，利用少量肿瘤组织样本和细胞系材料同时检测多种组蛋白修饰的实验方案；2）一个整合现有工具的计算数据分析流程，用于分析单个修饰标记的占据情况以及组合型染色质状态模式。这两个模块共同实现了对数百个ChIP-Seq样本的快速、高效处理。本工作流程已被用于从黑色素瘤肿瘤和细胞系的6种组蛋白修饰图谱中推导染色质状态模式。总体而言，我们提出了一种全面的ChIP-seq工作流程，可应用于数十个人类肿瘤样本和癌细胞系，以鉴定多种恶性肿瘤中的表观基因组异常。
引言
哺乳动物基因组的大部分（98%–99%）由非编码序列组成，这些非编码区域包含已知参与调控基因表达和染色质组织的调控元件1,2。在正常细胞中，基因组DNA特异性地组装成紧密的染色质结构，对于各种DNA相关过程的空间组织、调控及精确时序至关重要3,4,5。然而，在癌细胞中，异常的表观遗传机制引起的染色质修饰可导致染色质结构的异常组织，包括调控元件的可及性、染色体成环系统以及基因表达模式的改变6,7,8,9,10。
尽管近年来取得了一些进展，但我们对与肿瘤进展或治疗反应相关的表观遗传学改变仍知之甚少。表观基因组由多种修饰组成，包括组蛋白修饰和DNA甲基化，这些修饰共同形成一种动态状态（称为染色质状态），进而影响基因表达网络及其他对维持细胞身份至关重要的生物学过....
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方案
所有临床标本的采集均遵循机构审查委员会的指南。
1. 缓冲液的配制
- 配制 200 mL TE 缓冲液（10 mM Tris-HCl，10 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）pH 8.0）。
- 配制 200 mL STE 缓冲液（10 mM Tris-HCl，10 mM EDTA pH 8.0，140 mM NaCl）。
- 配制 200 mL 2.0 M 甘氨酸溶液（37.52 g 甘氨酸溶于 200 mL 水中），并加热至 65 °C。
- 配制 200 mL 5% 脱氧胆酸钠（DOC）溶液（10 g DOC 溶于 200 mL 水中）。
- 配制 500 mL ChIP 收获缓冲液（12 mM Tris-Cl，0.1× 磷酸盐缓冲液（PBS），6 mM EDTA，0.5% 十二烷基硫酸钠（SDS））。
- 配制 500 mL ChIP 稀释缓冲液（10 mM Tris-Cl，140 mM NaCl，0.1% DOC，1% Triton-X，1 mM EDTA）。
- 配制 500 mL RIPA 洗涤缓冲液（STE，1% Triton x-100，0.1% SDS，0.1% DOC）。
- 配制 500 mL RIPA/500 洗涤缓冲液（RIPA 缓冲液 + 360 mM NaCl）。
- 配制 500 mL LiCl 洗....
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结果
该方案允许从冷冻肿瘤组织和细胞系中进行免疫沉淀，可采用高通量方法并行处理数十个样本 (图1A)染色质片段大小应在约200–1000 bp之间，以获得最佳免疫沉淀效果。我们注意到，不同组织和细胞类型达到相同剪切长度所需的时间有所不同。从少量组织中成功进行ChIP的关键在于始终保持裂解物处于低温状态，尤其是在超声处理过程中。在进行文库构建之前，应定量纯化的ChIP-DNA。图2A）。适用于多重测序和高通量测序（NGS）的完整文库片段大小应介于约 200 - 600 bp 之间，且不含任何引物二聚体 (图2B). 测序后，需满足多项质控指标，方可进入后续分析流程，例如 MACS 峰识别或 ChromHMM 分析 (图3)许多这些指标可使用 F.......
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讨论
本实验方案描述了一种完整且全面的高通量ChIP-seq模块，用于在全基因组范围内绘制人类肿瘤组织和细胞系中的染色质状态。在任何ChIP-seq方案中，最关键的步骤之一是抗体的特异性。本文所述方法展示了针对六种组蛋白修饰的免疫沉淀条件，这些抗体均为适用于ChIP实验级别，并已在本实验室及其他实验室中得到先前验证42,44,45。尽管相同的抗体浓度已成功应用于多种其他肿瘤类型，但在研究不同目标因子时，确定抗体特异性至关重要27。
成功实验的另一个关键方面是优化超声处理条件。超声时间因样本和组织类型的不同而有所差异，需相应调整。为实现适当优化，应针对每个样本进行预实验，通过逐步增加超声时间并持续检测片段大小来确定最佳条件。在初始ChIP实验中，染色质片段的理想大小范围应为约200–1000 bp，以实现最佳免疫沉淀效果；在进行文库构建前，应定量纯化的ChI.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
感谢 Marcus Coyle、Curtis Gumbs 以及 MDACC 的 SMF 核心设施在测序方面提供的支持。本文所述工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金（CA016672）对 SMF 核心设施的资助，以及美国国家癌症研究所（NCI）奖项（1K99CA160578 和 R00CA160578）对 K. R. 的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| ChIP级H3K4me1抗体 | Abcam | ab8895 | |
| ChIP级H3K27ac抗体 | Abcam | ab4729 | |
| ChIP级H3K4me3抗体 | Abcam | ab8580 | |
| ChIP级H3K79me2抗体 | Abcam | ab3594 | |
| ChIP级H3K27me3抗体 | Abcam | ab6002 | |
| ChIP级H3K9me3抗体 | Abcam | ab8898 | |
| 1M Tris HCl，pH 8.0 | Teknova | T1080 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| 甘氨酸 | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| 脱氧胆酸钠 | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| DPBS | Sigma - Life Sciences | D8537-500ML | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 74255 | |
| 吐温-X | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| LiCl | Sigma-Aldrich | 746460 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016-100ML | |
| 1% TWEEN-20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 | |
| BSA - 无IgG | Sigma - Life Sciences | A2058-5G | |
| HBSS | Gibo | 14025092 | |
| GentleMACS C管 | GentleMACS | 120-008-466 | 解离管 |
| 16% 甲醛 | Peierce | 28906 | |
| miniProtease抑制剂 | Roche Diagnostics | 11836153001 | 蛋白酶抑制剂片剂 |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10009D | |
| Bioruptor NGS 0.65 mL管 | Diagenode | C30010011 | 超声破碎管 |
| DynaMag - 96 侧裙板磁力架 | Invitrogen | 120.27 | 96孔磁力架 |
| TE缓冲液 | Promega | V6231 | |
| RNase A | Invitrogen | 12091021 | |
| 蛋白酶K | Invitrogen | 100005393 | |
| AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | A63882 | 顺磁性磁珠 |
| 乙醇 | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Qubit dsDNA高灵敏度检测试剂盒 | Invitrogen | Q32854 | 高灵敏度DNA试剂 |
| NEBNext Ultra II DNA文库构建试剂盒 | New England BioLabs | E7645L | DNA文库构建试剂盒 |
| 无核酸酶水 | Ambion | AM9932 | |
| 高灵敏度D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | 高灵敏度DNA试剂 |
| 高灵敏度D1000试剂 | Agilent Technologies | 5067-5585 | 高灵敏度DNA试剂 |
| 多重寡核苷酸（索引引物-第1组） | New England BioLabs | E7335L | 多重寡核苷酸 |
| 多重寡核苷酸（索引引物-第2组） | New England BioLabs | E7500L | 多重寡核苷酸 |
| TapeStation 4200 | Agilent Technologies | G2991AA | 高灵敏度DNA电泳分析仪 |
| Bioruptor Pico超声破碎仪 | Diagenode | B01060001 | 水浴破碎仪 |
| 混匀仪 | Nutator | 421105 | |
| Bio-Rad C1000 Touch梯度PCR仪 | Bio-Rad | 1851196 | PCR热循环仪 |
| 水浴锅 | Fisher Scientific | 2322 | |
| 多通道移液器 | Denville | 1003123 | |
| 管旋转仪 | Thermo-Scientific | 88881001 | |
| 96孔带裙边板 | Eppendorf | 47744-110 | |
| Allegra X-12R离心机 | Beckman Coulter | A99464 | 台式离心机 |
| Centrifuge 5424 | Eppendorf | 22620461 | 台式离心机 |
| 光学管条（8x条） | Agilent Technologies | 401428 | |
| 光学管条盖（8x条） | Agilent Technologies | 401425 | |
| 上样吸头，10个装 | Agilent Technologies | 5067-5599 | |
| IKA MS3涡旋振荡器 | IKA | 3617000 | 涡旋振荡器 |
参考文献
- Rao, S. S., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
- Hnisz, D., Day, D. S., Young, R. A. Insulated Neighborhoods: Structural and Functional Units of Mammalia....
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