成像视网膜组织可提供传统生化方法无法获取的单细胞信息。本方案描述了用于共聚焦成像的斑马鱼视网膜切片制备方法。利用荧光遗传编码传感器或指示染料，可在不同类型的视网膜细胞中可视化多种生物学过程。
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摘要
摘要
视网膜是一种复杂的组织，负责启动并整合视觉的最初步骤。视网膜细胞功能障碍是多种致盲性疾病的显著特征，而未来疗法的开发依赖于对不同类型视网膜细胞正常功能的基础性理解。由于特定细胞类型的贡献在视网膜细胞环境中被稀释，因此通过生化方法获取此类信息已被证明具有挑战性。得益于越来越多的基因编码荧光生物传感器，活体视网膜成像能够在亚细胞水平上观察多种生物学过程。然而，该技术迄今仅限于蝌蚪和斑马鱼幼体、离体视网膜的最外层，或在活体动物中进行较低分辨率的视网膜成像。本文介绍一种用于生成活体 离体 用于活体成像的成年斑马鱼视网膜切片，通过共聚焦显微镜进行观察。该制备方法可获得横断面切片，完整保留所有视网膜层及大多数细胞类型，适用于灌流条件下开展共聚焦成像实验。利用在特定视网膜细胞类型或细胞器中表达荧光蛋白或生物传感器的转基因斑马鱼，可从结构完整的视网膜中获取单细胞水平的信息。此外，还可将荧光指示剂染料加载至视网膜切片，进一步提升该方法的适用性。本方案最初开发用于Ca²⁺成像2+ 在斑马鱼的视锥光感受器内，但通过使用适当的标记物，该方法可被调整用于测量Ca2+ 或代谢物在穆勒细胞、双极细胞和水平细胞、小胶质细胞、无长突细胞或视网膜神经节细胞中的分布。由于视网膜色素上皮在切片过程中被去除，因此该方法不适用于研究此类细胞。经过练习，可从单只动物获取连续切片用于多个实验。这种可调整的技术为研究视网膜细胞生物学中的诸多问题提供了有力工具，Ca2+以及能量稳态。
引言
斑马鱼（Danio rerio）因其体型小、发育迅速以及具有脊椎动物的器官系统，已在医学和基础科学研究中得到广泛应用1。斑马鱼幼体天然透明，结合成熟的转基因技术，使得在活体动物中对细胞过程进行精细观察成为可能。已有多种基因编码的荧光生物传感器被靶向定位至特定的斑马鱼细胞，用于检测 Ca2+ 2、过氧化氢3、凋亡激活4 和 ATP5。
体内成像技术在斑马鱼幼鱼中的应用推动了神经科学领域的突破，包括脑回路图谱的绘制6以及中枢神经系统疾病药物的研发7。斑马鱼非常适合视觉研究，因为其视网膜具有高等脊椎动物的层状结构和神经元类型，并表现出显著的视觉行为8,9。多种类似于人类疾病的视网膜变性已在斑马鱼中成功建模并开展研究10,11，包括对视网膜内单个感光细胞退化的活体成....
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方案
所有动物实验均经华盛顿大学机构动物护理和使用委员会批准。
1. 动物与仪器设备的准备
注意：视网膜色素上皮（RPE）是一层环绕视网膜外侧的深色组织，其色素可能在共聚焦成像时遮蔽视网膜结构特征，并造成组织损伤。 离体在黑暗环境中，斑马鱼的视网膜色素上皮（RPE）会从视网膜上回缩；将斑马鱼进行暗适应处理，有助于在切片和成像前更方便地去除视网膜上的RPE。
- 将鱼转移到装有鱼水的产卵缸中，然后用深色织物包裹产卵缸，或将产卵缸置于暗柜中。
- 在实施安乐死后至少1小时前将斑马鱼置于黑暗环境中适应，以实现视网膜色素上皮（RPE）与视网膜近乎完全的分离。30分钟的暗适应足以去除大部分RPE，但仍有部分可能残留在感光细胞之间。
- 在加热板上用50 mL烧杯融化约15 mL石蜡油，然后用3 mL无针头注射器吸取3 mL液体。将注射器倒置放入试管架中，让石蜡油冷却固化。
- 在一块7 cm × 2.5 cm的普通载玻片上制作可重复使用的切片室。
- 使用透明指甲油在载玻片中央绘制细线，形成一个3 cm × 2.5 cm的矩形，待其干燥后，再在线条上添加一层指甲油。
- 在盖玻片上制备成像梯子以在成像过程中固定切片。切片将构成梯子的横档"run....
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结果
切片的稳定定位和横向方位对于成功进行药物注射或灌注成像至关重要。在共聚焦成像前，应仔细检查并根据需要重新调整切片位置，以确保所有视网膜层均清晰可见（图2A，切片ii）。若切片轻微向前旋转（图2A，切片iii），则可观察到外节束，此时可用镊子进行微调，使目标视网膜层聚焦清晰。与滤纸黏附不良的切片（图2A，切片i）或仍保留视网膜色素上皮（RPE）的切片（图2A，切片iv）不应用于时间序列成像。
细胞活力对于观察生理过程至关重要 离体；建议使用细胞活力染料（如碘化丙啶，PI）来检测细胞活性，以便在进行视网膜切片操作时评估细胞健康状况。所有切片切缘附近的死细胞会将PI富集于细胞核中
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讨论
离体成像新鲜斑马鱼视网膜切片已被证明是研究光感受器生物学的一种多功能工具20,21,22，其独特之处在于能够在成熟且完全分化的视网膜中对单个细胞进行分析。经过练习后，即使使用来自同一视网膜区域的连续切片，也有可能利用单条鱼的组织开展多项实验。除了有关制备两栖动物视网膜切片用于电生理学研究的挑战与建议14外，成像实验还有一些重要的注意事项。
对于感光细胞而言，细胞存活率通常与细胞形态相关，因此在处理脆弱的视网膜时应尽量轻柔，尤其是在视网膜色素上皮（RPE）被去除后。切片完成后，应使用精细镊子将切片从切片室中水平轻轻滑出（图1F），以转移至梯状支架上，避免直接垂直提起切片；同时始终确保切片浸没在任氏液中。若条件允许，应将视网膜切片梯状支架组装在共聚焦显微镜附近，以尽量减少运输过.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
在制定本方案期间，我们感谢Ralph Nelson和Daniel Possin提供的深思熟虑的指导，感谢Eva Ma、Ashley George和Gail Stanton在建立稳定转基因斑马鱼品系方面的工作。本研究工作得到了美国国家科学基金会研究生科研奖学金（NSF GRFP 2013158531）对M.G.的资助，美国国立卫生研究院眼科研究所（NIH NEI 5T32EY007031）对W.C.和M.G.的资助，以及EY026020对J.H.和S.B.的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 斑马鱼 | 华盛顿大学南湖联盟水生生物设施 | 在本单位内维持为稳定的转基因品系 | |
| 凡士林 | 费舍尔科技公司 | 19-090-843 | 用于凡士林注射器 |
| 3 mL滑动式针头注射器 | 费舍尔科技公司 | 14-823-436 | 用于凡士林注射器 |
| 20号 3.8 cm滑动式针头 | 费舍尔科技公司 | 14-826-5B | 用于凡士林注射器 |
| 普通 7 cm × 2.5 cm 显微镜载玻片 | 费舍尔科技公司 | 12-550-A3 | 用于眼球杯解剖、切片室 |
| Seche Vite透明指甲油 | 亚马逊 | B00150LT40 | 用于切片室 |
| 18 mm × 18 mm #1 玻璃盖玻片 | 费舍尔科技公司 | 12-542A | 用于成像梯度 |
| 无味牙科蜡 | 亚马逊 | B01K8WNL5A | 用于成像梯度 |
| 双刃剃须刀片 | Stoelting公司 | 51427 | 用于组织切片 |
| 带数字千分尺的组织切片机 | Stoelting公司 | 51415 | 用于组织切片 |
| 滤纸 — 白色网格混合纤维素，直径13 mm，孔径0.45 µm | EMD Millipore公司 | HAWG01300 | 用于视网膜固定时的滤纸 |
| 10 cm培养皿 | 费舍尔科技公司 | FB0875712 | 用于鱼类安乐死、解剖、成像梯度组装 |
| 15 cm平头木制涂药棒 | 费舍尔科技公司 | 23-400-112 | 用于制作金属丝眼环工具 |
| 30号（直径0.25 mm）钨丝 | 费舍尔科技公司 | AA10408G6 | 用于制作金属丝眼环工具 |
| D-葡萄糖 | 西格玛-奥德里奇公司 | G8270 | 补充剂储备液的组分 |
| L-乳酸钠 | 西格玛-奥德里奇公司 | L7022 | 补充剂储备液的组分 |
| 丙酮酸钠 | 西格玛-奥德里奇公司 | P2256 | 补充剂储备液的组分 |
| L-谷氨酰胺 | 西格玛-奥德里奇公司 | G3126 | 补充剂储备液的组分 |
| 还原型L-谷胱甘肽 | 西格玛-奥德里奇公司 | G4251 | 补充剂储备液的组分 |
| L-抗坏血酸 | 西格玛-奥德里奇公司 | A5960 | 补充剂储备液的组分 |
| NaCl | 西格玛-奥德里奇公司 | S7653 | Ringer溶液的组分 |
| KCl | 西格玛-奥德里奇公司 | P9333 | Ringer溶液的组分 |
| CaCl2 · 2H2O | 西格玛-奥德里奇公司 | C3881 | Ringer溶液的组分 |
| NaH2PO4 | 西格玛-奥德里奇公司 | S8282 | Ringer溶液的组分 |
| MgCl2 · 6H2O | 西格玛-奥德里奇公司 | M0250 | Ringer溶液的组分 |
| HEPES | 西格玛-奥德里奇公司 | H3375 | Ringer溶液的组分 |
| Tris碱 | 费舍尔科技公司 | BP152 | 无Na+ Ringer溶液的组分 |
| 6 N HCl | 费舍尔科技公司 | 02-003-063 | 无Na+ Ringer溶液的组分 |
| KH2PO4 | 西格玛-奥德里奇公司 | P5655 | 无Na+ Ringer溶液的组分 |
| 50 mL锥形离心管 | Denville科技公司 | C1062-P | Ringer溶液的容器 |
| Vannas剪刀 — 8 cm，斜角5 mm刀片 | 世界精密仪器公司 | 501790 | 用于眼球杯解剖的微型剪刀 |
| 瑞士镊子 — #5，11 cm，直头，尖端0.06 × 0.07 mm | 世界精密仪器公司 | 504510 | 用于眼球杯解剖和切片操作的精细镊子 |
| 单刃剃须刀片 | 费舍尔科技公司 | 12-640 | 用于眼球杯解剖和修剪滤纸 |
| EMD Millipore滤纸镊 | 费舍尔科技公司 | XX6200006P | 用于操作湿润滤纸的平头镊子 |
| C12 558/568 BODIPY | 费舍尔科技公司 | D3835 | 标记活细胞核；室温下孵育5 µg/mL，持续15分钟 |
| 碘化丙啶（PI） | 费舍尔科技公司 | P3566 | 标记死细胞核；室温下孵育5 µg/mL，持续20分钟 |
| Hoechst 33342 | 费舍尔科技公司 | 62249 | 标记活细胞核；室温下孵育5 µg/mL，持续20分钟 |
| 四甲基罗丹明甲酯（TMRM） | 费舍尔科技公司 | T668 | 标记功能完整、带负电荷的线粒体；室温下孵育1 nM，持续30分钟 |
| 组织灌流室 | Cell MicroControls公司 | BT-1-18/BT-1-18BV [-SY] | 用于注射或灌流的成像室 |
| 2-(N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基)-2-脱氧葡萄糖（NBDG） | 费舍尔科技公司 | N13195 | 荧光葡萄糖类似物，在安乐死前30分钟口服给予斑马鱼 |
| 奥林巴斯激光扫描共聚焦显微镜 | 奥林巴斯 | FV1000 | 用于在单细胞分辨率下观察切片的荧光信号 |
| 羰基氰-3-氯苯腙（CCCP） | 西格玛-奥德里奇公司 | C2759 | 实验试剂，可消除线粒体呼吸；处理切片至终浓度为1 µM |
| 微型吸液器定位器 | Cell MicroControls公司 | FL-1 | 用于灌流 |
| 灌流多通管、气体鼓泡多通管、流量阀、60 cc注射器架 | Warner Instruments公司 | 各种 | 用于灌流 |
参考文献
- Lieschke, G., Currie, P. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Ma, E., et al. Loss of Pde6 reduces cell body Ca2+ transients within photoreceptors. Cell Death Dis. 4 (9), e797(2013).
- Niethammer, P., Grabher, C., Look, A., Mitchison, T.
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