小鼠肝脏灌注法分离肝细胞和肝窦内皮细胞

摘要

本实验方案的目的是从肝脏中获得高活力和高产量的肝细胞及肝窦内皮细胞。通过门静脉灌注IV型胶原酶溶液，随后进行差速离心，从而分离得到肝细胞和肝窦内皮细胞。

摘要

本方案展示了一种从小鼠肝脏中分离肝细胞和肝窦内皮细胞（SECs）的方法，可获得高产量和高活性的细胞，适用于细胞培养或制备细胞裂解物。在本方案中，导管插入部位选择门静脉而非下腔静脉，以减少最终肝细胞制备物中其他细胞类型的污染。整个操作过程无需特殊仪器。使用水浴作为热源，以维持所有缓冲液和溶液的温度。采用标准蠕动泵驱动液体流动，并需要一台带制冷功能的台式离心机进行离心操作。该技术唯一的局限在于将导管准确置入门静脉的过程，对于体重在18–25 g范围内的部分小鼠而言操作具有一定挑战性。该方法的优势在于仅需使用单一血管进行灌注，且血管暴露迅速，从而最大限度地减少了肝脏缺血与再灌注损伤，提高了肝细胞的存活率。本方案另一优点是在离心步骤中，由于活细胞与死细胞的密度不同，可通过肉眼直接区分活肝细胞与死肝细胞。本方案所获得的细胞可用于后续各种细胞培养实验，也可用于各类生物化学分析。

引言

自20世纪50年代初以来，已开始采用胶原酶灌注肝脏的方法获取肝细胞，并在此后不断得到改进^1,2,3,4。Meyer et al⁵系统综述了肝脏细胞纯化过程中所使用的多种方法、技术及试剂。获得高活力且产量满意的肝细胞和肝实质细胞（SECs）在技术上具有挑战性。影响因素包括分离细胞时所施加的机械力以及胶原酶的质量，这些变量较难控制。由于肝细胞对机械力高度敏感，在非最佳条件下其活力会显著下降，因此迫切需要制定一套描述最佳分离条件的操作方案。相比之下，SECs似乎对机械剪切力的敏感性较低。原位灌注结合胶原酶消化是目前最有效的方法，可破坏细胞间连接，从而从肝脏及其他器官（如肠道和脾脏）获得单细胞悬液⁶。本方案展示了一种简便的方法：通过使用可回缩的塑料导管将灌注缓冲液引入门静脉，避免了传统切口可能导致门静脉塌陷的问题，如Smedsrød et al⁷所述。

本论文的目的是展示肝脏灌注实验成功所需的最关键步骤。这些步骤包括导管放置、灌注液的流动控制，以及组织消化后的处理。灌注流速需高于正常的血流速度，但又必须足够低，以保持格利森囊（Glisson's capsule）的完整性。当肝脏被充分消化且细胞在溶液中分离后，无论采用差速离心法、贴壁黏附法还是磁珠分选法，细胞纯化过程都相对简单。活肝细胞密度较高，通过低速离心即可轻松将其与非实质细胞（NPCs）及死细胞分离。对于大多数应用而言，利用贴壁法分离库普弗细胞（Kupffer cells, KCs）和肝窦内皮细胞（SECs）是常用方法⁸，尽管已有报道指出该方法获得的SEC纯度并不理想⁹。KC倾向于快速黏附于坚硬固体表面，而培养皿（标准聚苯乙烯材质）是该操作中最常用的材料。使用抗体偶联磁珠进行SEC或KC的纯化无疑是实现这些细胞高度纯化的最佳方法，但该步骤会使本实验方案额外增加3至4小时，且总体得率有所下降⁹。本报告详细阐述了优化肝脏灌注的操作流程，通常可获得大量具有活性的细胞。

方案

本方案中所述的所有动物实验程序均已获得内布拉斯加林肯大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，批准编号为#1435。

1. 准备

1. 溶液和培养基的制备
   1. 根据材料表中的说明配制所有培养基和缓冲液。
2. 仪器的准备
   1. 准备一个水浴锅（>10 L），温度设定为 42 °C，配备可调速的蠕动泵以及用于固定烧瓶的夹具。准备好弯头剪刀和镊子（图 1）。
   2. 在水浴锅上或其附近放置一个烤盘（约 38 × 26 cm），上面铺有泡沫垫（50 mL 锥形瓶架），再覆盖一块裁剪成 20 × 20 cm 大小的吸水垫（图 1）。
   3. 在附近放置一段 5 - 8 cm 的医用胶带。放置一段已剪好、可直接使用的 20 cm 聚酯缝合线。准备一根带可回缩针头的塑料导管（7 mm × 19 mm，图 1）。
3. 玻璃器皿的准备
   1. 使用夹具将一个 1 L 烧瓶固定在水浴中，瓶内加入 200 mL 1× PBS，并用带有两根插入溶液中的 1 mL 移液管的塞子密封。橡胶塞上设有凹槽，以实现封闭回路中的液体循环。
   2. 用另一个夹具将一个 125 mL 烧瓶固定，瓶内加入 45 mL 缓冲液 2，并用带有两根 1 mL 移液管的塞子密封；其中一根移液管插入液面底部，另一根位于液面上方，用于向瓶内通入氧气。
      注：塞子中的每根移液管末端均连接有快速断开接头，便于更换管路。氧气将通过未浸入液体的移液管缓慢通入两个烧瓶中。
   3. 预留两个无菌的结晶皿备用。

2. 动物实验步骤

1. 将 PBS 和缓冲液 2 在水浴中预热至 42 °C，并在密闭回路中以至少 20 mL/min 的流速循环 PBS，以保持液体管路温暖。将多余的管路浸入水浴中，使其尽可能接近 42 °C。将管路的雄性端排入含有 PBS 的 1 L 锥形瓶中。
2. 在吸水垫上放置一个棉球，使用移液管向棉球上加入约 2 mL 的 30% 异氟烷 （用聚乙二醇 200 配制，可降低异氟烷的蒸发速率） 。
3. 抓住小鼠尾巴将其提起，放入其中一个培养皿中，然后迅速将培养皿倒扣在棉球上，使小鼠有一个小空间吸入麻醉气体。观察小鼠的呼吸频率，并确保其已有效进入麻醉状态。
   注意：麻醉状态下，小鼠呼吸应变慢且加深， 尾巴松弛，脚趾对夹捏测试无反应；更多细节请参见 IACUC 指南。
4. 在小鼠进入麻醉状态期间（通常需要 1–2 分钟），准备一支 10 mL 注射器的筒身：拉出活塞，在筒身内放入一小团棉球。用移液管向筒身内的棉球加入 1–2 mL 的 30% 异氟烷，然后将筒身开口端朝下放置于桌面上，等待小鼠完全失去意识。
5. 迅速取下培养皿，将小鼠翻转为仰卧位，并将注射器筒身罩在其鼻部。再次检查呼吸频率、脚趾夹捏反应和尾巴松弛程度。若对脚趾夹捏或尾巴松弛测试仍有反应，表明小鼠尚未完全麻醉。保持注射器筒身覆盖鼻部以维持无意识状态。
6. 用图钉穿过小鼠四肢脚掌，使其肢体伸展并固定于仰卧位。用 70% 异丙醇或乙醇润湿腹部和肋骨区域。
7. 一手持直头镊子，提起腹部基部附近的皮肤；另一手持剪刀，剪开隆起的皮肤和腹膜。切口应呈水平方向，横跨隆起皮肤的基部。务必剪透所有皮肤和腹膜层，以便进入腹腔。沿腹部两侧向肋骨区域横向剪开，注意不要损伤任何器官。
8. 通过横切下部肋骨区域，移除皮肤瓣。用镊子背面将肠道向右侧移动，以暴露门静脉。
   注意：动物出血量应极少；动物应仍保持呼吸且处于深度麻醉状态。
9. 将闭合的弯头镊子置于门静脉下方，位于肝脏与胰十二指肠上静脉之间（图 3 箭头所示）。
10. 在门静脉下方打开镊子，抓住缝线并小心将其穿过，使缝线居中位于门静脉下方。在门静脉周围打一个单结，但暂不收紧。
11. 将弯头镊子置于门静脉下方，轻轻向小鼠尾部方向牵拉，以拉直血管（图 4A）。
12. 另一手持导管，将针头斜面朝上，并与靠近镊子处的门静脉下段平行放置（图 4B）。
13. 用针头轻轻穿刺血管（图 4C）。确保针头斜面进入血管腔内。回撤弹簧加载的针芯，继续推进聚合物导管进入血管，直至斜面接近静脉分支区域（位于肝脏内部）。若导管位置正确，可见血液回流（图 4D）。
14. 收紧单结并将其沿导管向下拉紧，以帮助固定导管。立即将泵速从 20 mL/min 降低至 4 mL/min，并切断另一主要血管用于引流。为获得最佳效果，应切断腹主动脉。
15. 将管路的雄性端连接至导管的雌性端（图 5A）。确保管路中无气泡。注意避免将导管推入肝脏或脱出血管。缝线的放置并非必需，但它有助于防止血液从静脉反流，并帮助维持导管在正确位置（图 5B, C）。
16. 使用美纹纸胶带将管路固定在吸水垫上。用直头镊子挤压流出血管数次，使肝脏短暂膨胀，以确认所有血液均已排出（图 5D）。
    注意：普通实验室胶带可能 无效；然而，美纹纸胶带即使在潮湿条件下也能牢固粘附于吸水垫上。

3. 肝脏灌注

1. 肝脏用 PBS 冲洗的同时，称取约 24 mg IV 型胶原酶，并将其加入盛有 45 mL 缓冲液 2 的锥形瓶中，置于水浴中。务必轻轻旋转瓶内液体，使胶原酶完全溶解，然后将锥形瓶重新放回夹具中，确保瓶内液体部分完全浸没于水中。
2. 观察肝脏在 PBS 冲洗过程中颜色的变化。将出流管路从 1 L 锥形瓶切换至 125 mL 锥形瓶。注意避免气泡进入肝脏。
3. 当灌注缓冲液到达肝脏时，短暂捏紧流出血管，以在血管内建立一定压力，使液体充满肝脏的所有叶。注意不要阻断引流过久，否则可能导致包裹肝脏的薄结缔组织（Glisson's capsule）破裂，从而破坏肝脏毛细血管床内的灌注或液体流动。
4. 继续用含胶原酶的缓冲液 2 对肝脏进行灌注，直至全部 45 mL 液体流经组织。
   注意：若操作成功，Glisson's capsule 应与实质组织或肝组织分离，肝脏本身应呈现无定形外观。
5. 向另一个结晶皿中加入约 10 mL 缓冲液 1，并将其放置在小鼠旁边。
6. 移除导管并关闭泵。
7. 使用直头镊子和剪刀将肝脏从小鼠体内取出。如果胶原酶消化效率很高，可能需要准备一把洁净无菌的勺子，以便将肝脏舀出并放入缓冲液 1 中。

4. 肝细胞纯化

注意：如果后续所有步骤中均需对细胞进行培养，则细胞操作应在无菌的组织培养罩内进行，以减少污染。

1. 采用无菌操作技术，用镊子夹住肝脏，轻轻振荡以使细胞从肝脏中释放。撕开或向后拉破格利森氏囊：随着细胞从肝脏中被振荡出来，缓冲液将变得浑浊。
2. 将细胞悬液倒入一个顶部放置有100 µm滤网的50 mL锥形管中。
3. 向肝脏残留物中加入更多缓冲液1（Buffer 1），继续振荡以释放细胞。重复此过程，直至肝脏组织看似无细胞残留，或未消化的肝脏部分不再释放细胞为止。
4. 将细胞悬液倒入另一个装有40 µm滤网的50 mL锥形管中。
5. 在水平转子离心机中以100 × g离心3分钟。
   ​注意：请勿使用最大刹车档位，以免扰动细胞沉淀。建议使用80%刹车强度，该设置适用于后续所有在4 °C下进行的离心步骤。
6. 将上清液（含有非实质细胞NPCs和死亡的肝细胞）一次性倾入干净的锥形管中，并立即置于冰上。操作时应一次完成，以便观察沉淀是否牢固附着。
7. 将沉淀用40 mL缓冲液1（Buffer 1）重悬。重复步骤4.5和4.6。再用40 mL缓冲液3（Buffer 3）重悬沉淀，并重复步骤4.5和4.6两次。
8. 将纯化的肝细胞重悬于预温的DMEM + 10% FBS + 2×青霉素-链霉素（Pen/Strep）培养基中。
9. 若将细胞培养于胶原包被的培养板上，应先让细胞贴壁1小时，然后至少更换一次培养基，以防止潜在的细菌污染。
   1. 制备胶原包被板的方法：将0.05%胶原溶于0.001%乙酸溶液中，37 °C孵育至少1小时，随后用1× PBS洗涤。
10. 若肝细胞活力较低，且希望获得高活力的纯化肝细胞，可采用Kreamer et al¹⁰ 改良的以下方案：
    1. 将9体积的PVP溶液（Percoll，一种用于密度梯度离心的23% w/w水溶液，内含15–30 nm聚乙烯吡咯烷酮包被的胶体二氧化硅颗粒）与1体积的10× HBSS混合，配制等渗PVP溶液（SIP）。
    2. 向无菌50 mL锥形管中加入24 mL SIP溶液，可在4 °C条件下储存最多2个月。
    3. 用如步骤4.8所述的培养基将肝细胞浓度调整至5–10 × 10⁶ 个细胞/mL。
    4. 向每个含24 mL SIP的锥形管中加入25 mL细胞悬液，轻轻倒置混匀。该混合液密度为1.06 g/mL。
    5. 在4 °C条件下以50 × g离心10分钟。
    6. 吸除SIP溶液及絮状物，将细胞重悬于HBSS中。
    7. 在4 °C条件下以50 × g离心10分钟，洗涤细胞。
    8. 重复步骤4.10.6一次，然后将细胞重悬于生长培养基中。

5. 凝胶过滤层析纯化

1. 将步骤4.6的上清液中的细胞在163 × g条件下离心10分钟，形成细胞沉淀。弃去离心管中的上清液，将所有细胞沉淀用5 mL无血清RPMI重悬，并合并至同一离心管中。
2. 待所有沉淀合并后，加入RPMI至终体积为35 mL。
3. 将合并后的离心管在25 × g条件下离心3分钟。用25 mL移液器小心吸走上层25 mL RPMI，并将含有非实质细胞（NPCs）的培养基转移至冰上预冷的干净50 mL离心管中。
4. 向离心管中重新加入25 mL新鲜RPMI，并重悬细胞沉淀。
5. 重复步骤5.3进行第二次洗涤，并合并上清液。弃去剩余的10 mL培养基及沉淀（沉淀主要为死亡的肝细胞）。将合并后的上清液在163 × g条件下离心10分钟。
6. 在离心过程中，于50 mL离心管中制备PVP溶液梯度。
7. 向50 mL离心管中加入15 mL 50% PVP溶液，随后使用移液器以最慢的排液速度缓慢加入20 mL 25% Percoll溶液，使其覆盖在PVP溶液上方。注意观察在15 mL刻度处应出现明显的折射线，以区分两层液体，离心后肝窦内皮细胞（SECs）和库普弗细胞（KCs）将聚集在此界面处。
8. 将步骤5.5中获得的细胞沉淀用10 mL冷RPMI重悬，并小心地铺加到PVP梯度溶液上，确保两层之间保持清晰的分界。将梯度管在805 × g条件下离心20分钟，刹车设置为50%。
9. 从管顶部开始向下吸液至20 mL刻度线处，弃去该部分液体。使用5 mL移液管收集位于25%/50%界面处的SECs和KCs。弃去任何褐色的细胞团块，因其为死亡的肝细胞。
10. 将收集的细胞转移至50 mL离心管中，加入RPMI至50 mL刻度线以稀释PVP溶液。在200 × g条件下离心10分钟，刹车设置为80%。
11. 吸除并弃去上清液，用12 mL温热的RPMI重悬细胞沉淀，同时冲洗离心管内壁以充分回收细胞。
12. 将上清液转移至聚苯乙烯培养皿中，在室温下置于湿润的组织培养孵箱中孵育8分钟，以分离SECs与KCs。
13. 用25 mL移液器吸出培养基，并以相同培养基轻轻冲洗培养皿，移液器设置为最低速度，以收集未贴壁的SECs，而KCs则保留在培养皿表面。
14. 将SECs在200 × g条件下离心10分钟，重悬于含5% FBS及青霉素/链霉素的RPMI培养基（RPMI + 5% FBS + Pen/Strep）中。随后进行细胞计数，并接种于胶原包被的培养皿中。

结果

本文介绍了一种用于肝脏灌注以及肝细胞和肝窦内皮细胞（SECs）纯化/富集的演示性优化方法，提供了与参考综述⁵中汇总的其他已发表报告类似的详细操作建议，以实现最佳的细胞纯化/富集效果。细胞纯化成功的关键步骤取决于胶原酶灌注过程中的路径选择和技术细节，本方案对此进行了详细说明。该实验装置的搭建相对简单且成本较低，仅需使用常规实验室设备，与其他已发表系统相比更具优势¹¹（图1）。在此装置中，放置小鼠的托盘置于水浴中，部分多余的管路也浸入水浴，以维持灌注液在肝脏内的温度。本装置如图所示，既可用于小鼠，也可用于大鼠，仅在大鼠肝脏灌注时需采用略有不同的几何布局¹²（图2）。

在此操作中，肝脏通过门静脉灌注，而非下腔静脉（另一种常用的灌注途径），因为门静脉在腹腔内更易于接近，且该静脉直接通入肝脏。操作者应注意，门静脉具有多个细小分支，可能造成灌注液短路，因此导管应置于这些分支的远端，以确保最佳成功率¹³（图3）。确定门静脉后，使用弯头镊子在门静脉下方、肝脏与胰十二指肠上静脉之间穿过一条外科缝合线或聚酯线。镊子还用于拉直处于正压血流状态下的门静脉（图4A）。导管内的针头应平行并紧邻静脉放置（图4B），针尖斜面应轻柔插入静脉管腔内（图4C）。正确插入的标志是血液沿导管出现。一旦针头撤出，应使用缝线将导管固定，并由血压推动血液沿导管上升。建议在血液溢出前将导管连接至泵管（图4D）。连接泵管后，立即剪断一条主要血管（如下腔静脉或腹主动脉），以实现血液/液体引流（图5A）。通常需要剪开小鼠腹壁侧面以获得充分引流，因为腹腔内血液积聚会妨碍观察灌注过程，并可能导致血液混入后续细胞纯化步骤中（图5B）。当PBS开始灌注肝脏时，肝脏因血液流失而变苍白（图5C）。若仅有少数肝叶变白，则可能因导管插入过深，需缓慢后撤。确认导管位置正确后，使用防水胶带将管路固定到位；普通实验室胶带通常不够牢固。为确认导管位置正确，可挤压剪开的血管以阻断引流，并观察肝脏内压力升高情况。此操作有助于将血液彻底冲出肝脏（图5D）。当胶原酶溶液初次进入肝脏时，也应执行此操作，以确保所有肝叶均接触胶原酶。胶原酶溶液灌注结束后，若Glisson囊与肝实质发生分离，则表明胶原酶消化效果良好。

细胞纯化的一般流程如图6和图7所示，其中肝细胞在低速离心步骤早期即被收集，并在含BSA的缓冲液中经过4次洗涤后纯度非常高（图8）。肝窦内皮细胞（SECs）与库普弗细胞（KCs）通过聚乙烯吡咯烷酮（PVP）梯度共同纯化（图9A），随后利用其在胶原包被的聚苯乙烯培养皿上的选择性黏附特性进行分离。采用该方法获得的SECs纯度为83–90%，其纯度在很大程度上取决于胶原酶消化的整体效率（图9B）。通过光学显微镜进行的定量分析（因为肝细胞和SECs均具有区别于其他细胞的形态特征）显示，在典型制备样本中，肝细胞纯度接近100%，而SECs纯度略高于89%（表1）。此外，也可在PVP梯度分离后采用磁珠柱分离法进一步提高SECs的富集程度，但该方法不在本实验方案的范围之内。有关SECs和KCs磁珠分离的更多细节可参见Meyer et al.⁹ 和 Liu et al.¹⁴。需要注意的是，消化不充分的肝脏中肝细胞的活力会迅速下降，但非实质细胞（NPCs）的情况并非如此。此外，消化不充分的肝脏还会产生更多的细胞碎片，这些碎片在离心步骤中无法被完全去除。

图1：灌注系统的示意图。 烧瓶由夹具固定（图中未显示）；在操作过程中，连接液体的管路会从1L烧瓶切换至125 mL烧瓶，图中以红色虚线表示。注意，氧气供给不会直接在烧瓶溶液中产生气泡。橡胶塞应切有凹槽，以便插入管路时形成封闭回路的液体流动。这在预热管路以及排出管路中所有空气时至关重要。排气装置由三通接头组成，连接Tygon管路和止流夹，可快速打开或关闭系统。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：小鼠肝脏灌注过程中的灌注操作间。 放置小鼠的托盘置于水浴锅的一角。胶原酶溶液已预先充氧，因此此时已断开氧气供应。各物品位置分别为：A）氧气管路，B）盛有PBS的1 L烧瓶，C）盛有含胶原酶缓冲液2的125 mL烧瓶，D）泵，E）泵的控制装置，F）气泡捕集器，G）液体管路，从烧瓶经泵连接至小鼠。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：小鼠腹部血管系统的图像。 导管插入位置应位于门静脉发出的胃和胰静脉汇合处下方（绿色点），导管尖端应置于左、右肝门静脉附近（黄色点），该处形成通向肝脏主要叶段的分叉。确认位置正确后，应使用简单的单结缝线固定导管。K = 肾脏，L = 肝脏，SI = 小肠。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4：门静脉导管置入。（A）使用镊子确保门静脉充血，并将血管拉直以利于导管置入。（B）将导管与门静脉平行对齐，斜面朝上。（C）导管内的针头斜面插入血管内，而非穿透血管。（D）回撤导管针芯，血液将通过导管反流，如镊子尖端所示。请点击此处查看该图的放大版本。

图 5：正确的肝脏灌注。（A）插管完成后，导管的雌性鲁尔接头连接至泵管路的雄性鲁尔接头（从1 mL注射器上截取）。（B）切断一条主要的降支血管后，用剪刀切开小鼠侧腹，使血液和PBS从腹腔排出。（C）当血液被冲洗出时，肝脏应变得苍白，（D）当用镊子夹闭被切断的血管施加压力时，肝脏会肿胀。请点击此处查看该图的放大版本。

图6：肝细胞纯化及非实质细胞（NPC）分离的示意图。 大多数离心步骤旨在从非实质细胞中去除活的和死的肝细胞。 请点击此处查看该图的放大版本。

图7：SEC富集与纯化的示意图。 NPC首先通过PVP梯度分离，随后通过短暂黏附于标准聚苯乙烯培养板实现SEC分离。请点击此处查看该图的放大版本。

图 8：纯化的肝细胞。 将肝细胞接种于胶原包被的组织培养板中，使用 DMEM + 8% FBS + 青霉素/链霉素培养基，在 37°C 下孵育 6 小时后，用显微镜在 400 倍放大下采集图像。比例尺 = 20 µm。请点击此处查看该图的高清版本。

图9：SEC纯化。（A）从25/50% PVP界面（黄色箭头）收集SEC和KC，并用无血清培养基洗涤。（B）通过在标准培养皿上的选择性贴壁将SEC与KC分离，洗涤后接种于胶原蛋白包被的组织培养皿中，培养基为RPMI + 5% FBS。图像由EVOS倒置显微镜在400倍下拍摄。标尺=20 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

图10：小鼠肝脏解剖结构的扫描电子显微镜观察。 小鼠肝脏以PBS灌注后，再以固定液（100 mM 二甲胂酸钠，12 mL 25% 戊二醛，15.6 mL 16% 多聚甲醛，2.65 mM 氯化钙，180.2 mM 蔗糖，混合成100 mL溶液）以1 mL/min的速度灌注4分钟。组织经切片后制备用于扫描电子显微镜观察。图像使用场发射扫描电镜在10,000倍下采集。黄色箭头指示肝细胞之间的微绒毛。比例尺为5 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

图11：死细胞与活肝细胞的可视化对比。 使用缓冲液1洗涤两次后，可通过肉眼评估沉淀的肝细胞中活细胞与死细胞的比例。较浅的沉淀（左侧）表明至少一半的肝细胞已死亡。右侧颜色较深的沉淀紧实地位于管底，活细胞比例超过90%。请点击此处查看该图的放大版本。

表1：细胞纯化
细胞类型	目标细胞百分比	其他细胞百分比
Hepatocytes	99	1
Sinsusoidal endothelial cells	89.1	10.9

表1：通过光学显微镜评估细胞纯度。

讨论

本方案重点介绍可用的工具，这些工具将帮助使用者在该操作中获得较高的成功率。在使用原代细胞时，成功的灌注是任何后续应用的基础。

该操作中有几个关键步骤决定了实验的成败。首先，导管尖端在门静脉内的位置必须准确。若插入肝脏过深，则仅有肝小叶会被灌注。导管尖端应位于门静脉左右分支的稍下方。使用聚合物复合材料导管而非针头的优势在于，针头的倒钩在灌注过程中更容易撕裂血管。其次，胶原酶的质量和用量决定了肝脏消化的效率。本实验中使用了预先验证合格的4型胶原酶，若胶原酶活性高于900 IU，则将其在缓冲液2中重悬至浓度为0.5 mg/mL。

胶原酶灌注结束时，肝脏应保持较深的棕褐色至棕色。如果肝脏呈浅棕黄色，则大多数肝细胞已经死亡。肝脏在从小鼠体内取出时应呈松散易碎状态。在最佳条件下，可用小勺直接将肝脏从腹腔中舀出。处于这种状态的肝脏总能获得很高的细胞活力。如果需要较大力量才能将细胞震散，或在分离过程中肝脏仍较坚硬，或需要较大压力才能使肝细胞通过滤网，则肝细胞的活力会较低。肝细胞表面布满微绒毛，使其具有极大的表面积（图10）。消化不完全会保留肝细胞之间的细胞连接，而机械剪切则会撕裂细胞质膜。原位胶原酶灌注是分离细胞并维持高活力的最佳方法。在图11中，进行了两种肝细胞制备，将细胞沉淀在缓冲液1中洗涤数次后进行比较。左侧沉淀颜色较浅，细胞活力约为50%；右侧沉淀颜色较深，活力达92%。同样，当将液体从50 mL锥形管中倾倒时，颜色较深的沉淀在管内保持固定不动，而较浅的沉淀则会随液体倾倒而在管内滑动。当肝脏存在较高程度的纤维化时，可能出现细胞活力降低或灌注效率不佳的情况。

由于活肝细胞的密度高于死肝细胞，离心步骤将获得高纯度的活肝细胞制备物¹⁵. 如果存在大量死亡的肝细胞（在条件不理想时常发生），可使用聚乙烯吡咯烷酮（PVP）梯度进一步富集活细胞并将其与死细胞分离。此外，由于活肝细胞的沉降速度比死肝细胞更快，可吸除上层约3^rd 沉淀物的收集也会提高沉淀中活细胞与死细胞的比例。这些步骤是在需要时快速、简便地分离活肝细胞、死细胞及细胞碎片的方法。^10,16如果样本非常珍贵，且实验仅需数百万个细胞，则这一点尤为有用。

总之，这是一种从肝脏中分离肝细胞和肝窦内皮细胞（SECs）的简便高效方法。按照目前的价格，每次制备所需的全部试剂和耗材成本低于75美元。如果需要处理多只小鼠，建议先进行肝细胞的纯化，同时将非实质细胞（NPC）组分置于冰上保存，待所有小鼠处理完毕后再继续后续操作。在本实验室条件下，NPC在冰上至少可稳定保存5小时，更长时间的保存效果尚未测试。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 L 锥形瓶	Fisher Scientific	S63274
250 mL 锥形瓶	Fisher Scientific	S63271
硅胶管	Cole-Parmer	96400-14	该管路从锥形瓶经泵连接至T型接头，再连接至与导管相连的1.0 mL 注射器。
Tygon 管	Fisher Scientific	R3603	用于96400-14与移液管及T型接头之间的适配器。 也可用于氧气管路。
T型接头	Cole-Parmer	EW-06294-82
快速接头	Fisher Scientific	6150-0010
压夹	Fisher Scientific	6165-0002
Masterflex L/S 可调速泵，型号 7553-70	Cole-Parmer	EW-07559-00	带有可调速的蠕动泵
泵头，型号 7014-20	Cole-Parmer	EW-07014-20
玻璃刻度1.0 mL 移液管	Fisher Scientific	13-678
弯头无齿剪刀	Fine Science Tools	14069-12
Dumont 镊子	Fine Science Tools	11252-20
弯头镊子	Fine Science Tools	13009-12
10 mL 注射器	Fisher Scientific	03-377-23	仅需注射器筒体
灭菌勺	家用用品商店
棉球	家用用品商店
聚酯缝纫线	家用用品商店
遮蔽胶带	家用用品商店
图钉	家用用品商店
泡沫塑料垫	50 mL 锥形离心管架
烤盘/烘焙盘	家用用品商店
吸水垫	Fisher Scientific	14-206-64
19 L 水浴锅	Fisher Scientific	TSCOL19
BD Insyte Autoguard 防护型静脉导管 24 规	Becton Dickinson	381412	带可缩回针头的塑料导管
结晶皿 100x50	VWR	89000-290
聚苯乙烯培养皿	Sigma Aldrich	P5481-500EA
50 mL 锥形离心管	Fisher Scientific	12-565-270
刻度移液管（5 mL）	Fisher Scientific	170355
刻度移液管（25 mL）	Fisher Scientific	170357
EasyStrainer 100 μM	Greiner bio-one	542000	100 μm 滤膜
EasyStrainer 40 μM	Greiner bio-one	542040	40μm 滤膜
无菌移液管	Fisher Scientific	13-711-20
制冷式摆动吊篮离心机	Sorvall Legend XTR	75-217-406	带摆动吊篮转子的离心机
Galaxy 170R 组织培养孵箱	Eppendorf	CO170R-120-0000	加湿组织培养孵箱
试剂
名称	化合物	克数（g/L）	毫摩尔浓度（mM）
缓冲液 1，pH 7.4	NaCl	8.3	142
	KCl	0.5	6.7
	HEPES	2.4	10
	BSA	15	0.226
缓冲液 2，pH 7.4	NaCl	3.9	66.74
	KCl	0.5	6.71
	CaCl2	0.7	6.31
	HEPES	24	100
	BSA	15	0.226
	酚红	0.01	0.03
缓冲液 3，pH 7.4	NaCl	8	137
	KCl	0.35	4.7
	MgSO4	0.08	0.66
	CaCl2	0.18	1.62
	HEPES	2.4	10
	BSA	15	0.226
PBS，pH 7.4	NaCl	8	137
	KCl	0.2	2.7
	Na2HPO4-7H2O	1.15	4.3
	KH2PO4	0.2	1.4
其他试剂
名称	公司	货号	备注
Percoll（PVP 溶液）	GE Healthcare	288555
IV型胶原酶	Sigma Aldrich	C5138
异氟烷	Abcam	ab144581
肝细胞生长培养基
DMEM	Gibco	11965118
体积比10% 胎牛血清	Gibco	10437010
青霉素/链霉素（2x）	Gibco	15140148
长期肝细胞生长培养基
DMEM
体积比10% 胎牛血清	Gibco	10437010
青霉素/链霉素（2x）	Gibco	15140148
胰高血糖素	Sigma	G3157-2mg	14 ng/mL
胰岛素	Sigma	I9278-5mL	0.5 U/mL
氢化可的松	Sigma	H0888-1g	7.5 mg/mL
表皮生长因子	BD Biosciences	354001-100ug	20 ng/mL
LSEC 培养基
RPMI	Gibco	11875119
体积比10% 胎牛血清	Gibco	10437010
青霉素/链霉素（2x）	Gibco	15140148