方法文章

通过非天然氨基酸的选择性压力整合及质谱与荧光蛋白分析技术构建“金色”荧光蛋白

14.2K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/57017

⸱

2018年4月27日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Chemistry L 1, Department of Biocatalysis, Technical University of Berlin, 2Institute of Chemistry PC 14, Department of Bioenergetics, Technical University of Berlin, 3Institute of Chemistry TC 7, Department of Physical Chemistry/Molecular Material Sciences, Technical University of Berlin

本文内容

摘要

合成生物学可通过共翻译插入非经典氨基酸，实现具有前所未有特性的蛋白质的工程化。本文介绍了如何通过选择性压力整合（SPI）在E. coli中产生一种光谱红移的GFP型荧光团变体，该变体具有新颖的荧光光谱特性，称为“金”荧光蛋白（GdFP）。

摘要

荧光蛋白是生命科学的基本工具，尤其适用于活细胞的荧光显微镜观察。尽管来自维多利亚多管发光水母（Aequorea victoria）的绿色荧光蛋白（avGFP）的野生型和工程化变体以及其他物种的同源蛋白已覆盖光学光谱的大部分区域，但在近红外区域仍存在一个光谱空白，目前尚无基于avGFP的荧光团可用于该区域。红移荧光蛋白（FP）变体将显著扩展用于多种分子物种光谱解混的工具集，但天然存在的、源自珊瑚或海葵的红移FP与avGFP变体相比，其荧光量子产率较低且光稳定性较差。此外，由于遗传密码规定的20种标准氨基酸的限制，对发色团共轭体系进一步改造并可能向远红光谱区域扩展的能力也受到制约。为克服这些限制，合成生物学可通过将非标准氨基酸插入发色团三联体，实现进一步的光谱红移。本文描述了利用SPI技术构建具有新颖光谱特性的avGFP变体的方法。蛋白质表达在色氨酸营养缺陷型的大肠杆菌（E. coli）菌株中进行，并通过在培养基中添加合适的吲哚前体实现。在细胞内，这些前体被转化为相应的色氨酸类似物，并在核糖体机制作用下响应UGG密码子被整合到蛋白质中。在增强型“青色”avGFP变体（ECFP）中，将Trp-66替换为具有给电子能力的4-氨基色氨酸，所得GdFP表现出108 nm的斯托克斯位移和显著红移的发射峰（574 nm），同时其热力学稳定性高于前体ECFP。通过质谱分析非标准氨基酸在特定位点的掺入情况。利用时间分辨荧光光谱法表征GdFP的光谱特性，这是基因编码FP在生命科学中的一项重要应用。

引言

自1962年发现水母Aequorea victoria（avGFP）中的绿色荧光蛋白1，以及1994年首次在其他真核细胞中实现异源表达2以来，GFP家族的荧光蛋白已成为生命科学中极为重要的工具和研究对象。广泛的遗传与分子工程工作包括调整物种特异性的密码子使用、加快折叠速度、改善成熟效率、增强亮度、防止寡聚化，以及定制光谱和光化学特性，其中包括可逆光转换能力3,4,5,6。GFP的荧光来源于其4-（p-羟基亚苄基）咪唑啉酮（HBDI）发色团。该发色团在分子氧作用下，由多肽主链内形成额外共价键后，从所谓的发色三联氨基酸（在avGFP中为Ser-65/Tyr-66/Gly-67）自发催化生成7。这一共振稳定的共轭体系与分子环境动态相互作用，使这些蛋白能够在可见光范围内吸收光并发出特征性的绿色荧光。

在发色团三联体中，芳香族氨基酸的存在是必需的。然而，标准氨基酸库中仅包含四种芳香族残基（His、Phe、Trp 和 Tyr）。这限制了通过传统诱变方法获得比最红移的天然荧光蛋白（如来自 Discosoma striata 珊瑚虫的 DsRed8 或来自海葵 Entacmaea quadricolor 的 mKate/mNeptune9）更显著红移的 avGFP 变体。因此，在600 nm以上的光学光谱远红光和近红外区域，GFP 变体的覆盖非常有限。这对于需要同时对多种荧光团物种进行光谱解混的荧光显微技术而言，显然是一个严重限制。例如，在深层组织成像应用中，为了利用皮肤组织在700–1,000 nm范围内的低吸收窗口，长波长标记物尤为必要10。

基于其发色团的光谱特性和化学性质，来源于avGFP的荧光蛋白被分为多个类别11。野生型发色团由Ser-65/Tyr-66/Gly-67三联体构成，以中性酚羟基形式（λmax = 395 nm，ε = 21,000 M-1cm-1）和阴离子酚盐形式（λmax = 475 nm，ε = 7,100 M-1cm-1）的平衡混合物存在，其发射光谱在508 nm处呈现单一峰。Ser-65的羟基具有关键作用，它向发色团附近Glu-222的羧基提供一个氢键（距离：3.7 Å），促进该羧基的电离。I类蛋白的特征是具有阴离子酚盐发色团，如EGFP（Phe-64-Leu/Ser-65-Thr；λmax = 488 nm，ε = 35,600 M-1cm-1，λem = 509 nm）。由于Ser-65-Thr（Ala,Gly）的取代，中性酚羟基形式在395 nm处的激发峰被抑制，而阴离子酚盐在470–475 nm处的峰增强五至六倍，并红移至490 nm。II类蛋白包含具有中性酚羟基发色团的蛋白，如sapphire-GFP。此处Thr-203-Ile的取代几乎完全抑制了475 nm处的激发，仅保留399 nm处的峰。由于阴离子发色团无法被充分溶剂化，其中性形式占主导。III类包含“黄色”荧光变体（EYFP；Ser-65-Gly/Val-68-Leu/Ser-72-Ala/Thr-203-Tyr；λmax ε = 514 nm，ε = 84,600 M-1cm-1，λem = 527 nm），其芳香侧链与酚盐之间存在π-堆积相互作用，由Thr-203-His（Trp,Phe,Tyr）取代引起，可使发射最大值红移最多达20 nm（Thr-203-Tyr）。进一步的取代（Gln-69-Lys）导致再红移1–2 nm至529 nm，这是目前已知红移程度最大的avGFP变体11。将酚羟基替换为吲哚（Tyr-66-Trp）形成IV类，如青色荧光蛋白ECFP（Ser-65-Thr/Tyr-66-Trp；λmax1 = 434 nm，ε = 24,800 M-1cm-1；λmax2 = 452 nm，ε = 23,600 M-1cm-1；λem1 = 477 nm，λem2 = 504 nm）。大体积吲哚的容纳可能得益于其他补偿性突变。ECFP的激发和发射最大值介于具有中性或阴离子发色团的蛋白之间。V类蛋白在酚羟基位置被咪唑基取代（Tyr-66-His），例如蓝色荧光蛋白EBFP。e.g.，蓝色荧光蛋白如EBFP。VI类通过酚羟基到苯基的交换产生，使发色团完全以中性形式存在，从而导致激发和发射峰位置蓝移最显著（分别为360 nm和442 nm）。

经典的定点诱变特别适用于通过置换20种标准氨基酸框架内的65-67三肽及其相互作用残基，来产生新型avGFP发色团变体。当在核糖体蛋白合成过程中引入芳香族氨基酸的非标准变体时，这些可能性可进一步扩展12。原则上，实现这一目标有两种方法。第一种策略依赖于蛋白质翻译机制（特别是氨酰-tRNA合成酶，aaRS）对相关氨基酸类似物的底物耐受性。为高效实现这一点，通常采用无法合成相应天然氨基酸的色氨酸营养缺陷型E. coli表达菌株。这使得通过在培养基中添加合适的非标准氨基酸（ncAA）或其前体，实现天然氨基酸的替代。该策略又称选择性压力掺入（Selective Pressure Incorporation, SPI）13,14，可实现残基特异性的替换，从而导致ncAA在整个蛋白中的全局性掺入。第二种策略利用经工程化aaRS酶负载ncAA的终止密码子抑制tRNA，实现对同框终止密码子的通读，从而实现位点特异性的ncAA掺入。因此，这种终止密码子抑制（stop codon suppression, SCS）方法可实现遗传密码的扩展15。通过诱变，可在目标基因的特定位置引入终止密码子。原则上，SPI也可用于构建携带独特ncAA插入的重组肽和蛋白质，前提是选择甲硫氨酸或色氨酸等稀有标准氨基酸进行替换。针对色氨酸，已有研究表明SPI方法可适用于多种类似物，包括4-F-、5-F-和6-F-Trp，7-氮杂-Trp，4-OH-和5-OH-Trp，以及4-和5-NH2-Trp，甚至β（噻吩吡咯基）丙氨酸衍生物16,17,18,19,20。因此，SPI在将GFP发色团中的芳香族氨基酸替换为非标准变体方面具有显著优势，有助于探索进一步调控这些荧光蛋白光谱特性及斯托克斯位移的可能性。然而，与所有蛋白质序列修饰一样，必须通过实验验证其对荧光蛋白折叠及发色团成熟过程的兼容性。

在本研究中，我们采用的是IV类ECFP21，其发色团三联体中的残基由野生型avGFP的Tyr替换为Trp。通过无义抑制技术（SPI），该蛋白中的Trp-66（以及ECFP中唯一的另一个Trp残基Trp-57）被4-氨基色氨酸（4-amino-Trp）取代。由于4-氨基色氨酸的发色团中含有给电子的氨基，有利于远红移激发态质子转移（ESPT）过程的共振稳定，从而产生108 nm的斯托克斯位移。这种“金色”荧光蛋白（GdFP）是所有avGFP衍生蛋白中荧光发射最大波长红移程度最大的变体（574 nm）。我们描述了通过SPI技术生产GdFP蛋白的方法，并提供了利用质谱分析所得修饰蛋白所必需的实验方案。此外，我们还展示了如何在时间分辨荧光光谱分析中应用和表征GdFP。

方案

1. 色氨酸营养缺陷型 E. coli 的转化

  1. 将化学感受态或电感受态细胞转化（50 µL）色氨酸营养缺陷型 大肠杆菌 菌株， 例如. ATCC 49980（WP2，源自的突变株） E. coli 菌株 B/R22），其中 1 µ1 纳克/升µL 水溶液中，分别通过热激或电穿孔法转化 pQE-80L His6-ECFP 质粒。详情请参见 JoVE 科学教育数据库23,24 详情请见。
    注意：表达载体 pQE-80L His6-ECFP 编码一个N端带有6×His标签的 ECFP21 由带有 lac 操纵子的细菌 T5 启动子驱动。它还携带一个 AmpR 筛选标记和一个colE1复制起点（pQE-80L载体骨架序列可在以下网址找到：https://www.qiagen.com/mx/resources/resourcedetail?id=c3b71572-4d82-4671-a79b-96357fe926d1）&lang=zh&autoSuggest=true)。His6-ECFG野生型蛋白（经发色团成熟后）的理论分子量25）为 28303.92 Da。翻译后的目标蛋白序列如下（His标签加下划线，载体来源序列加粗）： MRGSHHHHHHGSMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTWGVQCFSRYPDHMK
    QHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYISHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNIEDGS
    VQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK
  2. 将转化后的细胞接种于LB-琼脂平板上（表1）补充有 10 g/L 葡萄糖、100 µg/mL 氨苄青霉素，并将平板在 37 ℃ 培养 °C 过夜。

2. 重组蛋白表达

  1. 过夜培养的 E. coli ATCC 49980 pQE-80L His6-ECFP
    1. 制备 5 mL LB 培养基（表 1；添加10 g/L葡萄糖、100 µg/mL 氨苄青霉素）于无菌的 14 mL 聚苯乙烯培养管中，用于有氧培养，并用无菌移液器吸头或接种环从琼脂平板上挑取单个菌落进行接种。
      注意：建议使用新转化的细胞菌落。步骤1.2中获得的细菌菌落平板可在4℃保存 °数天。
    2. 在37℃下孵育细胞 °在200-250 rpm的摇床中于C条件下过夜培养。
  2. 野生型 ECFP 的表达
    1. 接种10 mL新鲜LB培养基（表1；添加10 g/L葡萄糖、100 µg/mL 氨苄青霉素）与 100 µL 的过夜培养物于 100 mL 锥形瓶中。将锥形瓶在 37 °C 下孵育 °在200 rpm的摇床中于C条件下培养。
      注意：此步骤可选择在10 mL NMM19培养基中进行（表1) 加入 100 µg/L 氨苄青霉素和 0.5 mM L-色氨酸（也可使用吲哚）。
    2. 在600 nm处测量光密度（OD600每 20 分钟测量一次细胞密度，优先通过测定 600 nm 处的吸光度（OD）600使用光程为1 cm的比色皿在分光光度计中测量）值。始终使用相应的培养基进行参比测量。将样品稀释并充分混匀，使测量值落在0.1–0.8范围内，然后计算OD600 使用稀释因子进行计算。详情请参见先前的出版物 26.
    3. 当达到 OD600 OD值为0.5–0.8时（接种后约2–3小时），取样 "诱导前" 用于SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，步骤4）。
    4. 通过将液体培养物调节至0.5 mM IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）以诱导目标蛋白表达 β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷（来自1 M储存液），并在30 ℃下孵育 °在200 rpm的摇床中于C条件下振荡4-8小时。
      注意：青色荧光蛋白通常在低于37℃的温度下表达 °C27.
    5. 取样 "表达后" 用于 SDS-PAGE（步骤 4）。
    6. 通过离心收集细菌细胞，条件为 5,000 × g，4 ℃，离心 10 分钟 °C.
    7. 弃去上清液，将细胞沉淀在 -20 ℃ 冷冻 °C 或 -80 °直至目标蛋白纯化。
  3. 用于生产 GdFP 的 SPI 技术
    1. 接种10 mL NMM19培养基（表1）补充有100 µg/mL 氨苄青霉素，15 µM 色氨酸和 10 µ100 mL 锥形瓶中加入过夜培养物，在 30 ℃ 下过夜培养培养瓶 °在200 rpm的摇床中于C条件下培养。
      注意：多种化学成分明确的培养基可用于培养 E. coli 且SPI可用。除本文使用的NMM外，MOPS培养基28葡萄糖-矿物盐培养基29，戴维斯最低培养基30，M9 最小培养基31，或 GMML32 可以使用。
    2. 第二天，测定OD600 每30分钟测量一次，直至30分钟内的变化值小于0.05。平台期数值应约为1.0。
      注意：偏差由 ± 0.3 单位是可接受的。根据所使用的细菌菌株和培养基，初始色氨酸浓度（步骤 2.3.1）可能需要调整。
    3. 取样 "诱导前" 用于 SDS-PAGE（第 4 步）。
    4. 通过离心收集细菌细胞，条件为 5,000 × g，4 ℃，离心 10 分钟 °C. 通过倾倒弃去上清液。
    5. 用 10 mL 含 100 的 NMM19 培养基重悬细胞 µg/mL 氨苄青霉素加入 100 mL 锥形瓶中，再加入 4-氨基吲哚至终浓度为 1 mM（使用 50 mM 储备液）。继续在 30 °C 下孵育 30 分钟 °在200 rpm的轨道摇床中培养。
      注意：由于氨苄青霉素的化学稳定性较低，建议执行此步骤，以确保细胞对4-氨基吲哚的摄取。
    6. 通过加入IPTG至终浓度0.5 mM（使用1 M母液）诱导目标蛋白表达，并在30 °C下孵育样品过夜 °在200 rpm的摇床中于C条件下培养。
      注意：青色荧光蛋白通常在低于37℃的温度下表达 °C27.
    7. 第二天，测定OD600.
    8. 取样 "表达后" 用于 SDS-PAGE（步骤 4）。
    9. 通过离心收集细菌细胞，条件为 5,000 × g，4 ℃，离心 10 分钟 °C，倾倒弃去上清液。
    10. 如果未使用此类容器进行离心，需用刮勺将细胞沉淀转移至一个50 mL锥形聚苯乙烯管中。将细胞沉淀于-20℃冷冻 °C 或 -80 °直至目标蛋白纯化前均保持在 4°C。

3. 通过固定化金属离子亲和层析（IMAC）纯化目标蛋白

  1. 细菌细胞裂解
    1. 将细胞沉淀在冰上解冻10-20分钟。
    2. 在冰上用5 mL预冷的结合缓冲液（表1）将细胞沉淀重悬于50 mL锥形聚苯乙烯管中。
    3. 加入20 µL 50 mg/mL溶菌酶、20 µL 1 mg/mL DNase I和20 µL 1 mg/mL RNase A。盖紧管盖，轻轻倒置混匀5次，冰上孵育30分钟。
      注：溶菌酶催化作用下发生部分细胞裂解。
    4. 使用超声波均质器探头在15 mL聚苯乙烯管中进行超声裂解，共进行3个循环，每个循环3分钟，冰浆冷却，脉冲2秒，暂停4秒，振幅45%。
      注：也可采用高压均质法，例如，14,000 psi条件下进行20个循环。如有需要，可用结合缓冲液稀释至仪器所需的最小体积。此外，也可使用蛋白提取试剂进行细胞裂解。参见材料表中的示例。
    5. 在4 °C条件下，以15,000-18,000 × g离心30分钟。
    6. 将上清液转移至新管中，并记录液体体积。
    7. 使用5 mL塑料鲁尔锁注射器和聚偏二氟乙烯（PVDF）注射式滤器，通过0.45 µm注射式滤器过滤溶液。
    8. 取“裂解液”样品用于SDS-PAGE（步骤4）。
    9. 用ddH2O（体积与先前裂解液体积相等）重悬细胞碎片沉淀。
    10. 取“沉淀”样品用于SDS-PAGE（步骤4）。
  2. IMAC纯化
    1. 根据制造商说明使用1 mL预装或自装的IMAC FPLC（快速蛋白液相色谱）柱。使用结合缓冲液（表1）对色谱柱进行平衡，并在将细胞裂解液上样后用于后续洗涤步骤。
    2. 收集并合并含有GdFP的洗脱组分，可通过肉眼观察金黄色判断。
      注：可选使用自动FPLC系统，采用线性咪唑梯度（0-250 mM）洗脱目标蛋白。
    3. 使用文献报道的466 nm处消光系数（ɛ466 nm = 23,700 M-1 cm-1）33测定蛋白浓度，以洗脱缓冲液作为空白对照。具体操作细节请参见先前发表的研究26。
    4. 取“洗脱液”样品用于SDS-PAGE，若使用考马斯亮蓝染色，每条泳道上样量为1-10 µg蛋白。
      注：SDS样品上样量可根据染色方法和染料灵敏度进行调整。
    5. 取部分洗脱组分，使用截留分子量（MWCO）为5,000-10,000的透析膜，对透析缓冲液或质谱缓冲液进行透析。按制造商说明制备透析膜。每次用100 mL缓冲液透析1 mL样品，至少2小时，共更换缓冲液三次。该操作的具体细节请参见先前发表的研究34。
    6. 储存时，将蛋白样品在透析缓冲液中分装并于-80 °C冷冻保存。
      注：分装样品在-80 °C下至少可稳定保存6个月。

4. SDS-PAGE 样品制备 E. coli 全细胞提取物

  1. 转移相当于1 mL OD的细胞悬液600 = 1 悬液例如. 500 µ光密度升600=2) 转移至1.5 mL 微量离心管中。
  2. 以5000 × g离心10分钟收集细胞，室温条件下进行。用移液器弃去上清液。
  3. 加入80 µddH₂O 的升数2氧和20 µ5× SDS上样缓冲液，L表1) 加入细胞沉淀中，并用移液器吹打混匀。
  4. 通过加热至95℃使细胞变性 °在水浴或加热块中于 37°C 下孵育 5 分钟。随后将样品冷却至室温。
  5. 使用10 µ根据先前发表文献进行考马斯亮蓝染色SDS-PAGE的L组分分析35.
    注意：SDS 样品用量可能因染色方法和染料灵敏度而异。

5. 通过高效液相色谱-电喷雾电离飞行时间质谱联用技术（LC-ESI-TOF-MS）进行完整蛋白质质量分析

注意：HPLC 梯度、设置和缓冲液可能因所使用的分离柱和仪器而异。示例设备请见材料表。

  1. 使用上述方法（步骤 3.2.3）将样品对 MS 缓冲液透析后，以 MS 缓冲液（见材料表）作为空白对照，测定蛋白浓度。
  2. 用 MS 缓冲液将蛋白样品稀释至 0.1 mg/mL，终体积为 80 µL，轻轻吹打混匀，转移至带有玻璃插件的 MS 自动进样瓶中，并盖上瓶盖。通过轻弹进样瓶去除气泡。
  3. 取另一个无玻璃插件的自动进样瓶（空白对照），加入 1 mL MS 缓冲液。
  4. 让仪器预热，进行仪器校准，并确保液相色谱级溶剂储备充足（>100 mL）。
  5. 设置一个 20 分钟的线性 HPLC 梯度程序，流动相 A（ddH2O 中含 0.1% 甲酸）从 5% 升至 80%，同时与流动相 B（乙腈中含 0.1% 甲酸）混合。
  6. 以 0.3 mL/min 的流速启动 HPLC，待柱压稳定后继续操作。
  7. 设定 LC-ESI-TOF-MS 方法的自动进样器进样体积为 5 µL，创建一个工作序列，先运行空白样品，再运行目标样品，并指定相应的自动进样瓶位置，然后运行该序列。
  8. 工作序列完成后，打开生成的样品数据文件。在总离子流（TIC）图中选择一个范围进行去卷积，使用最大熵去卷积算法对质谱图进行去卷积处理。
    注意：根据实验条件的不同，可能会出现未成熟荧光蛋白或缓冲液离子加合物等额外峰。

6. GdFP的荧光寿命测量与衰减相关光谱（DAS）

注意：有关时间分辨荧光光谱仪的设备，请参见材料表中的示例仪器。荧光蛋白的吸光度以及荧光激发和发射光谱也可使用实验室的紫外/可见光及荧光分光光度计进行测定。

  1. GdFP 的波长分辨荧光寿命测量
    1. 将 GdFP 用 pH 7 的 PBS 缓冲液（表 1）稀释，配制 2 mL 浓度为 1 µM 的溶液，并将该溶液加入 1 cm 石英比色皿中。
    2. 安装用于样品激发的皮秒脉冲 470 nm 激光器和 488 nm 长通发射滤光片，并调节时间-波长相关单光子计数36（TWCSPC）探测器的 600 L/mm 光栅，以采集 500–700 nm 波长范围的数据。
    3. 使用单光子计数软件采集荧光发射信号，计数率约为 200 × 103 光子/秒，直至荧光衰减曲线的采集最大值处累积约 103 个计数。
  2. 仪器响应函数37（IRF）的测量
    1. 将样品比色皿替换为装有 1 cm 石英比色皿的 PBS 缓冲液（pH 7）中含 1 g/L 胶体二氧化硅（~220 m2/g）的悬浮液。
      注：二氧化硅悬浮液使用 400 g/L 水悬浮液配制而成。
    2. 移除 488 nm 长通发射滤光片，并插入中性密度滤光片，将 TWCSPC 探测器的计数率调节至低于 100 × 103 计数/秒。
    3. 调节光栅，使 470 nm 光子在 16 通道 TWCSPC 探测器的第 8 通道进行采集。
    4. 采集 IRF，直至发射最大值处累积约 10 × 103 个计数。
    5. 使用全局拟合38程序将荧光衰减曲线和 IRF 转换为 ASCII 数据文件。
    6. 根据包含三个指数组分之和的模型进行全局拟合，其中寿命作为关联参数。
    7. 使用数据分析软件绘制衰减相关光谱（DAS），即各衰减组分的振幅随波长的分布图。

结果

利用选择性压力掺入技术，可将ECFP发色团三联体中的Trp-66（以及ECFP中唯一的另一个Trp残基Trp-57）替换为4-氨基-Trp，从而生成具有独特光谱特性的红移型GdFP。必须使用质谱法证明非天然氨基酸以期望的化学计量比整合到蛋白质中，结果如图1所示。随后，我们提供了显微镜、紫外-可见吸收光谱以及稳态和时间分辨、波长分辨荧光光谱的数据，以表征GdFP荧光团的性质，重点关注光谱的pH依赖性。

为了确认ECFP中两个Trp残基被4-氨基-Trp取代，进行了质谱分析。图1展示了GdFP的代表性去卷积ESI-MS谱图。野生型ECFP在发色团成熟后的理论蛋白分子量为28,283.9 Da，而GdFP的相应分子量为28,313.9 Da。GdFP的去卷积ESI-MS谱图显示主峰质量为28,314.1 ± 0.1 Da，与理论值偏差小于10 ppm。该偏差处于此类分析的典型准确度范围内25，证实了通过SPI实现了非天然氨基酸（ncAA）的整合（野生型ECFP的实验值：28,283.7 Da）。

图2展示了将表达ECFP、EGFP、EYFP和GdFP的细菌细胞重悬于PBS缓冲液后，通过共聚焦荧光成像显微镜（CFIM）获得的图像。所有图像均使用配备紫外物镜的显微镜采集，并对每个样品施加大致相同的激光激发能量。

图3A展示了表达多种荧光蛋白（包括GdFP）的大肠杆菌（E. coli）的CFIM图像叠加结果，所有图像均在非常相似的激发能量下采集（激发波长同图2所示）。图3B展示了上述荧光蛋白变体的发色团结构。关于GdFP与ECFP（荧光量子产率φ = 0.4）、EGFP（φ = 0.6）和EYFP（φ = 0.6）的亮度比较，需要注意的是，为了将图像强度调整至相近水平，GdFP采用了更宽的荧光光采集范围（30 nm），而其他所有荧光蛋白均使用20 nm的采集范围。由于独特的光物理特性，GdFP的消光系数略低且量子产率降低，因此其亮度低于所示的其他荧光蛋白。

ECFP的吸收光谱（图3C）在434 nm和452 nm处有两个特征性吸收峰。相比之下，GdFP表现为一个较宽且红移的吸收带，其最大吸收峰位于466 nm。EGFP的吸收进一步红移至488 nm。然而，由于GdFP的斯托克斯位移（108 nm）远大于ECFP（41 nm）和EGFP（20 nm），因此GdFP的发射光谱在这三种GFP衍生物中红移程度最大（图3D）。ECFP的荧光发射在475 nm和505 nm处呈现两个特征性峰，而EGFP则具有一个较宽的主发射带，其峰值位于508 nm（λmax），并在540 nm处有一个微弱肩峰。GdFP的荧光发射出现在约565 nm（λmax.）处（图3D）。其发射光谱中包含少量野生型ECFP的贡献，这在475 nm处表现为一个微小的肩峰。这一少量ECFP组分是在SPI过程中诱导前合成的，如文献33所述。

图3E 显示了GdFP吸收光谱随pH变化的依赖性。当pH从8降至5时，其发射最大值略微红移，且吸收带略有展宽。然而，在pH 8至pH 5范围内，吸收强度的降低仅约为10%，表明GdFP发色团的基态性质受pH影响极弱。

通过单光子计数监测的时间分辨荧光发射如图4所示。在中心波长为550 nm和600 nm的光谱通道中监测到的衰减曲线（图4A）显示，600 nm处的荧光衰减略快于550 nm处的衰减。对荧光衰减曲线进行全局拟合，采用双指数组分模型，得到两个在光谱上可区分的荧光衰减组分，其时间常数分别为1.0 ns和3.3 ns（图4C 和 D）。

GdFP的荧光发射强烈依赖于pH值，这在GFP家族的许多荧光蛋白变体中具有代表性。图4B比较了pH 5和pH 8条件下GdFP的荧光发射，明显显示在较低pH值下荧光强度下降，而光谱特征保持不变。

GdFP 的衰减相关光谱（DAS）39（图 4C 和 D）表现出两个明显的发射带。在约 550 nm 的短波长范围内，较慢的 3.3 ns 组分贡献更为显著（60%），而较快组分的贡献较小（40%）。在 600 nm 处，两个组分的幅值大致相同。当 pH 从 7（图 4C）变为 6（图 4D）时，DAS 的光谱特征几乎没有变化，全局拟合程序得到的时间常数也相同（DAS 时间常数的精度约为 ±0.15 ns）。然而，两个 DAS 组分的绝对幅值差异明显，这完全可以解释在相同 pH 变化下 图 4B 中荧光发射幅值的降低。

质谱结果，图表显示 ECFP 和 GdFP 蛋白的分子质量与归一化强度关系。
图1：GdFP 的代表性去卷积 ESI-MS 谱图。 GdFP 的 ESI-MS 谱图（金色，放大图以插图形式显示）在 28314.1 Da 处显示一个主峰（计算值为 28313.9 Da）。野生型 ECFP 的谱图以黑色显示。请点击此处查看该图的放大版本。

荧光蛋白比较，显微镜；细胞成像分析中的 ECFP、EGFP、EYFP、GdFP。
图 2：表达不同荧光蛋白的细菌群体的共聚焦荧光显微镜图像。 图像采集使用的波长设置如下：ECFP（λex = 457 nm，检测：461–480 nm）、EGFP（λex = 488 nm，检测：495–515 nm）、GDFP（λex = 476 nm，检测：560–590 nm）、EYFP（λex = 514 nm，检测：520–530 nm）。请点击此处查看此图的放大版本。

荧光蛋白表征；吸收光谱、荧光光谱、分子结构、显微镜观察。
图3：GdFP的光谱特性。（A）将表达ECFP、EGFP和GdFP的细菌细胞混合后重悬于PBS缓冲液中，其共聚焦显微镜（CFIM）图像。（B）GdFP（第66位残基为4-氨基色氨酸）、亲本ECFP（第66位为色氨酸）和EGFP（第66位为酪氨酸）的发色团结构。（C）GdFP、ECFP和EGFP的归一化吸收光谱比较；而在（D）中，将ECFP（在430 nm激发）的归一化荧光发射光谱与EGFP和GdFP（均在450 nm激发）的荧光发射光谱进行比较。（E）吸收光谱的pH依赖性（在280 nm处归一化吸收）。请点击此处查看该图的放大版本。

荧光衰减和振幅光谱；不同pH条件下的时间分辨发射；图谱分析。
图 4：GdFP 的时间分辨荧光。（A）在470 nm激光脉冲激发后，通过时间分辨和波长分辨的单光子计数法，在中心波长为550 nm和600 nm（±12.5 nm）的光谱通道中监测GdFP的荧光衰减。仪器响应函数（IRF）提供了所用装置时间分辨率的信息。（B）GdFP发射光谱随pH的变化（激发波长为460 nm）。（C, D）在pH 7（C）和pH 6（D）条件下，通过对全波长范围的时间分辨荧光衰减曲线进行去卷积处理，并使用一组全局共享的双指数函数（时间常数关联）对所有通道的衰减进行全局拟合，得到GdFP的衰减相关光谱（DAS）。请点击此处查看该图的放大版本。

蛋白质结构平衡；发色团异构化示意图；荧光蛋白分析。
图5：ECFP（黑色）和GdFP（金色）发色团分子内电荷转移的结构。 由于非天然氨基酸（ncAA）中的氨基作为强电子供体，使发色团体系尺寸增大，从而能够形成更多的共振结构，实现激发态的共振稳定。与荧光蛋白骨架的连接点以半圆形表示。请点击此处查看该图的放大版本。

储备液浓度，溶剂备注
20% D-葡萄糖200 g/L D-葡萄糖溶于ddH2O通过0.45 µm孔径的注射器滤器过滤除菌
吲哚50 mM 溶于异丙醇
4-氨基吲哚50 mM 溶于20%乙醇（20 mL乙醇加ddH2O定容至100 mL）
IPTG1 M 溶于ddH2O
L-色氨酸15 mM 溶于ddH2O，使用1 M HCl溶解（边搅拌边逐滴加入HCl，直至粉末完全溶解）
溶菌酶50 mg/mL 溶于ddH2O
DNase I1 mg/mL 溶于ddH2O
RNase A1 mg/mL 溶于ddH2O
Amp100100 mg/mL 氨苄青霉素溶于ddH2O
十二烷基硫酸钠（SDS）200 g/L 溶于ddH2O
硫酸铵（(NH4)2SO4）1 M 溶于ddH2O通过高压灭菌除菌
磷酸二氢钾（KH2PO4）1 M 溶于ddH2O通过高压灭菌除菌
磷酸氢二钾（K2HPO4）1 M 溶于ddH2O通过高压灭菌除菌
硫酸镁（MgSO4）1 M 溶于ddH2O通过高压灭菌除菌
D-葡萄糖1 M 溶于ddH2O通过0.45 µm孔径的注射器滤器过滤除菌
氯化钠（NaCl）5 M 溶于ddH2O通过高压灭菌除菌
氯化钙（CaCl2）1 g/L通过0.45 µm孔径的注射器滤器过滤除菌
氯化亚铁（FeCl2）1 g/L通过0.45 µm孔径的注射器滤器过滤除菌
硫胺素10 g/L通过0.45 µm孔径的注射器滤器过滤除菌
生物素10 g/L通过0.45 µm孔径的注射器滤器过滤除菌
微量元素混合液硫酸铜（CuSO4）、氯化锌（ZnCl2）、氯化锰（MnCl2）、钼酸铵（(NH4)2MoO4）；每种1 mg/L溶于ddH2O通过0.45 µm孔径的注射器滤器过滤除菌
19种氨基酸混合液1.) 将0.5 g L-苯丙氨酸和0.5 g L-酪氨酸溶于100 mL ddH2O中，边搅拌边逐滴加入1 M HCl，直至粉末完全溶解。
2.) 称取其余每种L-氨基酸（除L-色氨酸外）各0.5 g，与22 mL 1 M KH2PO4和48 mL 1 M K2HPO4混合，加入ddH2O至约800 mL，搅拌至溶液澄清。
3.) 加入第1步中已溶解的L-苯丙氨酸和L-酪氨酸溶液，并用ddH2O定容至1 L。
4.) 使用瓶顶式真空滤器对氨基酸混合液进行过滤除菌。
缓冲液与培养基成分/制备
5× SDS上样缓冲液 0.25 M Tris（pH 6.8），50 %（v/v）甘油，0.25 %（w/v）溴酚蓝，0.5 M 二硫苏糖醇（DTT；或替代使用 5 % β-巯基乙醇），10 %（w/v）十二烷基硫酸钠（SDS）
结合缓冲液50 mM 磷酸二氢钠（NaH₂PO₄）2PO4），500 mM NaCl，10 mM 咪唑，pH 8
洗脱缓冲液50 mM 磷酸二氢钠（NaH2PO4），500 mM NaCl，250 mM 咪唑，pH 8
透析缓冲液50 mM 磷酸二氢钠（NaH2PO4），150 mM NaCl，100 mL/L 甘油，pH 8
MS缓冲液10 mM Tris-HCl，pH 8
不含L-色氨酸的19种L-氨基酸新最低培养基（NMM19）将所有储备液混合，得到以下终浓度：7.5 mM (NH₄)₂SO₄，15 mM KH₂PO₄，7.5 mM Na₂HPO₄，1.5 mM 谷氨酰胺，0.15 mM 组氨酸，0.15 mM 异亮氨酸，0.15 mM 亮氨酸，0.15 mM 赖氨酸，0.15 mM 甲硫氨酸，0.15 mM 苯丙氨酸，0.15 mM 苏氨酸，0.15 mM 色氨酸，0.15 mM 缬氨酸，0.15 mM 丙氨酸，0.15 mM 天冬酰胺，0.15 mM 天冬氨酸，0.15 mM 谷氨酸，0.15 mM 甘氨酸，0.15 mM 脯氨酸，0.15 mM 丝氨酸，0.15 mM 酪氨酸，0.075 mM 精氨酸，0.075 mM 半胱氨酸，0.075 mM 葡萄糖，0.075 mM 乳酸，0.075 mM 丙酮酸，0.075 mM α-酮戊二酸，0.075 mM 琥珀酸，0.075 mM 苹果酸，0.075 mM 柠檬酸，0.075 mM 乙酸，0.075 mM 甲酸，0.075 mM 乙醇，0.075 mM 甘油，0.075 mM 乙醛，0.075 mM 乙胺，0.075 mM 甲胺，0.075 mM 二甲胺，0.075 mM 三甲胺，0.075 mM 甲醇，0.075 mM 乙二醇，0.075 mM 丙二醇，0.075 mM 丙三醇，0.075 mM 丙酮，0.075 mM 丁酮，0.075 mM 戊酮，0.075 mM 己酮，0.075 mM 庚酮，0.075 mM 辛酮，0.075 mM 壬酮，0.075 mM 癸酮，0.075 mM 十一酮，0.075 mM 十二酮，0.075 mM 十三酮，0.075 mM 十四酮，0.075 mM 十五酮，0.075 mM 十六酮，0.075 mM 十七酮，0.075 mM 十八酮，0.075 mM 十九酮，0.075 mM 二十酮。4)2SO4，1.7 mM NaCl，22 mM KH2PO4，50 mM K2HPO4，1 mM MgSO₄4，20 mM D-葡萄糖，50 mg/L 19种氨基酸混合物 1 µg/L CaCl2, 1 µg/L FeCl2, 10 µg/L 硫胺素，10 mg/L 生物素，0.01 mg/L 微量元素混合液
LB培养基成分：10 g/L 胰蛋白胨，5 g/L 酵母提取物，10 g/L NaCl，用 ddH₂O 调至 pH 7.02O
准备： 
1.) 称取50 g胰蛋白胨、25 g酵母提取物、5 g NaCl，加入1 L玻璃瓶中。
2.) 加 ddH2O 至约 800 mL，并在搅拌下溶解各组分。
3.) 测定pH值，必要时逐滴加入1 M HCl或1 M NaOH调节至pH 7。加ddH2O定容至1 L。
4.) 通过高压灭菌进行灭菌，随后检查体积损失，并补充无菌ddH₂O2O，必要时进行补偿。储存于 4 °C 直至使用。
LB 琼脂平板成分：10 g/L 胰蛋白胨，5 g/L 酵母提取物，10 g/L NaCl，15 g/L 琼脂，ddH₂O 中 pH 7.02O
准备： 
1.) 称取50 g胰蛋白胨、25 g酵母提取物、5 g NaCl、7.5 g琼脂，加入1 L玻璃瓶中。
2.) 加入ddH₂O2最多加至 500 mL，并在搅拌下溶解各组分。
3.) 测定pH值，必要时逐滴加入1 M HCl或1 M NaOH调节至pH 7。加ddH2O定容至1 L。
4.) 高压灭菌，随后检查体积损失，并补充无菌 ddH₂O2O，如有必要可进行补偿。（注意：LB 琼脂可保存于 4 °C 直至用于制备 LB 琼脂平板前。使用微波炉小心融化已凝固的琼脂。
5.) 当溶液仍处于温热状态（30-40 °C），加入氨苄青霉素至终浓度为 100 µg/mL
6.) 在无菌条件下，将步骤5中的约15 mL液体倒入无菌的10 cm培养皿中。待琼脂凝固后，平板可在4℃保存1周 4 °C 直至使用。
磷酸盐缓冲液（PBS）成分：137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，1.8 mM KH2PO4，1 mM CaCl2，0.5 mM MgCl2，pH 7。通过高压灭菌或过滤除菌。

表1：储备液与缓冲液。

讨论

为了实现非常高的非天然氨基酸（ncAA）掺入效率，基于营养缺陷型的SPI方法依赖于使用代谢工程改造的宿主细胞，这些细胞无法合成相应天然氨基酸。对于E. coli而言，此类菌株 readily available。甚至可以利用多重营养缺陷型菌株实现将多个ncAA同时掺入同一蛋白质中。然而，该方法存在一些局限性，例如只能进行残基特异性的替换，且化学种类受限于结构相似的化学类似物。尽管如此，由于天然细菌翻译系统能够耐受多种氨基酸类似物，仍可产生大量蛋白质变体。例如，利用in vitro翻译系统已成功将超过50种ncAA掺入蛋白质中，相当于遗传密码中约73%的密码子可用于重新分配40。此外，SPI还可实现目标蛋白的高效多位点标记41。原则上，SPI技术不仅限于E. coli，只要存在相应的营养缺陷型菌株和明确的培养基条件，该方法可在其他任何宿主中应用于全部20种天然氨基酸。例如，两种甲硫氨酸类似物——叠氮高丙氨酸（Aha）和高丙炔基甘氨酸（Hpg）——已有商业化产品，并被用于多种生物体中的蛋白质和蛋白质组标记。此外，Aha可在细胞内合成并随后掺入蛋白质42。这种ncAA特别适用于生物正交偶联反应，如Tirrel及其同事开发的点击化学技术：例如，在拟南芥（Arabidopsis thaliana）植物组织、家蚕（Bombyx mori）幼虫43、果蝇（Drosophila）细胞44、斑马鱼幼鱼45以及包括神经元在内的哺乳动物细胞46中，均可使用Aha对蛋白质进行标记47,48。类似地，色氨酸类似物已在色氨酸营养缺陷型的乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）菌株中成功掺入抗菌肽中49。SPI在异源生物学（Xenobiology）领域也具有重要应用价值50,51，该领域致力于探索生命基本化学组成的替代方案。例如，基于先前在E. coli52和B. subtilis53中的研究，最近通过施加选择压力的进化策略开发出一种E. coli菌株，能够利用噻吩吡咯代替吲哚，从而在全蛋白质组范围内实现遗传密码中色氨酸被噻吩吡咯丙氨酸取代54。通常情况下，由单一三联体密码子（UGG）编码的天然氨基酸Trp因其吲哚化学结构的丰富多样性而成为蛋白质工程中极具前景的靶点，提供了多种化学修饰的可能性。最近，作为一种替代基于SPI掺入的方法，已有研究报道了一种新型的SCS平台，能够在原核和真核宿主中实现色氨酸类似物的位点特异性掺入55。这进一步拓展了基于in vivo非天然氨基酸的蛋白质工程工具箱，包括对光谱性质的改造。

除了使用营养缺陷型表达宿主外，SPI 实验方案还要求严格的发酵条件，包括目标蛋白表达时机和培养基组成，以实现高效的非天然氨基酸（ncAA）掺入效率和目标蛋白产量56。培养采用化学成分明确的最低培养基，其中主要包含大量盐类、氮源（铵盐）和碳源（D-葡萄糖）、维生素及微量元素。尽管在无其他营养缺陷的情况下并非严格必需，通常仍会添加其余氨基酸（20-n，若需替换 n 种氨基酸），以促进细菌生长57。在诱导目标蛋白表达前的初始生长期，将待替换的 n 种天然氨基酸以限制性浓度加入。细胞持续生长直至这些目标必需氨基酸耗尽，实验上表现为 OD600 进入平台期。随后，将培养基更换为不含已耗尽氨基酸但含有高浓度 ncAA 的新鲜培养基。对于本方案中所示的色氨酸类似物的核糖体掺入，需添加一种吲哚类似物，其在细胞内由色氨酸合酶转化为相应的色氨酸衍生物58。接着诱导目标蛋白表达。在此阶段，细胞接近对数生长末期，以平衡总体细胞数量与细胞活性。由于天然氨基酸的存在和掺入将导致野生型蛋白的产生，因此在诱导前必须确保必需氨基酸已完全耗尽。同样，必须检测 ncAA 掺入目标蛋白的效率，通常通过质谱分析进行。若检测到大量天然氨基酸的存在，则需要调整培养条件，例如，改变初始生长期中必需氨基酸的浓度或持续时间。若氨酰-tRNA 合成酶（aaRS）对 ncAA 的活性较低，可进行内源酶的过表达，或共表达对 ncAA 活性更高的其他 aaRS59。

天然氨基酸Trp具有三个显著特征：（i）其在蛋白质中的天然丰度较低；（ii）其生物物理和化学性质独特（例如，它通常是蛋白质和多肽本征荧光的主要来源）；（iii）它参与多种生化相互作用和功能，包括π-堆积、氢键和阳离子-π相互作用。在GdFP中，Trp → 4-氨基-Trp的取代使所有这些特征发生了根本性改变。毫无疑问，设计一类“金”级avGFP是定制化设计自荧光蛋白工程的杰出范例。通过定点突变和非天然氨基酸（ncAA）的引入，可针对特定光谱窗口调节荧光蛋白的光谱特性。对于GdFP而言，这一目标是通过ECFP发色团三联体中吲哚环结构内的一个简单化学取代H → NH2实现的。图5展示了ncAA引入发色团后产生的效应。源自4-氨基吲哚（在细胞内转化为4-氨基-Trp）的给电子基团的引入，使得多种共振结构成为可能，从而可解释激发态的稳定性增强。从光谱学角度看，其增大的斯托克斯位移和红移的荧光发射正是源于扩展共轭体系的这些独特性质。如先前报道，GdFP发色团内部增强的分子内电荷转移对pH具有内在敏感性（图4B），且相对于ECFP，其基态（S0）与激发态（S1）之间的偶极矩变化更大33。作为其他可选的给电子基团，带有羟基取代吲哚环的色氨酸类似物也可被使用，这已在针对模型蛋白barstar的比较研究中有所报道41。

与ECFP和EGFP相比，GdFP的吸收光谱和荧光光谱更宽（图3C 和 D）。吸收带和荧光带的均匀展宽通常由发色团内的振动模式引起，此外还可能源于发色团与蛋白质中其他振动模式的耦合60。发色团上局域的电荷有助于其与局部蛋白环境的耦合。由于蛋白质的结构不均一性会导致振动光谱的局部变化，因此如图5所示，发色团的振动光谱与蛋白质其余部分之间的耦合可由电荷离域和共振态支持。这种耦合也促成了较大的斯托克斯位移，但必然降低了荧光量子产率。与其他红移荧光蛋白（FP）相比，GdFP表现出更优的蛋白稳定性以及较低的聚集倾向33,61,62。它不仅在颜色上与其他FP变体不同，还表现出显著提高的热稳定性和增强的协同折叠能力33。当加热至60 °C时，其荧光强度仍能保持至少90%，而ECFP的荧光则下降至约30%。在蛋白质中，芳香族氨基酸通常参与侧链相互作用网络，这类网络通常对蛋白质的三级结构具有稳定作用。avGFP含有此类侧链网络，包括发色团本身以及Phe-165、His-148和Tyr-145。这些侧链在GdFP结构中不仅表现出较高的刚性33，更重要的是，它们与发色团形成了疏水相互作用。在GdFP中发现的最显著的新特征是，氨基化的发色团与Phe-165的距离更近。这种相互作用在其他已知的avGFP中均未观察到。由于这两个残基之间的距离为3.2–4.5 Å，可能存在氨基-芳香相互作用。结合氨基化引起的发色团共振稳定效应，这些因素很可能以协同方式稳定了该氨基酸的疏水网络。与发色团基态相比，这些相互作用可能在激发态下促进更有效的分子内电荷转移，至少部分解释了108 nm的斯托克斯位移33,62。

在荧光团性质的理性设计中，离域π体系的增大预计会导致激发波长发生红移。这一经验规律在第66位氨基酸形成中性发色团的系列中得到遵循：Phe（λmax = 355 nm）＜ His（λmax = 386 nm）＜ Tyr（λmax = 395 nm）＜ Trp（λmax = 436 nm）63。在自然界中，发色团π键共轭体系的延伸已通过不同策略实现。例如，来自Discosoma striata的DsRed通过整合一个额外的氨基酸实现了共轭体系的延伸，从而使λmax红移至573 nm64。来自Anemonia sulcata的asFP595（λmax = 595 nm）则通过引入一个亚氨基扩展了其发色团的π体系65。由于GdFP及其他avFPs的发色团尺寸相同，因此必须采用不同的机制才能实现与扩展型DsRed和asFP595发色团相当的发射波长。GdFP高达108 nm的显著斯托克斯位移归因于其发色团独特的结构，揭示了自荧光蛋白设计中一种新的光物理原理。初步计算（如文献62所报道）表明，GdFP激发态发色团的偶极矩显著大于其基态，这与ECFP的情况相反。GdFP的偶极矩从S0态的约3 D（德拜）增加到S1态的约15 D，而ECFP发色团的偶极矩变化则较为温和（从约4 D增至约6 D）。因此，GdFP独特的金色荧光源于发色团内部显著的分子内电荷转移，这种电荷转移增加了可能的共振结构（见图5）数量，从而实现共振稳定化，降低了发生发射的能级。由于激发后偶极矩发生显著变化，分子内电荷分离是发色团周围环境静电势改变的主要原因。周围的蛋白质基质随之响应发色团激发后的电荷分布变化而进行调整。随后的结构弛豫进一步降低了激发态发色团的能量水平，因其具有电荷转移特性，导致荧光光谱向红光方向移动。同样由于这一机制，加之较大的斯托克斯位移以及非辐射过程速率增强，GdFP的荧光量子产率相较于ECFP有所降低33。

ECFP 和 EGFP 的高荧光量子产率和小斯托克斯位移通常归因于发色团所处的刚性蛋白环境，这种环境减少了自由度，从而降低内转换，有利于激发态的辐射弛豫66。因此，设计更牢固嵌入且与其余蛋白基质耦合作用较弱的刚性发色团，可作为指导策略，用于构建具有高荧光量子产率的更远红移 GFP 衍生物。因此，在进一步构建红移自荧光蛋白的工程化策略中，扩展 π 电子体系并形成与蛋白环境弱耦合的刚性发色团结构尤为理想。此类修饰可直接引入基于 GFP 的发色团中，或通过在发色团附近引入所需的非经典氨基酸（ncAAs）来实现。

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作由德国研究基金会（催化统一概念卓越集群）资助T.F.和N.B.，以及由德国联邦教育与研究部（BMBF项目“HSP 2020”，TU-WIMIplus项目SynTUBio）资助F.-J.S.。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
化学品
4-氨基吲哚Sigma-Aldrich525022
乙腈VWRHiPerSolv CHROMANORM ULTRA 用于液相色谱-质谱，83642需使用液相色谱-质谱联用级试剂
琼脂-琼脂卡尔·罗斯5210
钼酸铵 ((NH₄)₂MoO₄)4)2MoO4)Sigma-Aldrich277908
硫酸铵 ((NH₄)₂SO₄)4)2SO4)Sigma-AldrichA4418
氨苄青霉素钠盐卡尔·罗斯K029
生物素Sigma-AldrichB4501
溴酚蓝Sigma-AldrichB0126
氯化钙（CaCl2)Sigma-AldrichC5670
胶体二氧化硅Sigma-AldrichLudox HS-40, 420816
考马斯亮蓝 R 250卡尔·罗斯3862
硫酸铜（CuSO₄）4)卡尔·罗斯CP86.1
D-葡萄糖卡尔·罗斯6780
二钠氢磷酸盐（Na2高功率物镜4)卡尔·罗特X987
二钾磷酸氢盐（K2HPO4)卡尔·罗斯P749.1
1,4-二硫苏糖醇（DTT）Carl Roth6908
DNase ISigma-AldrichD5025
乙醇卡尔·罗斯9065.1
甲酸VWRHiPerSolv CHROMANORM LC-MS用，84865需使用液相色谱-质谱联用级试剂
甘油卡尔·罗斯3783
咪唑卡尔·罗斯X998
吲哚Sigma-AldrichI3408
氯化亚铁（FeCl₂）2)Sigma-Aldrich380024
异丙醇卡尔·罗特AE73.1
异丙基 β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）Sigma-AldrichI6758
溶菌酶Sigma-AldrichL6876
氯化镁（MgCl2)卡尔·罗斯KK36.1
硫酸镁（MgSO₄）4)Carl Roth8283.2
氯化锰（MnCl₂）2)Sigma-Aldrich63535
β-巯基乙醇卡尔·罗斯4227.3
氯化钾（KCl）卡尔·罗斯6781.3
磷酸二氢钾（KH₂PO₄）2PO4)Sigma-AldrichP5655
RNase A卡尔·罗特7156
氯化钠（NaCl）卡尔·罗特P029
磷酸二氢钠（NaH2PO4)卡尔·罗斯T879
十二烷基硫酸钠（NaC12H25SO4)卡尔·罗斯0183
硫胺素Sigma-AldrichT4625
三(羟甲基)氨基甲烷（Tris）卡尔·罗斯5429
Tris 盐酸盐（Tris-HCl）Sigma-Aldrich857645
胰蛋白胨卡尔·罗斯8952
酵母提取物卡尔·罗特2363
氯化锌（ZnCl₂）2)Sigma-Aldrich229997
名称公司目录编号评论
氨基酸
L-丙氨酸Sigma-AldrichA7627
L-精氨酸Sigma-AldrichA5006
L-天冬酰胺Sigma-AldrichA8381
L-天冬氨酸Sigma-AldrichA0884
L-半胱氨酸Sigma-AldrichC7352
L-谷氨酸Sigma-AldrichG2128
L-谷氨酰胺Sigma-AldrichG3126
L-甘氨酸Sigma-AldrichG7126
L-组氨酸Sigma-AldrichH8000
L-异亮氨酸Sigma-AldrichI2752
L-亮氨酸Sigma-AldrichL8000
L-赖氨酸Sigma-AldrichL5501
L-甲硫氨酸Sigma-AldrichM9625
L-脯氨酸Sigma-AldrichP0380
L-苯丙氨酸Sigma-AldrichP2126
L-丝氨酸Sigma-AldrichS4500
L-苏氨酸Sigma-AldrichT8625
L-色氨酸Sigma-AldrichT0254
L-酪氨酸Sigma-AldrichT3754
L-缬氨酸Sigma-AldrichV0500
名称公司目录编号评论
实验材料
0.45 µm 聚偏二氟乙烯膜注射器滤器卡尔·罗斯CCY1.1
1.5 mL 微量离心管Eppendorf30120086
50 mL 圆锥形聚苯乙烯（Falcon）管Fisher Scientific14-432-22
5 mL 鲁尔锁注射器卡尔·罗斯EP96.1
透析膜，分子量截留值（MWCO）5,000Spectrum Medical IndustriesSpectra/Por 截留分子量 5000 透析膜，133198
固定化金属离子亲和层析柱（IMAC）1 mL，Ni-NTAMacherey NagelProtino 系列，745410.5
培养皿（聚苯乙烯，无菌）卡尔·罗斯TA19
pQE-80L 质粒载体Qiagen内容不再可用被N端pQE载体组替换 货号/ID： 32915
蛋白提取试剂 BugBusterEMD Millipore70921-4
14 mL 圆底聚苯乙烯管Fisher ScientificCorning Falcon，14-959-1B
色氨酸营养缺陷型 E. coli 菌株ATCCATCC 49980Bridges BA 等，Chem Biol Interact.，1972，5(2):77-84；替代方案见正文
名称公司目录编号评论
质谱仪设备
用于液相色谱-电喷雾电离-飞行时间质谱的质谱仪安捷伦Agilent 6530 准确质量QTOF与 Infinity LC 系统联用
质谱数据分析软件AgilentMassHunter 定性分析软件 v. B.06.00
用于液相色谱-电喷雾电离-飞行时间质谱（LC-ESI-TOF-MS）的高效液相色谱柱Sigma-AldrichSupelco Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC色谱柱，3 µm 粒径，10 cm × 2.1 mm
1.5 mL HPLC自动进样瓶Sigma-AldrichSupelco 854165带锥形0.1 mL玻璃内衬管、螺帽和隔垫
名称公司目录编号评论
通用设备
用于1.5 mL Eppendorf管的台式离心机Eppendorf5427 R
用于 50 mL Falcon 管的冷却离心机Eppendorf5810 R
用于细菌细胞破碎的高压微流化器微流控技术LM系列，包括 “Z” 型培养室
用于液相色谱的蠕动泵GE HealthcareP-1
快速蛋白质液相色谱（FPLC）系统GE HealthcareÄKTA pure 25 L
用于细菌培养的轨道摇床Infors HTMinitron
紫外/可见分光光度计生物色谱ULTROSPEC 2100
用于细菌细胞破碎的超声波均质器OmnilabBandelin SONOPULS HD 3200, 5650182使用 MS72 型超声破碎仪探头
名称公司目录编号评论
荧光光谱仪设备
470 nm ps脉冲激光器Picoquant GmbHPDL-470
时间与波长相关单光子计数（TWSPC）采集软件Picoquant GmbHSymPhoTime 64
时间与波长关联的单光子计数（TWSPC）探测器Picoquant GmbHPML-16C16个光谱通道，通过光栅设置进行选择
单光子计数软件Picoquant GmbHSPCM 9.75
全局拟合软件Picoquant GmbHSPC2Glo(R)
荧光衰减数据分析软件Picoquant GmbHFluoFit 程序
数据分析软件OriginLab 公司Origin 9.2
中性密度滤光片组肖特NG1 到 NG11（400 - 650 nm，透射率 50 %，20 %，10 %，5 %）
488 nm 长通发射滤光片AHF AnalysentechnikAHF-488
石英比色皿Thorlabs GmbHCV10Q14001 cm 光程长度

参考文献

  1. Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Extraction, Purification and Properties of Aequorin, a Bioluminescent Protein from the Luminous Hydromedusan, Aequorea. J Cell Compar Physl. 59 (3), 223-239 (1962).
  2. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  3. Andresen, M., et al. Structure and mechanism of the reversible photoswitch of a fluorescent protein. P Natl Acad Sci USA. 102 (37), 13070-13074 (2005).
  4. Andresen, M., et al. Structural basis for reversible photoswitching in Dronpa. P Natl Acad Sci USA. 104 (32), 13005-13009 (2007).
  5. Brakemann, T., et al. A reversibly photoswitchable GFP-like protein with fluorescence excitation decoupled from switching. Nat Biotechnol. 29 (10), 942-947 (2011).
  6. Kremers, G. -J., Gilbert, S. G., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Piston, D. W. Fluorescent proteins at a glance. J Cell Sci. 124 (Pt 2), 157-160 (2011).
  7. Shimomura, O. Structure of the chromophore of aequorea 0. shimomura green fluorescent protein. FEBS Lett. 104 (2), 220-222 (1979).
  8. Shaner, N. C., Campbell, R. E., Steinbach, P. A., Giepmans, B. N. G., Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  9. Shcherbo, D., et al. Bright far-red fluorescent protein for whole-body imaging. Nat Methods. 4 (9), 741-746 (2007).
  10. Shcherbakova, D. M., Subach, O. M., Verkhusha, V. V. Red fluorescent proteins: advanced imaging applications and future design. Angew Chem Int Edit. 51 (43), 10724-10738 (2012).
  11. Stepanenko, O. V., Verkhusha, V. V., Kuznetsova, I. M., Uversky, V. N., Turoverov, K. K. Fluorescent proteins as biomarkers and biosensors: throwing color lights on molecular and cellular processes. Curr Protein Pept Sc. 9 (4), 338-369 (2008).
  12. Wang, L., Xie, J., Deniz, A. A., Schultz, P. G. Unnatural amino acid mutagenesis of green fluorescent protein. J Org Chem. 68 (1), 174-176 (2003).
  13. Budisa, N., Steipe, B., Demange, P., Eckerskorn, C., Kellermann, J., Huber, R. High-level biosynthetic substitution of methionine in proteins by its analogs 2-aminohexanoic acid, selenomethionine, telluromethionine and ethionine in Escherichia coli. Eur J Biochem. 230 (2), 788-796 (1995).
  14. Sharma, N., Furter, R., Kast, P., Tirrell, D. A. Efficient introduction of aryl bromide functionality into proteins in vivo. FEBS Lett. 467 (1), 37-40 (2000).
  15. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
  16. Twine, S. M., Murphy, L., Phillips, R. S., Callis, P., Cash, M. T., Szabo, A. G. The Photophysical Properties of 6-Azaindole. J Phys Chem B. 107 (2), 637-645 (2003).
  17. Lepthien, S., Hoesl, M. G., Merkel, L., Budisa, N. Azatryptophans endow proteins with intrinsic blue fluorescence. P Natl Acad Sci USA. 105 (42), 16095-16100 (2008).
  18. Budisa, N., et al. Probing the role of tryptophans in Aequorea victoria green fluorescent proteins with an expanded genetic code. Biol Chem. 385 (2), 191-202 (2004).
  19. Ross, J. B., et al. Spectral enhancement of proteins: biological incorporation and fluorescence characterization of 5-hydroxytryptophan in bacteriophage lambda cI repressor. P Natl Acad Sci USA. 89 (24), 12023-12027 (1992).
  20. Soumillion, P., Jespers, L., Vervoort, J., Fastrez, J. Biosynthetic incorporation of 7-azatryptophan into the phage lambda lysozyme: Estimation of tryptophan accessibility, effect on enzymatic activity and protein stability. Protein Eng Des Sel. 8 (5), 451-456 (1995).
  21. Heim, R., Tsien, R. Y. Engineering green fluorescent protein for improved brightness, longer wavelengths and fluorescence resonance energy transfer. Curr Biol. 6 (2), 178-182 (1996).
  22. Bridges, B. A., Mottershead, R. P., Rothwell, M. A., Green, M. H. L. Repair-deficient bacterial strains suitable for mutagenicity screening: tests with the fungicide captain. Chem Biol Interact. 5 (2), 77-84 (1972).
  23. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. J Vis Exp. , (2017).
  24. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. J Vis Exp. , (2017).
  25. Grigorenko, B. L., Krylov, A. I., Nemukhin, A. V. Molecular modeling clarifies the mechanism of chromophore maturation in the green fluorescent protein. J Am Chem Soc. , (2017).
  26. JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Introduction to the Spectrophotometer. J Vis Exp. , (2017).
  27. Goedhart, J., et al. Structure-guided evolution of cyan fluorescent proteins towards a quantum yield of 93%. Nat Commun. 3, 751(2012).
  28. Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. J Bacteriol. 119 (3), 736-747 (1974).
  29. Hörnsten, E. G. On culturing Escherichia coli on a mineral salts medium during anaerobic conditions. Bioprocess Eng. 12 (3), 157-162 (1995).
  30. Davis, B. D. The Isolation of Biochemically Deficient Mutants of Bacteria by Means of Penicillin. P Natl Acad Sci USA. 35 (1), 1-10 (1949).
  31. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY, USA. (2001).
  32. Wang, Y. -S., et al. The de novo engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase for genetic incorporation of L-phenylalanine and its derivatives. Mol Biosyst. 7 (3), 714-717 (2011).
  33. Bae, J. H., et al. Expansion of the genetic code enables design of a novel "gold" class of green fluorescent proteins. J Mol Biol. 328 (5), 1071-1081 (2003).
  34. JoVE Science Education Database. Dialysis: Diffusion Based Separation. J Vis Exp. , Cambridge, MA. (2017).
  35. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. J Vis Exp. , (2017).
  36. Petrásek, Z., et al. Excitation energy transfer from phycobiliprotein to chlorophyll d in intact cells of Acaryochloris marina studied by time- and wavelength-resolved fluorescence spectroscopy. Photoch Photobio Sci. 4 (12), 1016-1022 (2005).
  37. Kolber, Z. S., Barkley, M. D. Comparison of approaches to the instrumental response function in fluorescence decay measurements. Anal Biochem. 152 (1), 6-21 (1986).
  38. Pelet, S., Previte, M. J. R., Laiho, L. H., So, P. T. C. A fast global fitting algorithm for fluorescence lifetime imaging microscopy based on image segmentation. Biophys J. 87 (4), 2807-2817 (2004).
  39. Loefroth, J. E. Time-resolved emission spectra, decay-associated spectra, and species-associated spectra. J Phys Chem. 90 (6), 1160-1168 (1986).
  40. Hartman, M. C. T., Josephson, K., Lin, C. -W., Szostak, J. W. An expanded set of amino acid analogs for the ribosomal translation of unnatural peptides. PLoS One. 2 (10), e972(2007).
  41. Budisa, N., et al. Global replacement of tryptophan with aminotryptophans generates non-invasive protein-based optical pH sensors. Angew Chem Int Edit. 41 (21), 4066-4069 (2002).
  42. Ma, Y., Biava, H., Contestabile, R., Budisa, N., di Salvo, M. L. Coupling bioorthogonal chemistries with artificial metabolism: intracellular biosynthesis of azidohomoalanine and its incorporation into recombinant proteins. Molecules. 19 (1), 1004-1022 (2014).
  43. Teramoto, H., Kojima, K. Incorporation of Methionine Analogues Into Bombyx mori Silk Fibroin for Click Modifications. Macromol Biosci. 15 (5), 719-727 (2015).
  44. Deal, R. B., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Genome-wide kinetics of nucleosome turnover determined by metabolic labeling of histones. Science. 328 (5982), 1161-1164 (2010).
  45. Hinz, F. I., Dieterich, D. C., Tirrell, D. A., Schuman, E. M. Non-canonical amino acid labeling in vivo to visualize and affinity purify newly synthesized proteins in larval zebrafish. ACS Chem Neurosci. 3 (1), 40-49 (2012).
  46. Dieterich, D. C., et al. In situ visualization and dynamics of newly synthesized proteins in rat hippocampal neurons. Nat Neurosci. 13 (7), 897-905 (2010).
  47. Dieterich, D. C., Link, A. J., Graumann, J., Tirrell, D. A., Schuman, E. M. Selective identification of newly synthesized proteins in mammalian cells using bioorthogonal noncanonical amino acid tagging (BONCAT). P Natl Acad Sci USA. 103 (25), 9482-9487 (2006).
  48. Glenn, W. S., et al. Bioorthogonal Noncanonical Amino Acid Tagging (BONCAT) Enables Time-Resolved Analysis of Protein Synthesis in Native Plant Tissue. Plant Physiol. 173 (3), 1543-1553 (2017).
  49. Zhou, L., et al. Incorporation of tryptophan analogues into the lantibiotic nisin. Amino Acids. 48 (5), 1309-1318 (2016).
  50. Acevedo-Rocha, C. G., Budisa, N. Xenomicrobiology: a roadmap for genetic code engineering. Microb Biotechnol. 9 (5), 666-676 (2016).
  51. Agostini, F., Völler, J. -S., Koksch, B., Acevedo-Rocha, C. G., Kubyshkin, V., Budisa, N. Biocatalysis with Unnatural Amino Acids: Enzymology Meets Xenobiology. Angew Chem Int Edit. 56 (33), 9680-9703 (2017).
  52. Bacher, J. M., Ellington, A. D. Selection and characterization of Escherichia coli variants capable of growth on an otherwise toxic tryptophan analogue. J Bacteriol. 183 (18), 5414-5425 (2001).
  53. Wong, J. T. Membership mutation of the genetic code: loss of fitness by tryptophan. Pc Natl Acad Sci USA. 80 (20), 6303-6306 (1983).
  54. Hoesl, M. G., et al. Chemical Evolution of a Bacterial Proteome. Angew Chem Int Edit. 54 (34), 10030-10034 (2015).
  55. Italia, J. S., et al. An orthogonalized platform for genetic code expansion in both bacteria and eukaryotes. Nat Chem Biol. 13 (4), 446-450 (2017).
  56. Völler, J. -S., Thi To, T. M., Biava, H., Koksch, B., Budisa, N. Global substitution of hemeproteins with noncanonical amino acids in Escherichia coli with intact cofactor maturation machinery. Enzyme Microb Tech. 106, 55-59 (2017).
  57. Budisa, N., Steipe, B., Demange, P., Eckerskorn, C., Kellermann, J., Huber, R. High-level biosynthetic substitution of methionine in proteins by its analogs 2-aminohexanoic acid, selenomethionine, telluromethionine and ethionine in Escherichia coli. Eur J Biochem. 230 (2), 788-796 (1995).
  58. Völler, J. -S., Budisa, N. Coupling genetic code expansion and metabolic engineering for synthetic cells. Curr Opin Biotech. 48, 1-7 (2017).
  59. Johnson, J. A., Lu, Y. Y., Van Deventer, J. A., Tirrell, D. A. Residue-specific incorporation of non-canonical amino acids into proteins: recent developments and applications. Curr Opin Chem Biol. 14 (6), 774-780 (2010).
  60. Somsen, O. J., van Grondelle, R., van Amerongen, H. Spectral broadening of interacting pigments: polarized absorption by photosynthetic proteins. Biophys J. 71 (4), 1934-1951 (1996).
  61. Kurschus, F. C., Pal, P. P., Bäumler, P., Jenne, D. E., Wiltschi, B., Budisa, N. Gold fluorescent annexin A5 as a novel apoptosis detection tool. Cytom Part A. 75 (7), 626-633 (2009).
  62. Lepthien, S., Wiltschi, B., Bolic, B., Budisa, N. In vivo engineering of proteins with nitrogen-containing tryptophan analogs. Appl Microbiol Biot. 73 (4), 740-754 (2006).
  63. Wachter, R. M., Elsliger, M. -A., Kallio, K., Hanson, G. T., Remington, S. J. Structural basis of spectral shifts in the yellow-emission variants of green fluorescent protein. Structure. 6 (10), 1267-1277 (1998).
  64. Verkhusha, V. V., Lukyanov, K. A. The molecular properties and applications of Anthozoa fluorescent proteins and chromoproteins. Nat Biotechnol. 22 (3), 289-296 (2004).
  65. Martynov, V. I., Savitsky, A. P., Martynova, N. Y., Savitsky, P. A., Lukyanov, K. A., Lukyanov, S. A. Alternative cyclization in GFP-like proteins family. The formation and structure of the chromophore of a purple chromoprotein from Anemonia sulcata. J Biol Chem. 276 (24), 21012-21016 (2001).
  66. Piatkevich, K. D., Malashkevich, V. N., Morozova, K. S., Nemkovich, N. A., Almo, S. C., Verkhusha, V. V. Extended Stokes shift in fluorescent proteins: chromophore-protein interactions in a near-infrared TagRFP675 variant. Sci Rep. 3 (1), 1847(2013).

重印与许可

标签

通过非天然氨基酸的选择性压力整合及质谱与荧光蛋白分析技术构建“金色”荧光蛋白
联系我们
向图书馆推荐

隐私

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。