用于基因治疗应用的杆状病毒生产与纯化

摘要

本方案中，通过将杆状病毒质粒瞬时转染至Sf9细胞并在无血清悬浮培养体系中扩增来产生杆状病毒。上清液经肝素亲和层析纯化后，再通过超速离心进一步浓缩。该方案适用于基因治疗应用中杆状病毒的制备与纯化。

摘要

杆状病毒传统上被用于重组蛋白和疫苗的生产。然而，近年来，杆状病毒正逐渐成为一种有前景的基因治疗载体。本文中，通过在Sf9贴壁细胞培养物中瞬时转染杆状病毒质粒DNA（bacmid）来产生杆状病毒。随后，在无血清悬浮培养的Sf9细胞中扩增杆状病毒，直至获得所需体积。然后利用肝素亲和层析从培养上清液中纯化病毒。将病毒上清液上样至肝素柱，由于肝素与杆状病毒包膜糖蛋白之间的亲和性，病毒颗粒被吸附在柱上。用缓冲液洗涤柱子以去除杂质，再用高盐缓冲液将杆状病毒从柱上洗脱下来。洗脱液被稀释至等渗盐浓度，随后通过超速离心进一步浓缩杆状病毒颗粒。采用该方法可实现高达500倍的浓缩，且感染性病毒颗粒的回收率可达25%。尽管本方案展示的是从不超过1 L的培养物中生产和纯化杆状病毒的过程，但该方法可在封闭式悬浮培养系统中放大，用于生产适用于基因治疗的临床级载体。

引言

杆状病毒主要用于在鳞翅目昆虫草地贪夜蛾（Spodoptera fugiperda）Sf9 细胞中，利用重组苜蓿银纹夜蛾多角体病毒（Autographa californica multicapsid nuclear polyhedrosis virus, AcMNPV）生产重组蛋白和疫苗^1,2,3,4。近年来，它正逐渐成为一种有前景的基因治疗载体⁵。已知杆状病毒具有广泛的宿主和组织嗜性，可感染静止期和增殖期细胞，无致病性，且不会整合到宿主染色体中^4,5,6。此外，杆状病毒可在无血清悬浮培养系统中生产，具有可放大性，并支持封闭式生产工艺，适用于未来的临床级生产¹。

杆状病毒颗粒的纯度对于实现高效转导并最大限度降低细胞毒性至关重要^7,

方案

参见图1，其中示意图总结了本实验方案。

1. 杆状病毒质粒DNA的纯化

1. 在200 mL含有抗生素（卡那霉素50 µg/mL、四环素10 µg/mL和庆大霉素7 µg/mL）的LB液体培养基中，于37 °C、300 rpm振荡培养含有杆状病毒质粒DNA（bacmid）¹⁴的细菌，培养16小时。
2. 采用标准的碱裂解法¹⁵从细菌培养物中纯化bacmid DNA，并将其溶解于TE缓冲液中。

2. 杆状病毒的生产

1. 在28℃、135 rpm条件下，于轨道摇床培养箱中培养Sf9细胞 °C，置于含无血清昆虫细胞培养基的聚碳酸酯锥形瓶中^1,2,3.
   注意： 若Sf9细胞从冻存株中复苏，需至少给予两周时间使细胞恢复并进入对数生长期。
2. 用台盼蓝染色后，使用血细胞计数板对处于对数生长期收获的 Sf9 细胞进行计数。接种 1 × 10⁶ 细胞/mL。

结果

本方案以流程图形式展示（图1）。步骤包括：将杆状病毒DNA瞬时转染Sf9细胞，于培养板中贴壁培养以产生杆状病毒；随后在无血清悬浮培养体系中进行扩增；经核酸酶处理后，通过离心和过滤进行澄清；最后采用肝素亲和层析纯化，并通过超速离心进行浓缩。

解冻后，Sf9 细胞需要至少两周时间恢复并进入指数生长期。在贴壁培养条件下，使用杆状病毒 DNA 转染处于活跃生长状态的 Sf9 细胞。转染两天后，可检测到杆状病毒包膜糖蛋白 gp64 的表达，随后启动杆状病毒的产生¹¹。由于杆状病毒具有复制能力，新产生的病毒会分泌到培养基中并持续感染其他细胞，导致被感染细胞数量逐渐增加。转染后第 5 天，当全部细胞群体均已被感染时，收集含病毒的细胞上清液。该初始病毒上清液被定义为第 1 代（P₁）病毒原液。P₁ 原液用于接种更大培养.......

讨论

本文所述方案介绍了在悬浮培养的Sf9细胞中生产杆状病毒，并利用肝素亲和层析纯化杆状病毒的方法。本方案所采用的参数可最大化提高病毒产量，同时最小化感染性杆状病毒的失活。与已有方法相比，该方案显著提高了杆状病毒颗粒的回收率⁹。

由于杆状病毒具有广泛的宿主范围和组织嗜性，已有多个研究将其用于中枢神经系统、肝脏、眼睛、卵巢、前列腺和睾丸的基因递送^5,6,7,8。含有治疗性基因（如自杀基因、肿瘤抑制基因以及编码肿瘤特异性抗原的基因）的杆状病毒载体已在临床前动物模型中成功应用^18,19。尽管杆状病毒能够转导人类细胞，但其仅能在昆虫细胞中增殖，因此不会对人类受体造成风险。

.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Akta Avant 150	GE Healthcare	28976337	层析系统
POROS Heparin 50 µm 色谱柱	ThermoFisher Scientific	4333414	肝素色谱柱
超速离心机	Beckman-Coulter	非目录产品	高速浓缩病毒
聚碳酸酯超速离心管	Beckman-Coulter	326823	高速浓缩病毒
MaxQ 8000 摇床培养箱	ThermoFisher Scientific	非目录产品	用于悬浮培养的摇床
250 mL 锥形瓶	ThermoFisher Scientific	238071	用于悬浮培养的烧瓶
1 L 锥形瓶	ThermoFisher Scientific	238072	用于悬浮培养的烧瓶
显微镜（Olympus CKX41）	Olympus	非目录产品	细胞观察与计数
台式离心机	ThermoFisher Scientific	75253839/433607	用于澄清杆状病毒上清液
50 ml 锥底离心管	ThermoFisher Scientific	14-959-49A	用于收集杆状病毒上清液
6 孔板	ThermoFisher Scientific	07-200-80	组织培养处理板
10 cm 培养皿	ThermoFisher Scientific	08-772E	组织培养处理板
Stericup-HV，0.45 µm，PVDF	EMD-Millipore	SCHVU05RE	过滤装置
卡那霉素	ThermoFisher Scientific	15160-054
四环素	Sigma-Aldrich	T7660
庆大霉素	ThermoFisher Scientific	15750-060
Bac-to-Bac 载体试剂盒	ThermoFisher Scientific	10360-014	杆状病毒表达系统
DH10B-T1R  感受态细胞	ThermoFisher Scientific	12331-013	用于bacmid转化的感受态细胞
TE 缓冲液	自配	非目录产品	10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH 8.0
质粒大提试剂盒	ThermoFisher Scientific	K2100-06	用于bacmid纯化
Sf9 细胞	ThermoFisher Scientific	11496-015	昆虫细胞
Grace’s 昆虫细胞培养基	ThermoFisher Scientific	11605-094	转染培养基
PBS	ThermoFisher Scientific	20012227	洗涤细胞、稀释样品
HyClone SFX-昆虫细胞培养基	GE Healthcare	SH30278.02	无血清昆虫细胞生长培养基
苯并核酸酶（Benzonase Nuclease）	Sigma-Aldrich	E1014	降解DNA和RNA的酶
杆状病毒质粒（bacmid）DNA	自配	非目录产品	用于杆状病毒生产的bacmid
Cellfectin II	ThermoFisher Scientific	10362	昆虫细胞转染试剂
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	A4737	稳定杆状病毒
冻存管	Thomas Scientific	1222C24	用于杆状病毒储存
HT1080 细胞系	ATCC	CCL-121	成纤维细胞系
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429	细胞系生长培养基
洗涤缓冲液	自配	非目录产品	含150 mmol/L氯化钠的20 mmol/L磷酸盐缓冲液
洗脱缓冲液	自配	非目录产品	含1.5 mol/L氯化钠的20 mmol/L磷酸盐缓冲液
色谱柱清洗缓冲液	自配	非目录产品	含2.0 mol/L氯化钠的20 mmol/L磷酸盐缓冲液
无菌水	自配	非目录产品	用于Akta Avant系统的清洗
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	1.09137	用于Akta Avant系统的清洗
乙醇	Sigma-Aldrich	E7073	用于Akta Avant系统的清洗