Immunolabeled, 澄清人胎盘长柔毛血管网络的三维渲染与分析

Summary

本研究提出了一种可逆转组织清除、染色、3 d 渲染和分析人胎盘绒毛样品中血管网络的方法, 其顺序为 1-2 毫米³。

Abstract

母亲和胎儿之间的养分和气体交换发生在母体 intervillous 血的界面和巨大的长柔毛毛细血管网络中, 构成了人类胎盘的大部分实质。远端长柔毛毛细管网络是胎儿血液供应的终点后, 几代分支的血管延伸出脐带。这个网络有一个连续的细胞鞘, 合胞滋养屏障层, 防止胎儿血液和产妇血液的混合, 在其中持续沐浴。对胎盘毛细血管网络的完整性的侮辱, 发生在诸如孕产妇糖尿病、高血压和肥胖等疾病中, 会给胎儿、婴儿和成人带来严重的健康风险。为了更好地定义这些侮辱的结构效果, 为这项研究制定了一项协议, 它捕获毛细管网络结构的顺序为 1-2 毫米³ , 其中一个可以调查其拓扑特征的完全复杂性。为达到这一目的, 对胎盘端绒毛簇进行了解剖, 滋养层和毛细血管内皮 immunolabeled。然后用新的组织清理过程澄清这些样本, 从而可以获得共焦图像栈到 z 深度的 ~ 1 毫米。然后对这些堆栈的三维渲染进行处理和分析, 以生成基本的毛细管网络度量, 如体积、毛细管分支数和毛细管分支端点, 以验证这种方法是否适合毛细管网络特性。

Introduction

我们对发育中胎盘及其病理的理解, 在很大程度上局限于推断相邻绒毛之间的空间关系以及从组织学切片中提取的毛细血管。在这项研究中, 我们通过开发方法来生成三维 (3D) 的人胎盘毛细管网络的效果图, 这些结果适合于分析毛细管网络特征 (例如分支、固态)。为此, 我们将免疫荧光染色与两种商业组织清洁产品、Visikol-1 和 Visikol-2 (以下简称 Solution-1 和 Solution-2) 相结合。

人胎盘是一个巨大的复杂的血管位于母亲的 intervillous 血液和发育中的胎儿之间的接口。脐带从插入到绒毛膜板中延伸出来, 在动脉和静脉网络中 ramify, 用精心制作的血管网络覆盖绒毛膜表面。他们的末端然后击穿入胎盘盘的内部或深度, 在那里他们接受几个分支世代并且结束在末端绒毛和他们包含的毛细管网络, 气体交换的地点, 营养素和新陈代谢胎儿和母体血液之间的浪费。

对胎盘毛细管网络的侮辱在发展期间有持久的后果为胎儿、新生儿和紧急成人^1,2,3的健康。鉴于妊娠相关的病症, 如流产, 宫内生长限制, 先兆子痫和孕妇糖尿病^4,5,6有一个很高的价值, 制定测量方法和胎盘绒毛毛细管网络的表征。一个主要的障碍是胎盘血管网络包含广泛的范围。表面血管网络的直径可达4-5 毫米。末端具长柔毛毛细血管的顺序为 10-20 µm 直径;胎盘含有超过300公里的血管⁷。目前, 很少有易于使用和快速的技术, 可以捕捉这些极端的船只规模。到目前为止, 只有少量的绒毛可以通过显微镜来呈现。例如, Jirkovska et将重点放在足月胎盘绒毛上, 将共焦显微术与连续光学切片结合, 从120µm 厚剖面获得1µm 间隔;未提供所研究的样本数和统计数据, ⁸。对毛细管结构进行了鉴定, 并对绒毛和毛细血管的轮廓进行了手工绘制, 并将追查导出用于图像分析。虽然作者们讨论了他们的发现对 "生长的长柔毛血管网" 的影响, 但这样的结论是有问题的, 只有 "期限" (36 + 周孕龄) 组织的研究。类似地, 梅奥et al 和皮尔斯et等. 依赖于同一年龄的组织, 用于模拟血液流动和氧转运, 但其分析仅限于几个术语, 终端绒毛^9,10.视学也被应用于研究绒毛状血管的结构。但同样的, 重点通常是以后怀孕分娩 liveborn 婴儿有一个或多个妊娠并发症^11,12。

直到最近, 共焦显微术被限制为100-200 µm 的组织深度的成像, 因为吸收的激发和发射荧光的覆盖组织¹³ 。虽然组织清除和3D 组织学已被广泛描述的文献和有许多方法, 组织清除许多不适合使用与组织一般, 因为他们不可逆转地破坏细胞形态学通过 hyperhydration蛋白质或脂肪的去除。因此, 无法验证这些结果是否表明了组织本身, 而不是加工工件, 而我们的组织清除过程是一种可逆的技术, 能够验证传统的组织学。组织清除一般涉及三种主要方法之一: 1) 在 RI 匹配解中, 对组织成分的折射率 (ri) 进行均匀匹配, 消除由于连续而引起的透镜的累积光散射。低 ri (细胞质) 和高 ri (蛋白质/脂) 成分的波动;2) 将脂质成分嵌入水凝胶中, 利用电泳/扩散法去除脂质成分;3) 蛋白质结构的扩张/变性, 以增加溶剂的穿透力, 以鼓励 RI ¹³的均匀性。虽然这些方法可以使组织透明, 并允许生成生物标志物的3D 表示, 但这些3D 表示有疑问的临床价值, 因为它是挑战, 以确定这些图像是否预示着组织的性质或组织清除过程。另一方面, 由于我们的组织清除是可逆的标准组织学和/或免疫组化可以应用到同一组织, 以评估是否有临床意义的改变。

本研究对47例从23例正常和选择性终止妊娠到9-23 个完成周妊娠期和两次足月正常分娩的远端长柔毛标本进行了分析。免疫荧光标记滋养层和内皮已经使对长柔毛血管网络的变化及其复杂性进行了定量和自动化的分析。

通过该协议, 我们对终端绒毛及其毛细管网络进行了前所未有的分离和分析。这种方法, 当应用到长柔毛和毛细管网络发展横跨妊娠将确定这些属性是出生的健康儿童的基础。当应用于复杂妊娠的研究时, 它还将阐明胎盘病变何时以及如何改变其鞘的绒毛状树木和毛细血管网络, 以及这些如何影响胎儿的福祉。

Protocol

本议定书遵循了纽约国家发展残疾基础研究研究所人类研究伦理学委员会的指导方针。

1. 长柔毛树解剖

1. 用磷酸盐抛光生理盐水 (PBS)¹⁴冲洗福尔马林固定胎盘组织, 在解剖显微镜的舞台上取出福尔马林并放置在培养皿中。使用手术刀和细钳, 以逗胎盘组织分开寻找长柔毛树 (白色丝状分支结构)。解剖出绒毛树 (几毫米长) 的碎片, 将组织转移到含有1毫升 PBS 的微管上。

2. 免疫荧光染色

1. 用吸管, 取出 pbs, 换成新鲜的 pbs。让我们站10分钟, 偶尔旋转。再重复一次。
   注意: 这一步和所有进一步的步骤都是在室温下进行的, 除了主要的抗体孵化。
2. 使用吸管, 去除和取代 pbs +0.1% Triton-X100 + 2% 山羊血清 (pbs t GS) permeabilize 组织和阻断非特异性的二级抗体结合。孵育30分钟。
3. 用2% 山羊血清、小鼠单克隆 anti-CK7 和兔 anti-CK7 的 pbs 取代 pbs T GS。
   1. 孵化组织过夜在4摄氏度。
   2. 清除其余的抗体, 用 PBS-GS 清洗10分钟, 偶尔旋转。
   3. 移除 pbs gs 并替换为包含山羊抗小鼠 igg 的 pbs gs, 再加上一个绿色发射 (520 nm) 荧光和山羊抗兔 igg 结合红外发射 (652 nm) 荧光。
   4. 重复步骤2.1 删除抗体。
   5. 将 immunolabeled 组织在室温下存放在黑暗中。

3. 组织的澄清

1. 用 PBS 在10分钟间隔内冲洗样品3次。
2. 通过用吸管去除 PBS 并用50% 乙醇取代它 (甲醇也可用) 来脱水组织。孵育10分钟, 用新鲜的50% 乙醇代替, 孵育10分钟. 再重复一次, 总共有3孵化。重复孵化与70%。然后用100% 乙醇代替, 孵育15分钟 (或者甲醇可以使用)。
3. 用一个细尖钳, 转移组织到一个新鲜的微管含有〜1毫升 Solution-1 4 小时。
4. 用细尖钳, 将组织转移到含有 Solution-2 的新鲜微管中4小时。
   注意: 当储存在黑暗中时, 免疫荧光在室温下稳定至少6月。
5. 不要与任何水溶液混合, (例如安装介质), 因为清除将丢失。

4. 显微镜安装

1. 不要在标准的玻璃滑梯和盖玻片之间安装组织, 因为组织是软的, 容易变形。
2. 请参阅图 5B并在赛克斯摩尔会议厅中安装该组织, 如下所示;
   1. 用细尖钳放置一个25毫米圆盖玻片在房间基地。
   2. 用细尖钳把橡胶垫片放在底座上的盖玻片上。
   3. 用吸管放置一滴 (~ 40 µL) 的 Solution-2 在盖玻片的中心。
   4. 用细尖钳将一块组织从 Solution-2 转移到盖玻片中心的下落。
   5. 在垫片顶部放置第二盖玻片。
   6. 将锁定环放入底座顶部, 压缩盖玻片和垫片直至牢固。
      注意: 小心不要过度收紧或盖玻片会粉碎。
   7. 将22口径的针插入底座和垫片的端口。
   8. 用1.5 毫升的 Solution-2 填充3毫升的注射器。
   9. 在注射器上安装一个25口径的针头。
   10. 将注射器针插入到相反的端口并通过垫片。
   11. 确保室内空气通过其他25口径针, 轻轻注入 solution-2and 填充腔内。
   12. 取出针头和注射器, 将房间放在共焦显微镜舞台上的大玻璃滑梯上。
3. 或者, 从硅烷板上切割自定义井。
   1. 用剪刀切割 25.4 x 25.4 毫米²件从该板。
   2. 用手术刀切开 ~ 12.7 x 12.7 毫米²在片断。
   3. 把一块牢牢地压在显微镜滑梯上。
   4. 用 Solution-2 填满井顶。
   5. 将组织片从微管转移到井中心。
   6. 用细尖的镊子把盖玻片放在井顶, 这样盖玻片的底部就会被 Solution-2 浸湿。
   7. 在共焦显微镜阶段安装与组织的克斯克摩尔室组件。

5. 共焦显微术

1. 将细胞中的组织集中在10x 的目标上。
2. 在焦距平面上上下移动显微镜, 测量组织的顶部和底部之间的距离。
3. 移动舞台在2.5 µm 步骤收集一个共焦图像文件, 其中包含一组图像通过组织从上到下。

6. 逆转清算

1. 通过将组织转移到含有 > 20x 的微管中以100% 乙醇的体积来逆转清除。在1小时间隔替换与70% 乙醇, 然后50% 乙醇和最后 PBS。存放在4摄氏度在黑暗中。
   注: 现在处理组织的标准石蜡嵌入, 切片和组织学或免疫组织化学染色。

7. 反褶积

注意: 对于以下步骤, 软件命令、选项卡和下拉菜单是斜体的。

1. 启动反褶积软件并打开图像文件。
2. 输入 "夏天y" 窗口中列出的参数。
   1. 对于 "间距" , 在µm 中输入体素 x、y 和 z 维度。
   2. 对于每个颜色通道, 从下拉菜单中选择用于染色的荧光染料。
   3. 对于 "情态", 请从下拉菜单中选择 "激光扫描共焦"。
   4. 对于 "物镜", 请从下拉菜单中选择 "10x"。
   5. 对于 "浸入介质", 从下拉菜单中选择 "空气"。
   6. 单击 "应用"按钮。
3. 单击 "Deconvolution" 选项卡。
4. 在下拉菜单中单击 "3D 反褶积" 。
5. 在 "3D-卷积"窗口中, 确保设置为: 1) 自适应的 psf 盲、2) 理论的 psf、3) 使用 (默认自适应的 psf、10迭代、中等噪声)、4) 基名称。
6. 单击 "绿色复选按钮"启动程序。
7. 完成后, 重复步骤 7.3-7.6 以重新启动程序。当完成第三次和最后一次重新启动它。
8. 在 "数据管理器"窗口中, 单击以 "10-10-10-" 为前缀的文件。
9. 单击 "文件"选项卡, 然后单击 "另存为"。
10. 在 "保存s" 窗口中, 从 "数据类型"下拉菜单中选择 "8bit 无符号整数" , 然后单击 "保存"。

8. 图像处理

1. 启动斐济软件。
   1. 单击 "文件", 单击 "打开"并选择 Deconvolved 图像文件, 然后单击 "打开" 窗口中的 "打开"按钮。
   2. 单击 "图像/颜色/分割通道" , 然后将三色图像文件转换为仅包含一种颜色的三个新文件。保存包含 immunolabeled 长柔毛毛细管图像集的红色图像文件。删除绿色和蓝色图像文件。
   3. 用以下方法减去红色图像文件中的背景荧光: "处理/减去背景"。
   4. 在下拉菜单中, 将滚动球半径设置为10像素。
   5. 保留未选中的4菜单选项, 然后单击 "确定"。
   6. 单击 "进程堆栈" 菜单上的 "是" 。
   7. 通过打开 "图像/调整/亮度对比度"菜单并调整最小、最大、亮度和对比度设置, 删除固有的组织荧光 (自发荧光)。注意不要去除任何毛细血管免疫荧光。
   8. 通过打开 "图像/调整/阈值"菜单并调整滑块以突出显示毛细管免疫荧光, 以最小化剩余的无关荧光。检查 "深色背景"框, 然后单击 "应用"。在 "转换为二进制下拉"菜单上, 选中 "黑色背景"框, 然后单击 "确定"。保存黑白 (二进制) 图像文件以进行分析。

9. 分析

1. 对象计数和骨架。
   1. 选择在步骤8.1.8 中创建的二进制图像文件。
   2. 单击 "分析/3D OC 选项" , 然后在下拉菜单中只检查 "卷"和 "存储结果..."框。确保未选中"显示数字"框。单击 "确定" 按钮.
   3. "Analyze/3D 对象计数器"上的 Click。在下拉菜单中, 将 "大小筛选: 最小值"设置为5000。确保未选中 "在边缘上排除对象"框。检查是否选中了 "对象的、统计信息和"摘要 "框。单击 "确定" 按钮。
      注意: 这可能需要几分钟时间, 具体取决于文件大小和计算机配置。
   4. 保存统计数据表和对象映射文件。
   5. 选择对象映射文件。单击 "插件/骨架/缩略2维-3 d"以缩略二进制文件中的毛细管网络。单击 "文件/另存为"。在下拉菜单中选择 "Tiff......" 。在 "另存为 TIFF" 窗口中, 将 "Skel" 添加到对象映射文件名中, 然后单击 "保存"按钮.
   6. 单击 "分析/骨架/分析骨架 2 d-3 d"。在下拉菜单中接受默认设置, 然后单击 "确定" 按钮。保存分支"信息"表、"结果"表和两个输出文件 (Skel 对象标记为骨架和带标记的骨架)。

Results

从8周孕龄到足月分娩, 将人胎盘端绒毛簇中毛细血管的生成3D 效果计算为个体簇和骷髅进行网络分析。胎盘的功能单位 (图 1A) 是绒毛树, 是它们穿透胎盘实质的表面血管的延伸 (图 1B, 并在1C中放大)。然后 immunolabeled 解剖树的远端部分 (Figure1D和1E) 的碎片, 以显示绒毛滋养层及其毛细血管 (图 2)。对3D 渲染至关重要的是使用这种清除组织系统的能力。

使用这项研究的共焦系统, 未清除组织的免疫荧光只能获得在100µm 或更少的深度 (

Discussion

机构审查委员会批准了收集胎盘绒毛组织选择性终止妊娠的福尔马林固定。在执行这些程序之前, 对医疗记录作了简要的回顾, 指出了孕产妇年龄、均等, 并确认没有任何潜在的医疗 (如例如、高血压、糖尿病和狼疮) 或胎儿 (结构或染色体异常,异常生长) 进行。数据表和任何收集的标本只用研究 ID 标记。因此, 所有标本都在离开操作套件之前被取消标识。绒毛由训练有素的观察者收集;去除了蜕膜和绒毛板, 并收集了游离漂浮的长柔毛丛。

当用溶剂为基础的技术清除组织时, 有几个重要的考虑因素。首先, 组织必须充分脱水才能清除, 因此组织必须通过乙醇 (或甲醇) 的梯度洗涤到100%。使用乙醇时, 使用 "干试剂级乙醇, 不含水" 是至关重要的。在每个步骤中使用足够量的脱水液也是很重要的;成功脱水需要大约10-20x 的组织体积。不完全脱水的组织将导致多云出现后, 清除。另一个重要的考虑因素是用于染色的抗体浓度。由于扩散通道阻塞, 过量的抗体会导致非特异的结合和不完全穿透组织。不到足够浓度的抗体将导致不完全染色, 因为抗体是用尽之前, 达到组织的中心。抗体浓度应优化的小片组织之前, 扩大...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
磷酸盐水缓冲液中的 10% 甲醛溶液 （w/v）	Macron Fine Chemicals	H-121-08	通用固定剂，即用型配方，谨慎使用，因为蒸气有毒
手术刀刀片	ThermoFisher Scientific	08-916-5B 11
手术刀	ThermoFisher Scientific	08-913-5
细镊子	电子显微镜服务	78354-119
微量管 （1.7 mL）	PGC Scientifics	505-201
磷酸盐缓冲盐水	Sigma	D8537	PBS
移液器	VWR	52947-948	一次性 3 mL 移液管
Triton X-100	Boehriner Mannheim	789 704	从原液中稀释至 0.1%
山羊血清	Gibco	16210-064	至PBS 溶液中 2%
单克隆抗 ck7 角蛋白 7 Ab-2（克隆 OV-TL 12/30）	ThermoFisher Scientific	MS-1352-RQ
兔抗 CD31 抗体	Abcam	ab28364
绿色发射 （520 nm） 荧光染料	Invitrogen	A11017	Alexa-Fluor 488
红外发射 （652 nm） 荧光染料	Invitrogen	A21072	Alexa Fluor 633
乙醇 酒精 200 度	Pharmco-Aaper	111000200	根据需要使用 PBS 稀释至较低浓度
溶液-1	Visikol Inc.		Visikol Histo-1
Solution-2	Visikol Inc.		Visikol Histo-2
Skyes-Moore 腔室	BellCo Glass Inc.	P/N 1943-11111
25 号针头	ThermoFisher Scientific	14-826AA	BD Precision Glide Needes
3 mL 注射器	ThermoFisher Scientific	14-823-40	BD 一次性注射器
PDMS 硅胶片	McMaster-Carr	P/N 578T31
共聚焦显微镜	Nikon Inc.		尼康 C1 共聚焦显微镜
反卷积软件	Media Cybernetics		AutoQuant X22
斐济图像处理软件			免费、开源  软件可在 https://fiji.sc
Hematoxylin	Leica Biosystems	3801570	SelecTech H& 的组件 1 获得E 染色系统
酒精曙红	Leica Biosystems	3801615	SelecTech H& 的成分 2E 染色系统
Blue Buffer	Leica Biosystems	3802918	SelecTech H& 的 3 组分E 染色系统
Aqua Define MCX	Leica Biosystems	3803598	SelecTech H& 的组件 4E 染色系统
免疫组化检测系统	ThermoFisher Scientific	TL-125-QHD	UltraVision 双币种检测系统 HRP DAB