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方法文章

三维重建与分析免疫标记并透明化处理的人类胎盘小叶血管网络

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DOI：

10.3791/57099

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2018年3月29日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Institute for Basic Research, The New York State Office for People with Developmental Disabilities, 2Placental Analytics LLC, 3Visikol Inc.

本文内容

摘要

本研究介绍了一种可逆组织透明化、免疫染色、三维成像及分析人胎盘绒毛样本中血管网络的实验方案，样本体积约为 1 - 2 mm3。

摘要

母体与胎儿之间的营养物质和气体交换发生在母体绒毛间隙血与构成人类胎盘实质大部分的庞大绒毛毛细血管网络之间的界面上。远端绒毛毛细血管网络是胎儿血液供应的终末部分，其血管自脐带延伸后经过多级分支形成。该网络具有一层连续的细胞外鞘，即合体滋养层屏障层，可防止胎儿血液与持续浸润其周围的母体血液发生混合。在母体糖尿病、高血压和肥胖等疾病中，胎盘毛细血管网络完整性受到损害，会对胎儿、婴儿乃至成人造成严重的健康风险。为了更明确地界定这些损害的结构效应，本研究建立了一种能够捕获体积约为1 - 2 mm3毛细血管网络结构的实验方案，从而可在其完整复杂性的基础上研究其拓扑特征。为此，从胎盘中分离出终末绒毛簇，并对滋养层细胞层和毛细血管内皮细胞进行免疫标记。随后，采用一种新型组织透明化处理方法对这些样本进行澄清，使其能够获取深度达约1 mm的共聚焦图像堆栈。然后对这些图像堆栈的三维重建结果进行处理与分析，以获得诸如毛细血管网络体积、毛细血管分支数量及分支末端点等基本参数，作为验证该方法适用于毛细血管网络表征的依据。

引言

我们对胎盘发育及其病理学的理解在很大程度上局限于通过组织学切片推断出的相邻绒毛及其所含毛细血管之间的空间关系。在本研究中，我们通过建立生成人胎盘毛细血管网络三维（3D）重建图像的方法，解决了这一问题，所获图像适用于对毛细血管网络特征的分析例如 分枝、实心度）。为此，我们将免疫荧光染色与两种商用组织透明化产品 Visikol-1 和 Visikol-2（下文中简称 Solution-1 和 Solution-2）相结合。

人胎盘是一个复杂的血管网络，位于母体绒毛间隙血液与发育中的胎儿之间的交界处。脐带从其在绒毛膜板的附着点向外延伸，分支形成动脉和静脉网络，遍布绒毛膜表面，构成复杂的血管系统。这些血管末端进一步深入胎盘盘状结构的内部或深层，在此处经历多轮分支，最终形成终末绒毛及其所含的毛细血管网，此处即为胎儿与母体血液之间进行气体、营养物质及代谢废物交换的部位。

发育过程中对胎盘毛细血管网络的损伤会对胎儿、新生儿以及成长中的个体健康产生持久影响 1,2,3鉴于与妊娠相关的病理状况，如流产、宫内生长受限、子痫前期和妊娠期糖尿病 4,5,6 人们对开发胎盘绒毛毛细血管网络的测量与表征方法高度重视。主要障碍在于胎盘血管网络涵盖广泛的尺度范围：表面血管网络的直径可达4–5 mm，而终末绒毛毛细血管的直径仅为10–20 µm；胎盘内含有超过300 km的血管 7目前，能够捕捉这些极端血管尺度的简便快速技术还很少。迄今为止，只有少数绒毛能够通过显微镜成像。例如，Jirkovska 等 以足月胎盘绒毛为研究重点，结合共聚焦显微镜对120 µm厚的组织切片进行每1 µm间隔的连续光学切片扫描；未提供所研究样本数量及统计学分析数据 8毛细血管结构被识别，绒毛和毛细血管的轮廓由人工手绘，并导出描记结果用于图像分析。尽管作者讨论了其研究发现的意义 "不断生长的绒毛血管网络"，当仅基于以下情况时，此类结论存在问题 "术语" （妊娠36周及以上）组织被用于研究。同样，Mayo 等l. 和 Pearce 等 依赖同年龄段的组织进行血流和氧气传输的模拟，但其分析仅局限于少数足月终末绒毛 9,10体视学也已应用于绒毛血管结构的研究。但同样，相关研究通常集中于晚期妊娠，且对象多为分娩出活婴并伴有某种或多种妊娠并发症的孕妇 11,12.

直到最近，由于上层组织对荧光激发光和发射光的吸收，共聚焦显微镜的成像深度仅限于100–200 µm13。尽管组织透明化和三维组织学在文献中已有广泛描述，并且存在多种组织透明化方法，但其中许多方法通常不适用于各类组织，因为它们会通过蛋白质过度水合或脂质去除而不可逆地破坏细胞形态。因此，无法验证这些结果是否真实反映了组织本身的特性，还是处理过程中产生的假象；而我们的组织透明化技术是一种可逆的方法，能够与传统组织学进行对照验证。组织透明化通常包括以下三种主要策略之一：1）通过将组织浸入折射率（RI）匹配溶液中，使组织各组分的折射率均匀一致，从而消除由于低折射率组分（如胞质溶胶）与高折射率组分（如蛋白质/脂质）连续波动所引起的透镜效应及累积光散射；2）通过将组织包埋于水凝胶中，并利用电泳或扩散方式去除脂质成分；3）扩张或变性蛋白质结构，以促进溶剂更深入渗透，从而提高折射率的均一性13。尽管这些方法可使组织变得透明，并生成生物标志物的三维图像，但这些三维图像的临床价值尚存疑问，因为难以判断图像所反映的是组织本身的特性，还是组织透明化过程带来的影响。相比之下，由于我们的组织透明化过程是可逆的，因此可在同一组织样本上应用标准组织学和/或免疫组织化学染色，以评估所观察到的变化是否具有临床意义。

本研究对来自23例临床正常且选择性终止妊娠（孕周为9至23周）以及2例足月正常分娩的胎盘组织，共47个远端绒毛样本进行了分析。通过对滋养细胞和血管内皮进行免疫荧光标记，实现了对绒毛血管网络及其复杂性变化的定量和自动化分析。

通过本方案，我们分离并分析了以往无法实现规模的终末绒毛及其毛细血管网络。将该方法应用于妊娠全过程中的绒毛及毛细血管网络发育研究，将有助于确定那些构成健康子代出生基础的关键特性。在复杂妊娠的研究中应用该方法时，还可阐明胎盘病理改变何时以及如何影响绒毛树结构及其包绕的毛细血管网络，以及这些改变如何影响胎儿健康。

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方案

本方案遵循纽约州发育障碍基础研究所人类研究伦理委员会的指导原则。

1. 绒毛树解剖

  1. 用磷酸盐缓冲液（PBS）14冲洗经甲醛固定的胎盘组织，以去除甲醛，并将组织置于解剖显微镜载物台上的培养皿中。使用解剖刀和精细镊子将胎盘组织分离，寻找绒毛树（白色丝状分枝结构）。分离出数毫米长的绒毛树片段，并将组织转移至含有约 1 mL PBS 的微量离心管中。

2. 免疫荧光染色

  1. 用移液器吸去 PBS，更换为新鲜 PBS。室温下静置 10 分钟，期间偶尔轻轻涡旋混匀。重复此步骤一次。
    ​注意：此步骤及后续所有步骤均在室温下进行，仅一抗孵育步骤除外。
  2. 用移液器吸去 PBS，更换为含 0.1% Triton-X100 和 2% 山羊血清的 PBS（PBS-T-GS），以通透组织并阻断二抗的非特异性结合。孵育 30 分钟。
  3. 将 PBS-T-GS 换为含 2% 山羊血清的 PBS，并加入小鼠单克隆抗 CK7 抗体和兔抗 CK7 抗体。
    1. 4 °C 下孵育组织过夜。
    2. 用 PBS-GS 洗涤 10 分钟，期间偶尔轻轻涡旋，以去除残留抗体。
    3. 吸去 PBS-GS，更换为含 2% 山羊血清的 PBS，并加入偶联绿色荧光染料（发射波长 520 nm）的山羊抗小鼠 IgG 抗体和偶联红外荧光染料（发射波长 652 nm）的山羊抗兔 IgG 抗体。
    4. 重复步骤 2.1 以去除未结合的抗体。
    5. 将免疫标记后的组织置于室温、避光条件下保存。

3. 组织澄清

  1. 用 PBS 每 10 分钟清洗样品一次，共清洗 3 次。
  2. 用移液器吸除 PBS，加入 50% 乙醇（也可使用甲醇）以进行组织脱水。孵育 10 分钟。更换新鲜的 50% 乙醇，再孵育 10 分钟。重复此步骤一次，共完成 3 次孵育。随后用 70% 乙醇重复孵育步骤。最后更换为 100% 乙醇，孵育 15 分钟（也可使用甲醇替代）。
  3. 用细尖镊子将组织转移至含有约 1 mL 溶液-1 的新微量离心管中，孵育 4 小时。
  4. 用细尖镊子将组织转移至含有溶液-2 的新微量离心管中，孵育约 4 小时。
    注意：避光保存时，免疫荧光信号在室温下至少可稳定维持 6 个月。
  5. 切勿与任何水溶液（e.g. 封片剂）混合，否则将丧失透明效果。

4. 显微镜观察的制片

  1. 请勿将组织置于标准的载玻片与盖玻片之间，因为组织较软，容易变形。
  2. 参照图5B，按以下步骤将组织安装在Sykes-Moore样品室中：
    1. 使用尖头镊子将一个直径25 mm的圆形盖玻片放入样品室底座中。
    2. 用尖头镊子将橡胶垫圈放置在底座内的盖玻片上。
    3. 用移液器在盖玻片中央滴加一滴（约40 µL）Solution-2。
    4. 用尖头镊子将一块组织从Solution-2转移至盖玻片中央的液滴中。
    5. 将第二块盖玻片置于垫圈顶部。
    6. 将锁紧环旋入底座顶部，压紧盖玻片和垫圈直至稳固。
      注意：请小心操作，避免过度拧紧，否则会导致盖玻片破裂。
    7. 将一根22号针头插入底座的一个端口，并穿过垫圈。
    8. 用一个3 mL注射器吸取约1.5 mL的Solution-2。
    9. 在注射器上安装一根25号针头。
    10. 将注射器针头插入对侧端口，并穿过垫圈。
    11. 确保样品室内的空气通过另一根25号针头排出，缓慢注入Solution-2，直至充满样品室。
    12. 移除针头和注射器，将样品室放置在共聚焦显微镜载物台上的大尺寸玻璃载片上。
  3. 或者，可从PDMS硅胶片上切割定制的孔洞。
    1. 用剪刀从PDMS片材上剪下一块25.4 × 25.4 mm2的正方形。
    2. 用手术刀在该片材上切割出一个约12.7 × 12.7 mm2的孔洞作为样品井。
    3. 将该片材牢固地压在显微镜载玻片上。
    4. 用Solution-2将样品井完全充满至边缘。
    5. 将组织从微量管中转移至样品井中央。
    6. 用尖头镊子将一块盖玻片盖在样品井上方，确保盖玻片底部被Solution-2润湿。
    7. 将带有组织的Sykes Moore Chamber组件 放置在共聚焦显微镜载物台上。

5. 共聚焦显微镜

  1. 使用10倍物镜将腔室中的组织调至焦点。
  2. 上下移动显微镜载物台，穿过焦平面，测量组织顶部与底部之间的距离。
  3. 以2.5 µm为步进移动载物台，采集一组从组织顶部到底部的共聚焦图像文件。

6. 逆转透明化

  1. 通过将组织转移至含有 > 20 倍体积的 100% 乙醇的微量管中来逆转透明化处理。每隔 1 小时依次更换为 70% 乙醇、50% 乙醇，最后更换为 PBS。于 4 °C 避光保存。
    注意：现在可对组织进行标准的石蜡包埋、切片以及组织学或免疫组织化学染色处理。

7. 去卷积

注意：在以下步骤中，软件命令、选项卡和下拉菜单将以斜体标示。

  1. 启动去卷积软件并打开图像文件。
  2. 在“摘要”窗口中输入所列参数。
    1. 对于“间距”，输入体素的 x、y 和 z 维度，单位为 µm。
    2. 针对每个荧光通道，从下拉菜单中选择免疫染色所用的荧光染料。
    3. 对于“成像模式”，从下拉菜单中选择激光扫描共聚焦。
    4. 对于“物镜”，从下拉菜单中选择 10x。
    5. 对于“浸没介质”，从下拉菜单中选择空气。
    6. 点击“应用”按钮。
  3. 点击“去卷积”选项卡。
  4. 在下拉菜单中点击“3D 去卷积”。
  5. 在“3D -去卷积”窗口中，确认设置如下：1) 自适应点扩散函数盲去卷积，2) 理论点扩散函数，3) 使用（默认自适应点扩散函数，10 次迭代，中等噪声），4) 基础文件名。
  6. 点击“绿色对勾按钮”以启动程序。
  7. 完成后，重复步骤 7.3 至 7.6 以重新启动程序；完成后再次重启，共进行第三次也是最后一次运行。
  8. 在“数据管理器”窗口中，点击文件名前缀为 "10-10-10-" 的文件。
  9. 点击“文件”选项卡，然后点击“另存为”。
  10. 在“另存为”窗口中，从“数据类型”下拉菜单中选择“8 位无符号整数”，然后点击保存。

8. 图像处理

  1. 启动 Fiji 软件。
    1. 点击“文件”，点击“打开”，选择去卷积后的图像文件，然后在“打开”窗口中点击“打开”按钮。
    2. 点击“图像/颜色/拆分通道”，将三色图像文件拆分为三个仅包含单一颜色的新文件。保存包含绒毛毛细血管免疫标记图像集的红色图像文件，删除绿色和蓝色图像文件。
    3. 使用“处理/减去背景”功能从红色图像文件中减去背景荧光。
    4. 在下拉菜单中将“滚动球半径”设置为 10 像素。
    5. 保持其余 4 个菜单选项未勾选，然后点击“确定”。
    6. 在“处理图像栈”菜单中点击“是”。
    7. 通过打开“图像/调整/亮度-对比度”菜单，调节最小值、最大值、亮度和对比度设置，以去除组织固有的自发荧光（自体荧光）。注意不要去除任何毛细血管的免疫荧光信号。
    8. 通过打开“图像/调整/阈值”菜单并调节滑块，使毛细血管免疫荧光信号突出显示，从而最小化残留的无关荧光。勾选“暗背景”选项框，然后点击“应用”。在“转换为二值图像的下拉菜单”中勾选“黑色背景”选项框，然后点击“确定”。将生成的黑白（二值）图像文件保存，用于后续分析。

9. 分析

  1. 对象计数与骨架化
    1. 选择在步骤 8.1.8 中创建的二值图像文件。
    2. 点击“分析/3D OC 选项 并仅勾选“体积 和 '储存结果 …' 下拉菜单中的框。确保 显示数字 复选框未被选中。点击“确定 按钮
    3. Click on '分析/三维物体计数器. 在下拉菜单中，设置“大小过滤器：最小值 至5000。确保“排除边缘处的物体 复选框未被选中。请检查“对象s，统计学 和“摘要 方框已勾选。点击“确定按钮.
      注意：所需时间可能为数分钟，具体取决于文件大小和计算机配置。
    4. 保存统计表和对象图文件。
    5. 选择 Objects 地图文件。点击“插件/骨架化/二维-三维骨架化 对二值文件中的毛细血管网络进行骨架化。单击“文件/另存为. 选择“Tiff… 在下拉菜单中。在“另存为TIFF”窗口中添加 "Skel-" 目标对象映射文件名，然后单击“保存 按钮.
    6. 点击“分析/骨架/分析骨架 2D-3D. 在下拉菜单中接受默认设置，然后点击“确定按钮. 保存分支 信息 表格，'结果 表格，以及两个输出文件（Skel-Objects-labeled - 骨架和标记的骨架）。

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结果

从妊娠8周至足月分娩期间的人类胎盘终末绒毛簇中生成的毛细血管三维重建图像被计数为独立的绒毛簇，并进行骨架化以进行网络分析。胎盘的功能单位（图1A）是绒毛树，其为表面血管延伸至胎盘实质的部分（图1B，放大见1C）。对解剖所得绒毛树远端部分的样本（图1D 和 1E）进行免疫标记，以显示绒毛滋养层及其内部的毛细血管（图2）。该组织透明化系统的关键作用在于支持三维重建的实现。

使用本研究中的共聚焦系统，未透明化组织的免疫荧光信号仅能在约100 µm或更浅的深度范围内获取（图3...

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讨论

机构审查委员会已批准从选择性终止的妊娠中采集胎盘绒毛组织用于福尔马林固定。在操作开始前，简要回顾病历以记录孕妇年龄、胎次，并确认无任何基础性疾病（例如，高血压、糖尿病、红斑狼疮）或胎儿异常（结构或染色体异常、生长异常）。数据表及所采集的任何标本仅以研究编号标识，因此所有标本在离开手术室前均已去标识化。绒毛由经过培训的观察者（CMS）采集；去除蜕膜和绒毛膜板后，仅收集游离的绒毛团块。

使用基于溶剂的方法对组织进行透明化处理时，有几个重要的注意事项。首先，组织必须充分脱水才能实现透明化，因此需将组织通过梯度浓度的乙醇（或甲醇）逐步洗涤至100%。使用乙醇时，必须采用"无水试剂级乙醇，其中不能含有水分。此外，每一步脱水过程中都应使用足量的脱水溶液，通常所需溶液体积约为组织体积的10–20倍，以确保脱水完全。若组织脱水不充分，透明化后会出现浑浊现象。另一个重要考虑因素是染色所用抗体的浓度。抗体过量可能导致非特异性结合，并因阻塞扩散通道而造成抗体无法充分渗透到组织内部；而抗体浓度过低则会导致染色不完全，因为抗体在到达组织中心前即已被耗尽。因此，在处理大样本之前，应先...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由纽约州发育障碍人士办公室和纽约州新罗谢尔市胎盘分析有限责任公司资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10% 甲醛溶液（w/v），溶于磷酸盐缓冲液Macron Fine ChemicalsH-121-08通用固定剂，即用型配方，使用时需注意其蒸气有毒
手术刀片ThermoFisher Scientific08-916-5B No. 11
手术刀ThermoFisher Scientific08-913-5
精细镊子Electron Microscopy Services78354-119
微量离心管（1.7 mL）PGC Scientifics505-201
磷酸盐缓冲液（PBS）SigmaD8537PBS
移液管VWR52947-948一次性，3 mL 转移移液管
Triton X-100Boehriner Mannheim789 704从原液稀释至 0.1%
羊血清Gibco16210-064用 PBS 溶液稀释至 2%
小鼠单克隆抗角蛋白 7（CK7）抗体 Ab-2（克隆号 OV-TL 12/30）ThermoFisher ScientificMS-1352-RQ
兔抗 CD31 抗体Abcamab28364
绿色荧光染料（发射波长 520 nm） InvitrogenA11017Alexa-Fluor 488
近红外荧光染料（发射波长 652 nm）InvitrogenA21072Alexa Fluor 633
200 证明乙醇Pharmco-Aaper111000200根据需要使用 PBS 稀释至较低浓度
溶液-1Visikol Inc.Visikol Histo-1
溶液-2Visikol Inc.Visikol Histo-2
Skyes-Moore 染色缸BellCo Glass Inc.P/N 1943-11111
25 号针头ThermoFisher Scientific14-826AABD Precision Glide 针头
3 mL 注射器ThermoFisher Scientific14-823-40BD 一次性注射器
PDMS 硅胶片McMaster-CarrP/N 578T31
共聚焦显微镜Nikon Inc.Nikon C1 共聚焦显微镜
去卷积软件Media CyberneticsAutoQuant X22
Fiji 图像处理软件免费开源 软件，可从 https://fiji.sc 获取
苏木精Leica Biosystems3801570SelecTech H&E 染色系统的组分 1
醇溶性伊红Leica Biosystems3801615SelecTech H&E 染色系统的组分 2
蓝化缓冲液Leica Biosystems3802918SelecTech H&E 染色系统的组分 3
Aqua Define MCXLeica Biosystems3803598SelecTech H&E 染色系统的组分 4
免疫组织化学检测系统ThermoFisher ScientificTL-125-QHDUltraVision Quanto Detection System HRP DAB

参考文献

  1. Thornburg, K. L., Kolahi, K., Pierce, M., Valent, A., Drake, R., Louey, S. Biological features of placental programming. Placenta. 48, Suppl 1 47-53 (2016).
  2. Misra, D. P., Salafia, C. M., Charles, A. K., Miller, R. K. Birth weights smaller or larger than the placenta predict BMI and blood pressure at age 7 years. J Dev Orig Health Dis. 1 (2), 123-130 (2010).
  3. Burton, G. J., Fowden, A. L., Thornburg, K. L. Placental Origins of Chronic Disease. Physiol Rev. 96 (4), 1509-1565 (2016).
  4. Srinivasan, A. P., Omprakash, B. O. P., Lavanya, K., Subbulakshmi Murugesan, P., Kandaswamy, S. A prospective study of villous capillary lesions in complicated pregnancies. J Pregnancy. 2014, 193925(2014).
  5. Jones, C. J. P., Desoye, G. A new possible function for placental pericytes. Cells Tissues Organs. 194 (1), 76-84 (2011).
  6. Maly, A., Goshen, G., Sela, J., Pinelis, A., Stark, M., Maly, B. Histomorphometric study of placental villi vascular volume in toxemia and diabetes. Hum Pathol. 36 (10), 1074-1079 (2005).
  7. Ellery, P. M., Cindrova-Davies, T., Jauniaux, E., Ferguson-Smith, A. C., Burton, G. J. Evidence for transcriptional activity in the syncytiotrophoblast of the human placenta. Placenta. 30 (4), 329-334 (2009).
  8. Jirkovská, M., Kubínová, L., Janáček, J., Kaláb, J. 3-D study of vessels in peripheral placental villi. Image Anal Stereol. 26 (3), 165-168 (2011).
  9. Pearce, P., et al. Image-Based Modeling of Blood Flow and Oxygen Transfer in Feto-Placental Capillaries. PLOS ONE. 11 (10), 0165369(2016).
  10. Plitman Mayo, R., Olsthoorn, J., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. Computational modeling of the structure-function relationship in human placental terminal villi. J Biomech. 49 (16), 3780-3787 (2016).
  11. Mayhew, T. M. A stereological perspective on placental morphology in normal and complicated pregnancies. J Anat. 215 (1), 77-90 (2009).
  12. Teasdale, F. Gestational changes in the functional structure of the human placenta in relation to fetal growth: a morphometric study. Am J Obstet Gynecol. 137 (5), 560-568 (1980).
  13. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  14. Dulbecco, R., Vogt, M. Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses. J Exp Med. 99 (2), 167-182 (1954).
  15. Gill, J. S., Salafia, C. M., Grebenkov, D., Vvedensky, D. D. Modeling oxygen transport in human placental terminal villi. J Theor Biol. 291, 33-41 (2011).
  16. Plitman Mayo, R., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. Three-dimensional modeling of human placental terminal villi. Placenta. 43, 54-60 (2016).

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