三维重建与分析免疫标记并透明化处理的人类胎盘小叶血管网络

摘要

本研究介绍了一种可逆组织透明化、免疫染色、三维成像及分析人胎盘绒毛样本中血管网络的实验方案，样本体积约为 1 - 2 mm³。

摘要

母体与胎儿之间的营养物质和气体交换发生在母体绒毛间隙血与构成人类胎盘实质大部分的庞大绒毛毛细血管网络之间的界面上。远端绒毛毛细血管网络是胎儿血液供应的终末部分，其血管自脐带延伸后经过多级分支形成。该网络具有一层连续的细胞外鞘，即合体滋养层屏障层，可防止胎儿血液与持续浸润其周围的母体血液发生混合。在母体糖尿病、高血压和肥胖等疾病中，胎盘毛细血管网络完整性受到损害，会对胎儿、婴儿乃至成人造成严重的健康风险。为了更明确地界定这些损害的结构效应，本研究建立了一种能够捕获体积约为1 - 2 mm³毛细血管网络结构的实验方案，从而可在其完整复杂性的基础上研究其拓扑特征。为此，从胎盘中分离出终末绒毛簇，并对滋养层细胞层和毛细血管内皮细胞进行免疫标记。随后，采用一种新型组织透明化处理方法对这些样本进行澄清，使其能够获取深度达约1 mm的共聚焦图像堆栈。然后对这些图像堆栈的三维重建结果进行处理与分析，以获得诸如毛细血管网络体积、毛细血管分支数量及分支末端点等基本参数，作为验证该方法适用于毛细血管网络表征的依据。

引言

我们对胎盘发育及其病理学的理解在很大程度上局限于通过组织学切片推断出的相邻绒毛及其所含毛细血管之间的空间关系。在本研究中，我们通过建立生成人胎盘毛细血管网络三维（3D）重建图像的方法，解决了这一问题，所获图像适用于对毛细血管网络特征的分析例如 分枝、实心度）。为此，我们将免疫荧光染色与两种商用组织透明化产品 Visikol-1 和 Visikol-2（下文中简称 Solution-1 和 Solution-2）相结合。

人胎盘是一个复杂的血管网络，位于母体绒毛间隙血液与发育中的胎儿之间的交界处。脐带从其在绒毛膜板的附着点向外延伸，分支形成动脉和静脉网络，遍布绒毛膜表面，构成复杂的血管系统。这些血管末端进一步深入胎盘盘状结构的内部或深层，在此处经历多轮分支，最终形成终末绒毛及其所含的毛细血管网，此处即为胎儿与母体血液之间进行气体、营养物质及代谢废物交换的部位。

发育过程中对胎盘毛细血管网络的损伤会对胎儿、新生儿以及成长中的个体健康产生持久影响 ^1,2,3鉴于与妊娠相关的病理状况，如流产、宫内生长受限、子痫前期和妊娠期糖尿病 ^4,

方案

本方案遵循纽约州发育障碍基础研究所人类研究伦理委员会的指导原则。

1. 绒毛树解剖

1. 用磷酸盐缓冲液（PBS）¹⁴冲洗经甲醛固定的胎盘组织，以去除甲醛，并将组织置于解剖显微镜载物台上的培养皿中。使用解剖刀和精细镊子将胎盘组织分离，寻找绒毛树（白色丝状分枝结构）。分离出数毫米长的绒毛树片段，并将组织转移至含有约 1 mL PBS 的微量离心管中。

2. 免疫荧光染色

1. 用移液器吸去 PBS，更换为新鲜 PBS。室温下静置 10 分钟，期间偶尔轻轻涡旋混匀。重复此步骤一次。
   ​注意：此步骤及后续所有步骤均在室温下进行，仅一抗孵育步骤除外。
2. 用移液器吸去 PBS，更换为含 0.1% Triton-X100 和 2% 山羊血清的 PBS（PBS-T-GS），以通透组织并阻断二抗的非特异性结合。孵育 30 分钟。
3. 将 PBS-T-GS 换为含 2% 山羊血清的 PBS，并加入小鼠单克隆抗 CK7 抗体和兔抗 CK7 抗体。
   1. 4 °C 下孵育组织过夜。
   2. 用 PBS-GS 洗涤 10 分钟，期间偶尔轻轻涡旋，以去除残留抗体。
   3. 吸去 PBS-GS，更换为含 2% 山羊血清的 PBS，并加入偶联绿色荧光....

结果

从妊娠8周至足月分娩期间的人类胎盘终末绒毛簇中生成的毛细血管三维重建图像被计数为独立的绒毛簇，并进行骨架化以进行网络分析。胎盘的功能单位（图1A）是绒毛树，其为表面血管延伸至胎盘实质的部分（图1B，放大见1C）。对解剖所得绒毛树远端部分的样本（图1D 和 1E）进行免疫标记，以显示绒毛滋养层及其内部的毛细血管（图2）。该组织透明化系统的关键作用在于支持三维重建的实现。

使用本研究中的共聚焦系统，未透明化组织的免疫荧光信号仅能在约100 µm或更浅的深度范围内获取（图3.......

讨论

机构审查委员会已批准从选择性终止的妊娠中采集胎盘绒毛组织用于福尔马林固定。在操作开始前，简要回顾病历以记录孕妇年龄、胎次，并确认无任何基础性疾病（例如，高血压、糖尿病、红斑狼疮）或胎儿异常（结构或染色体异常、生长异常）。数据表及所采集的任何标本仅以研究编号标识，因此所有标本在离开手术室前均已去标识化。绒毛由经过培训的观察者（CMS）采集；去除蜕膜和绒毛膜板后，仅收集游离的绒毛团块。

使用基于溶剂的方法对组织进行透明化处理时，有几个重要的注意事项。首先，组织必须充分脱水才能实现透明化，因此需将组织通过梯度浓度的乙醇（或甲醇）逐步洗涤至100%。使用乙醇时，必须采用"无水试剂级乙醇，其中不能含有水分。此外，每一步脱水过程中都应使用足量的脱水溶液，通常所需溶液体积约为组织体积的10–20倍，以确保脱水完全。若组织脱水不充分，透明化后会出现浑浊现象。另一个重要考虑因素是染色所用抗体的浓度。抗体过量可能导致非特异性结合，并因阻塞扩散通道而造成抗体无法充分渗透到组织内部；而抗体浓度过低则会导致染色不完全，因为抗体在到达组织中心前即已被耗尽。因此，在处理大样本之前，应先.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10% 甲醛溶液（w/v），溶于磷酸盐缓冲液	Macron Fine Chemicals	H-121-08	通用固定剂，即用型配方，使用时需注意其蒸气有毒
手术刀片	ThermoFisher Scientific	08-916-5B No. 11
手术刀	ThermoFisher Scientific	08-913-5
精细镊子	Electron Microscopy Services	78354-119
微量离心管（1.7 mL）	PGC Scientifics	505-201
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma	D8537	PBS
移液管	VWR	52947-948	一次性，3 mL 转移移液管
Triton X-100	Boehriner Mannheim	789 704	从原液稀释至 0.1%
羊血清	Gibco	16210-064	用 PBS 溶液稀释至 2%
小鼠单克隆抗角蛋白 7（CK7）抗体 Ab-2（克隆号 OV-TL 12/30）	ThermoFisher Scientific	MS-1352-RQ
兔抗 CD31 抗体	Abcam	ab28364
绿色荧光染料（发射波长 520 nm）	Invitrogen	A11017	Alexa-Fluor 488
近红外荧光染料（发射波长 652 nm）	Invitrogen	A21072	Alexa Fluor 633
200 证明乙醇	Pharmco-Aaper	111000200	根据需要使用 PBS 稀释至较低浓度
溶液-1	Visikol Inc.		Visikol Histo-1
溶液-2	Visikol Inc.		Visikol Histo-2
Skyes-Moore 染色缸	BellCo Glass Inc.	P/N 1943-11111
25 号针头	ThermoFisher Scientific	14-826AA	BD Precision Glide 针头
3 mL 注射器	ThermoFisher Scientific	14-823-40	BD 一次性注射器
PDMS 硅胶片	McMaster-Carr	P/N 578T31
共聚焦显微镜	Nikon Inc.		Nikon C1 共聚焦显微镜
去卷积软件	Media Cybernetics		AutoQuant X22
Fiji 图像处理软件			免费开源 软件，可从 https://fiji.sc 获取
苏木精	Leica Biosystems	3801570	SelecTech H&E 染色系统的组分 1
醇溶性伊红	Leica Biosystems	3801615	SelecTech H&E 染色系统的组分 2
蓝化缓冲液	Leica Biosystems	3802918	SelecTech H&E 染色系统的组分 3
Aqua Define MCX	Leica Biosystems	3803598	SelecTech H&E 染色系统的组分 4
免疫组织化学检测系统	ThermoFisher Scientific	TL-125-QHD	UltraVision Quanto Detection System HRP DAB