该议定书描述了一种简单的检测方法, 用于识别在正常大气氧水平下缺氧的果蝇幼虫。该协议允许低氧幼虫与其他突变体区别, 这些变种显示重叠的表型, 如迟缓或缓慢生长。
动物缺氧可能是由于暴露在低大气氧水平或内部组织损伤, 干扰氧分配。氧敏感神经元的异常行为也可能在正常氧水平存在时诱发缺氧样的行为。在黑腹中, 低氧水平的发育会在幼虫阶段抑制生长和迟缓行为. 然而, 这些已建立的氧缺乏表现与许多变异的表型重叠, 这些突变调节生长, 压力反应或运动。因此, 目前尚无可用于鉴别 i) 细胞缺氧的方法, 由突变或 ii. 类缺氧行为诱发的异常神经元行为所致。
我们最近确定了在正常氧水平下发生的对缺氧的内部检测的两种不同的行为. 首先, 在所有阶段, 这样的幼虫避免挖洞进入食物, 经常偏离远离食物来源。其次, 当幼虫缺氧时, 在游荡的第三龄期内通常发生的隧道进入软基底。本文所描述的检测方法旨在检测和定量这些行为, 从而提供一种检测内源性损伤而非低外氧诱发的缺氧的途径。用琼脂基质和酵母糊的中央插头的化验板, 用于支持动物通过幼虫生活。幼虫的位置和状态每天跟踪, 因为它们从第一个到第三个龄期开始。蛹使用 NIH ImageJ 后, 在游荡期进入琼脂基质的隧道量化。在确定缺氧是突变体表型的一个组成部分时, 该检测将具有重要的价值, 从而为有关基因的可能行动地点提供洞察力。
复杂的分子遗传工具阵列可在黑腹中使用, 这使它成为研究进化保守的生物过程的宝贵有机体. 在进化过程中, 对氧气可用性的关键分子反应被证明是保守的, 在D.腹腹中, 先前的研究已经产生了对这些信号通路的通用组件的洞察力1,2, 3,4,5,6。
作为一项研究, 目的是解剖D.黑腹幼虫的感官神经元功能, 我们确定了两种行为反应, 证明是在正常氧水平7的组织缺氧激活。其中之一, 没有挖洞到食物, 是高度相关的反应低氧水平报告的 Wingrove 和 O ‘ 法雷尔8。第二种行为是, 在晚期第三龄期流浪阶段, 未能进入软基底, 以前并没有发现与缺氧有关。我们确定, 暴露野生型流浪幼虫到低氧水平也抑制了基质隧道的7, 从而确定这两种行为都来源于缺氧-无论是由组织损伤或低氧摄入水平引起的。在这里, 我们描述了我们已经发展到定量这两种缺氧诱导行为, 这是从幼虫孵化后立即观察开始。
早期幼虫阶段的缺氧反应没有被检查过, 因此在整个幼虫生命中进行分析是我们化验的一个重要组成部分。大多数明显的缺氧表现–缓慢的发育、不良的生长和运动迟缓–与许多突变产生的幼虫表型重叠。但我们发现, 只有第三龄幼虫缺氧, 才显示隧道7完全失败。因此, 我们确定, 即使幼虫在生长和运动方面比我们的缺氧幼虫更受损害, 仍然执行了一些隧道, 而缺氧幼虫从来没有隧道7。这项化验的另一项有价值的因素是, 它提供了一种方法, 以建立当缺氧是特定的多效性表型的来源, 而不是其他一些压力或代谢故障。作为化验的演示, 我们在这里描述了它的使用, 以表征幼虫的反应, 减少气管表达的uninflatable, 一个基因, 功能在幼虫气道9。
我们设想, 这种化验将是有价值的研究人员的特性, 包括不良的生长和迟缓行为的幼虫表型。因此, 可以确定影响整个人体内氧气分布、使用或反应的新基因。此外, 将这一分析纳入突变体筛选协议, 将为确定产生缺氧的突变提供直接途径。这一检测也将有价值的分析电路, 诱发缺氧诱导的先天行为在这里描述。这种类型的神经网络分析是目前研究的热点, 而黑腹型幼虫的简单神经系统是解剖自动行为的重要系统. 已经确定了与幼虫氧知觉有关的感官神经元, 为确定缺氧诱发反应的完整电路提供了第一步10,11。使用我们的检测结合选择性神经击倒通过 GAL4-UAS 系统12是一个明确的路线, 以划定进一步的组成部分, 神经网络。
我们在这里介绍了一种简单的检测方法, 用于测定黑腹鼠幼虫的组织缺氧. 诊断的基础是在早期幼虫生命中减少穴居入食物丘, 以及在幼虫生命后期没有基质隧道。幼虫的拥挤可能导致过早的迁移远离食物来源, 因此, 分析的一个关键方面是, 少量的幼虫在存在大量过剩食物的情况下进行测定。将杀菌剂甲磷羟基苯甲酸酯 (Nipagen) 加入琼脂板中, 对于防止霉菌在测定过程中的生长也是必不可少的。
我们发现, 琼脂板块可以是一个变异的来源, 在化验。通常, 同一基因型的幼虫, 从不同批次的父母, 或从不同的幼虫收集, 显示相对有限的变化, 在他们的行为在化验。相比之下, 在不同的天或不同批次的琼脂制成的琼脂可以产生不同的隧道。因此, 其中一个规定是, 控制和实验幼虫都应该使用琼脂板进行测试, 从同一批次准备。琼脂从不同的制造商, 甚至从同一制造的出货量可能会因其胶凝强度而异, 因此, 可能需要调整琼脂浓度从这里使用的 2.2%, 以达到最佳凝胶。我们发现野生型幼虫可以很容易地在3% 琼脂凝胶中挖洞。
为了证明这一检测的价值, 我们用它来研究在气管的uninflatable抑制功能的幼虫中潜在的组织缺氧.我们的研究结果有力地支持了这样的假说: 这种基因的气管表达丧失会产生缺氧, 如btl-Gal4 > 无人技术-uif rna 干扰幼虫显示在食物中无法挖洞, 完全没有基质隧道。第三龄。在我们先前对其他基因型的研究中, 我们观察到, 缺氧引起的食物挖洞的损失并不像底层隧道的损失那么完整, 而在这里研究的btl-Gal4 > 无人参与-uif rna 干扰幼虫的表现类似。因此, 这种化验失败的隧道成分提供了最强烈的缺氧迹象。
尽管btl-Gal4 > uif rna 干扰幼虫显示了缺氧的行为特征诊断, 但切口(ue)-Gal4 > 无人与uif rna 干扰没有表现出这些异常。btl和剪切(ue) Gal4 驱动程序以不同的阶段和不同的模式在幼虫气管中表示。btl-Gal4 驱动程序是在整个气管系统中表达的, 从胚胎发生的发育开始, 继续通过幼虫的生命。相比之下, 从切口(ue)-Gal4 驱动程序的 Gal4 表达式仅在胚胎生命结束后开始, 在气管发生后, 仅限于背树干的后部, 主要纵向血管气管系统。因此, 使用此 Gal4 行击倒的uif可能不会过早地减少uif表达式, 也不足以产生触发此检测中测量的行为所需的低氧阈值水平。
先前的研究发现, 第三龄幼虫暴露在低 (10%) 氧水平显示下降的增长和延迟发病的 pupariation 14。在这里研究的btl-Gal4 > 无人管理系统-uif rna 干扰幼虫进展到了第三个龄期, 但对它们的生长和蛹率的影响更明显: 它们比很少脂肪组织的控制小得多。表皮 (图 3), 并且只有次要分数 (~ 10%) 尝试 pupariation。这些差异表明btl-Gal4 > 无人参与-uif rna 干扰幼虫经历了更大程度的缺氧, 或者是因为uif在气管中的击倒在整个幼虫生命中存在, 或者因为它产生了更三龄时严重缺氧。在这一点上, 在气管中uif函数的丢失如何防止氧传输目前还不清楚。btl-Gal4 > 无人飞机-uif的气管通过角质层 (图 3) 可以很容易地看到, 这表明它们包含空气, 并没有被损坏到流体进入损害功能的地步。因此, 由于uif功能的丧失而造成的气管损害并不引起缺氧, 而是一些其他阻碍隧道的缺陷。对于先前研究的基因型, 我们确定, 隧道的失败与高浓度的 LDH mRNA7有关, 在晚期第三龄幼虫的糖酵解和缺氧的规范指标15。因此, 对btl-Gal4 > 无人参与-uif rna 干扰幼虫 (以及在今后使用本化验中检查的幼虫) 的缺氧的最后确认将涉及 rt-pcr, 以评估 LDH mRNA 水平或使用商业上可用的指标来衡量胞内氧水平 (例如, 请参见16)。
The authors have nothing to disclose.
凯伦. 羌是赖斯大学乔治 j 斯瑞普菲研究奖的2016接受者。范蠡是赖斯大学教学奖学金的接受者。布卢明顿果蝇库存中心, 哈佛旅行设施, 维也纳果蝇资源中心的服务, 感激地承认。
REAGENTS | |||
Dehydrated yeast | |||
Frozen grape juice concentrate | Welch's | Available at most large supermarkets | |
Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
Drosophila agar | Apex Bioresearch Products | 66-103 | |
Methyl-para-hydroxybenzoate | Apex Bioresearch Products | 20-658 | |
EQUIPMENT | |||
50 ml polypropylene beakers | |||
6.0 cm disposable Petri dishes | Falcon | 08757100B | |
10 cm disposable plastic Petri dishes | E+K Scientific | EK-24104 | |
Plastic microspatulas | Corning Incorporated | 3012 | |
Bent teasing needle | Nasco | S08848MH | |
Dissecting microscope | Any microscope with 10-30X magnification |