本方案描述了一种简单的检测方法，用于鉴定在正常大气氧浓度下处于缺氧状态的Drosophila melanogaster幼虫。该方案可将缺氧幼虫与表现出相似表型（如活动迟缓或生长缓慢）的其他突变体区分开来。
本文内容
摘要
摘要
动物缺氧可能由暴露于低大气氧浓度或内部组织损伤导致氧气分布受阻引起。此外，氧气感应神经元的异常活动也可能在正常氧浓度条件下诱发类似缺氧的行为。在D. melanogaster中，低氧环境下的发育会导致幼虫期生长受抑制以及行动迟缓。然而，这些明确的缺氧表型与许多调控生长、应激反应或运动能力的基因突变所引起的表型存在显著重叠。因此，目前尚无可用的检测方法来识别：i）由基因突变引起的细胞水平缺氧，或 ii）由神经元异常活动诱发的类似缺氧行为。
我们最近在D. melanogaster幼虫中鉴定出两种在正常氧浓度下因内部感知缺氧而产生的独特行为。首先，在各个发育阶段，这些幼虫均避免钻入食物中，常常远离食物源。其次，在正常情况下三龄游走期幼虫会钻入柔软基质中，但若幼虫处于缺氧状态，则该钻洞行为完全消失。本文所述的实验方法旨在检测并量化这些行为，从而提供一种用于识别由内部损伤而非外界低氧所引发缺氧状态的手段。实验使用含有琼脂基质及中央酵母膏小块的培养皿，以支持幼虫整个幼虫期的生长发育。从一龄到三龄期，每天记录幼虫的位置及其状态。在化蛹后，利用NIH ImageJ软件对游走期幼虫钻入琼脂基质的程度进行量化分析。该实验方法有助于判断缺氧是否为某种突变表型的组成部分，从而为相关基因的作用位点提供线索。
引言
D. melanogaster 拥有复杂的分子遗传学工具体系，使其成为研究进化上保守生物学过程的重要模式生物。研究表明，生物对氧气可利用性的关键分子响应在进化过程中高度保守，此前在 D. melanogaster 中开展的研究已揭示了这些信号通路中普遍存在的核心组分1,2,3,4,5,6。
在一项旨在解析 D. melanogaster 幼虫感觉神经元功能的研究中，我们发现了两种行为反应，它们在正常氧浓度下由组织缺氧所激活7。其中一种行为——无法钻入食物中——与Wingrove和O'Farrell报道的对低氧水平的反应密切相关8。另一种行为——在三龄晚期游走阶段无法在柔软基质中掘道——此前未被认定与缺氧相关。我们确定，将野生型游走期幼虫暴露于低氧环境中同样会抑制其在基质中掘道的行为7，从而证实这两种行为均源于缺氧——无论是由组织损伤还是低氧摄入所引起。本文中，我们描述了一种用于定量分析这两种缺氧诱导行为的实验方法，该方法从幼虫孵化后立即开始观察。
早期幼虫阶段的缺氧反应此前尚未被研究过，因此在整个幼虫发育期间进行分析是本实验方法中一个有价值的组成部分。大多数明显的缺氧表型——发育迟缓、生长不良以及运动迟钝——与许多突变所导致的幼虫表型重叠。但我们发现，只有处于三龄幼虫阶段且经历缺氧的个体才会完全丧失钻孔能力7。因此我们确定，即使某些幼虫在生长和运动能力方面比我们的缺氧幼虫更严重受损，它们仍会进行一定程度的钻孔行为，而缺氧幼虫则从不钻孔7。因此，本实验方法的另一个重要价值在于，它提供了一种手段来判断特定的一组多效性表型是否源于缺氧，而非其他应激或代谢功能障碍。作为该实验方法的应用示例，本文描述了其在表征气管中uninflatable基因表达降低的幼虫所产生反应中的使用，该基因在幼虫气道中具有功能9。
我们预计，该检测方法将有助于研究人员表征包括生长迟缓和行动迟钝在内的幼虫表型。由此，可能鉴定出影响机体各部位氧气分布、利用或反应的新基因。此外，将该检测方法纳入突变体筛选流程，可直接用于鉴定导致缺氧的突变。该检测方法在分析引发本文所述缺氧诱导的先天行为的神经回路方面也具有重要价值。此类神经网络分析是当前大量研究的重点，而黑腹果蝇（D. melanogaster）幼虫结构简单的神经系统是解析自动化行为的有力模型。参与幼虫氧气感知的感觉神经元已被鉴定，为全面阐明缺氧诱导反应的完整神经回路迈出了第一步10,11。结合本检测方法与GAL4-UAS系统介导的特异性神经元功能抑制12，可明确地进一步解析该神经网络的其他组分。
方案
1. 幼虫的准备
- 在开始实验前两到三天，按照 Wieschaus 和 Nusslein-Volhard13所述方法设置所需实验组和对照组的杂交组合（每组至少20只雌蝇和10只雄蝇），使用50 mL聚丙烯烧杯和直径6.0 cm的一次性培养皿，培养皿内含葡萄汁琼脂，并在使用前涂抹酵母糊。将果蝇置于避光、室温条件下培养，直至使用。
- 葡萄汁琼脂配方——在1 L玻璃烧杯中加入100 mL冷冻的100%葡萄汁浓缩液、350 mL去离子水、5 mL冰醋酸和13 g D. melanogaster琼脂。微波加热，每次1–2分钟，间歇搅拌，直至琼脂完全溶解。溶液稍冷却后，加入10 mL溶于95%乙醇的10%（w/v）尼泊金（对羟基苯甲酸甲酯）。混匀后，每块培养皿中加入7 mL混合液，室温下静置凝固并干燥3–4小时。用塑料袋封装后于4 °C保存。
- 酵母糊配方——7 g干酵母与10 mL去离子水混合，用刮刀搅拌至均匀糊状。
- 定时收集卵以获得实验组和对照组的幼虫。使用新制的、涂有酵母糊的葡萄汁琼脂培养皿，在上午时段避光、室温下收集卵4小时。移除该4小时收集的卵板，并更换新的培养皿。将收集有卵的培养皿在25 0C下过夜培养，至次日下午，此时大多数幼虫已孵化。收集这些一龄幼虫，并用于后续实验设置。
2. 建立检测板
- 检测板的制备。每次实验运行需准备5个实验组平板，每板含10只实验幼虫，以及5个对照组平板，每板含10只对照幼虫。使用直径1.5 cm的打孔器从每个平板中去除中央的琼脂核心，形成用于放置食物的孔洞。将酵母糊（0.8–0.9 g）填入孔中，并用刮刀轻轻拍压，使其形成填满孔洞的小丘状。
- 琼脂平板的制备——在2 L玻璃烧杯中加入700 mL去离子水和16 g D. melanogaster 琼脂，微波加热5分钟。从微波炉中取出后，用玻璃棒搅拌，使未溶解的琼脂进入溶液。加入17.5 mL 10%（w/v）尼泊金溶于95%乙醇的溶液，混匀，然后继续以每次30秒的微波加热并搅拌，直至所有琼脂完全溶解。冷却一至两分钟，随后用移液器将15 mL等分试样加入10 cm塑料培养皿中。让琼脂凝固，盖上皿盖，并在室温下干燥数小时或过夜。将平板置于密封塑料袋中，于18 °C保存。
注意1：为避免因过度干燥导致尼泊金晶体在平板表面析出，建议在制备后数日内使用平板。如有必要，可在晶体上滴加数微升95%乙醇使其重新溶解。
注意2：不同批次的琼脂可能具有不同的凝胶特性。干燥后的琼脂平板应质地坚实，且具有足够的弹性，以便使用打孔器制作食物孔时能完整取出一个干净、无破损的琼脂圆片（见上文）。 - 在检测平板中放置幼虫。通过机械压力使塑料微型刮刀尖端弯曲，并将尖端蘸取少量酵母糊，以提供粘附力来拾取幼虫。逐个拾取一龄幼虫，将其放置在靠近食物小丘的琼脂平板上。为实验组和对照组基因型均至少准备5个重复平板，每板10只幼虫。完成后，盖上皿盖并标记每个平板，将平板（盖子朝上）置于室温下的暗处（本实验室为22 °C）。
3. 监测检测板
- 每天在解剖显微镜下检查培养皿，记录位于食物表面或琼脂表面的幼虫数量。注意观察是否有明显死亡或濒死的幼虫。注意幼虫进入三龄期时是否出现钻入琼脂基质的现象。记录蛹开始形成的日期，并注意是否存在任何蛹的异常情况。持续每日观察，直至所有幼虫死亡或化蛹完毕。
- 用弯曲的解剖针小心地将蛹从培养皿中取出，并转移至葡萄培养皿中。如需要，可继续监测蛹的发育情况，以确定有多少蛹能羽化为成虫。
4. 准备用于成像的检测板
- 小心移除并丢弃每个培养皿中央孔洞中的所有酵母食物。
- 用自来水轻轻冲洗每个培养皿，并使用柔软的艺术家画笔轻轻刷去粘附在琼脂表面的残渣。多次更换水并持续轻柔刷洗，直至每个培养皿完全清洁。最后用去离子水冲洗一遍，盖上盖子，于室温下静置过夜使其干燥。
注意： 琼脂内部的隧道化现象在食物堆周围最为显著（见图2）。因此，食物孔洞的边缘通常会超出初始的1.5 cm直径。此外，在该区域中已被扰动的琼脂较为脆弱，清洁过程中可能导致部分形成隧道的琼脂小块从孔洞边缘脱落。提高琼脂凝胶浓度可能有助于缓解这些问题，但在Image J定量分析步骤中也可进行相应校正（见下文）。
5. 胞间连丝的定量分析
- 对平板进行成像。在黑色背景下拍摄每块平板的图像，使琼脂中的隧道呈现为明亮的白色线条。
注意：此步骤可使用常用于成像DNA凝胶的系统（参见材料与试剂表）。其他能够生成tiff文件的成像系统，如数码相机或手机摄像头，也可调整以获得合适的图像。 - 使用公共领域的程序NIH Image J对幼虫钻蛀行为进行定量分析。从http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html下载该程序。有关该程序的更多信息，请访问http://imagej.nih.gov/ij/docs/intro.html。
注意：也可使用其他成像系统对钻蛀行为进行定量。以下说明适用于NIH Image J。 - 打开钻蛀平板的tiff图像文件后，使用椭圆工具定义一个定量区域，该区域应覆盖整个琼脂表面，但需裁除平板的塑料边缘部分。
- 应用自动阈值功能，生成平板的反相图像，使隧道显示为黑色线条。使用取色器和画笔工具，将代表琼脂损伤而非隧道的黑色区域涂白。
- 在分析下拉菜单中，选择设置比例尺 | 点击清除比例尺，然后在设置测量窗口（也在分析菜单下）中，勾选面积和限定于阈值范围。
- 按下Ctrl键 + M键，显示黑色区域（即隧道）的像素值。
- 将每块平板的像素值复制并粘贴到电子表格程序（如Excel）中，以便进行定量分析。
- 由于该区域钻蛀活动剧烈，中央孔通常会扩大。为定量缺失的钻蛀区域，取消勾选“限定于阈值范围”，并使用魔棒工具定义中央孔区域。按下Ctrl键 + M键，获得该区域的像素值。从该值中减去直径1.5 cm孔的像素值，并将差值加到第5.6步获得的钻蛀值中。
- 对于某些平板，中央孔可能缺失一块包含邻近未钻蛀琼脂区域的钻蛀琼脂。在对这些平板的中央孔进行定量时，使用取色器和画笔工具在缺失区域上添加一条黑色条带，以界定钻蛀区域，并将未钻蛀区域排除在定量之外。
注意1：若实验组幼虫存在任何钻蛀行为，该定量方法可用于计算多块平板的平均钻蛀值，并对对照组与实验组的数值进行统计学比较。
结果
为了展示本实验方法的价值，我们利用该方法研究了气管中uninflatable（uif）基因功能受损的幼虫是否存在潜在的缺氧情况。uif编码一种大型跨膜蛋白，在幼虫气管细胞的顶膜表面强烈表达。先前研究发现，uif突变体会表现出异常行为，提示可能因气管功能障碍而导致组织缺氧9。我们利用Gal4-UAS系统特异性地在幼虫气管中抑制uif的表达。实验中使用了两个Gal4品系：i）breathless（btl）-Gal4，该品系从胚胎发育早期开始在气管中强烈表达；ii）cut（ue）-Gal4，该品系在胚胎发育末期于主背侧气管的后部小区域开始表达，并在整个幼虫阶段持续在该区域强烈表达7。UAS-uif RNAi品系由维也纳果蝇研究中心（VDRC ID #1050）获得。
如上文方案所述，针对四个杂交组合中的每一个，分别设置了五个重复的平板，每个平板中包含新孵化的一龄幼虫。
实验 1
1) 对照组 1 - cut(ue)-Gal4 × Canton-S (+)
2) 实验组 1 - cut(ue)-Gal4 × UAS-uif RNAi
实验 2
3) 对照 2 - btl-Gal4 x Canton-S (+)
4) 实验组 2 - btl-Gal4 x UAS-uif RNAi
实验1中cut(ue)-Gal4>UAS-uif RNAi幼虫在钻洞、掘道及存活至化蛹等方面的行为表现与对照组cut(ue)-Gal4> + 动物相似（图1 和 图2）。相比之下，在发育早期即在整个气管系统中下调uif表达（实验2）则产生了显著不同的反应。btl-Gal4>UAS-uif RNAi幼虫表现出组织缺氧的行为特征——摄食钻洞减少，并在幼虫发育后期完全丧失在基质中掘道的能力（图1 和 图2）。实验组幼虫体型也明显更小、更纤细且行动迟缓（图3），在实验过程中死亡率较高。如上所述，生长减缓、行动迟缓及个体死亡是已知的幼虫缺氧症状。此外，大多数实验组幼虫未能尝试化蛹，在对照组幼虫早已化蛹后仍长期停留在三龄幼虫阶段。部分幼虫存活超过15天，最终未化蛹即死亡（图1A）。少数实验组幼虫尝试化蛹，但均形成了异常的蛹，无法发育为可存活的成虫。
图 1. 食物钻孔行为与幼虫发育的定量分析。
(A) 四种研究基因型中位于食物堆外的存活幼虫百分比。数据表示每种基因型所用五个实验培养皿的平均值。孵化后第 3 天，约 70% 的 btl-Gal4>UAS uif RNAi 幼虫已位于食物外部，而其他三种基因型的幼虫均未在食物外或琼脂表面被检测到。btl-Gal4>UAS uif RNAi 幼虫在孵化后第 4 至 20 天期间缓慢死亡，约 15% 的个体在孵化后第 15 天仍存活。此处及 (B) 图中横轴上的黑色箭头表示其余三种基因型幼虫全部化蛹的时间点。
(B) 四种基因型中在食物外部可见的死亡幼虫百分比。数据表示每种基因型五个实验培养皿的平均值。死亡的 btl-Gal4>UAS uif RNAi 幼虫随时间逐渐积累，且多数个体在食物外部死亡。其余基因型均能存活至化蛹阶段。
(C) 四种研究基因型的化蛹存活率。数据表示每种基因型五个实验培养皿的平均值。btl-Gal4>UAS uif RNAi 基因型未产生任何正常蛹。图中所有误差线表示标准误（SEM）。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2. 幼虫钻隧道行为的定量分析。
（A）用于四种研究基因型幼虫钻隧道定量分析的实验平板示例。注意 btl-Gal4>UAS uif RNAi 幼虫完全无钻隧道行为。实验平板为直径 10 cm 的培养皿。
（B）基于 Image J 软件对四种基因型进行的钻隧道定量结果。每种基因型的五个实验平板的平均像素值。在 btl-Gal4>UAS uif RNAi 幼虫中未观察到钻隧道行为。误差线 = 标准误（SEMs）。请点击此处查看该图的高清版本。
图 3. btl-Gal4>UAS uif RNAi 与 btl-Gal4> + 幼虫的比较
相同年龄（孵化后第6天）的 btl-Gal4>UAS uif RNAi （A）与 btl-Gal4> + （B）基因型幼虫。红色箭头指向背侧主支气管。两种幼虫的图像放大倍数相同。比例尺 = 0.5 mm。 请点击此处查看此图的放大版本。
讨论
本文介绍了一种用于检测黑腹果蝇（D. melanogaster）幼虫组织缺氧的简单检测方法。该检测基于幼虫早期在食物堆中钻孔能力下降，以及幼虫晚期缺乏在基质中挖掘隧道的行为。幼虫密度过高可导致其过早离开食物源，因此该检测的一个关键环节是使用少量幼虫并在存在大量过剩食物的条件下进行实验。此外，必须在琼脂平板中添加杀菌剂对羟基苯甲酸甲酯（Nipagen），以防止检测过程中霉菌生长。
我们发现，琼脂平板可能是该实验中变异性的来源之一。通常情况下，相同基因型的幼虫，即使来自不同批次的亲本或不同采集批次的幼虫，在实验中表现出的行为差异相对有限。相比之下，在不同日期制备或使用不同批次琼脂制成的平板可能导致挖掘行为的差异。因此，一个必要条件是，对照组和实验组的幼虫必须使用同一批次制备的琼脂平板进行测试。不同厂家生产的琼脂，甚至同一厂家不同批次的琼脂，其凝胶强度可能存在差异，因此可能需要将琼脂浓度从本实验所用的2.2%适当提高，以获得理想的凝胶状态。我们发现，野生型幼虫能够轻松钻入3%的琼脂凝胶中。
为了展示本实验方法的价值，我们已将其用于研究功能受抑制幼虫中潜在的组织缺氧情况 不可充气的 在气管中. 我们的研究结果为“该基因在气管中表达的缺失可导致缺氧”这一假说提供了有力支持： btl-Gal4 >UAS-uif RNAi 幼虫表现出无法钻入食物，且在三龄幼虫期完全丧失在基质中挖掘隧道的能力。在我们之前对其他基因型的研究中观察到，缺氧引起的钻食行为丧失不如基质隧道挖掘能力的丧失那样彻底。 btl-Gal4>UAS-uif 此处研究的RNAi幼虫表现出类似行为。因此，该实验中掘道失败的组分是缺氧最有力的指示。
尽管 btl-Gal4>uif RNAi 幼虫表现出缺氧的典型行为特征，但 cut(ue)-Gal4>UAS-uif RNAi 幼虫并未表现出这些异常。在幼虫气管中，btl 和 cut(ue) Gal4 驱动子的表达时期和表达模式各不相同。btl-Gal4 驱动子从胚胎发育阶段开始，持续在整个气管系统中表达，并延续至幼虫期。相比之下，cut(ue)-Gal4 驱动子的 Gal4 表达仅在胚胎发育末期、气管形态建成之后才开始，且仅限于背侧主干（气管系统的主要纵向管道）的最末端区域。因此，使用该 Gal4 品系敲低 uif 可能未能在足够早的阶段或足够广泛的范围内降低 uif 的表达水平，从而无法达到引发本实验所检测行为所需的缺氧阈值。
先前的一项研究发现，暴露于低氧水平（10%）的三龄幼虫表现出生长减缓以及化蛹起始延迟14。本研究中使用的btl-Gal4>UAS-uif RNAi幼虫能够发育至三龄阶段，但其生长和化蛹速率受到更显著的影响：它们体型明显小于对照组，表皮下脂肪组织极少（图3），仅有极小部分（约10%）尝试化蛹。这些差异表明，btl-Gal4>UAS-uif RNAi幼虫可能经历了更严重的缺氧状态，原因可能是气管中uif基因的敲低贯穿其整个幼虫期，或是在三龄阶段导致了更严重的氧气剥夺。目前尚不清楚气管中uif功能的丧失如何阻碍氧气运输。在btl-Gal4>UAS-uif RNAi幼虫中，气管可通过体壁清晰可见（图3），表明其内部含有空气，并未严重受损到允许液体进入并影响功能的程度。因此，从理论上讲，uif功能缺失所导致的气管损伤可能并未引发缺氧，而是造成了其他某种缺陷，从而抑制了钻隧行为。对于先前研究的基因型，我们已确定钻隧失败与乳酸脱氢酶（LDH）mRNA水平升高相关7，而LDH mRNA是晚期三龄幼虫中糖酵解和缺氧的经典指标15。因此，对btl-Gal4>UAS-uif RNAi幼虫（以及未来使用该检测方法所研究的幼虫）是否发生缺氧的最终确认，可通过RT-PCR检测LDH mRNA水平，或使用 commercially available 指示剂测定细胞内氧水平（例如参见16）。
披露
作者声明不存在相互竞争的经济利益。
致谢
Karen M. Qiang 是2016年莱斯大学George J. Schroepfer研究奖的获得者。Fanli Zhou 获得了莱斯大学的教学奖学金。谨此感谢布卢明顿果蝇品系中心、哈佛大学TRiP设施以及维也纳果蝇资源中心提供的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| 干酵母 | |||
| 冷冻葡萄汁浓缩液 | Welch's | 可在大多数大型超市购买 | |
| 冰醋酸 | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| 果蝇培养基琼脂 | Apex Bioresearch Products | 66-103 | |
| 对羟基苯甲酸甲酯 | Apex Bioresearch Products | 20-658 | |
| 仪器设备 | |||
| 50 ml 聚丙烯烧杯 | |||
| 6.0 cm 一次性培养皿 | Falcon | 08757100B | |
| 10 cm 一次性塑料培养皿 | E+K Scientific | EK-24104 | |
| 塑料微量刮勺 | Corning Incorporated | 3012 | |
| 弯头解剖针 | Nasco | S08848MH | |
| 体视显微镜 | 任何具有 10–30 倍放大功能的显微镜 |
参考文献
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