一种诱导大鼠抑郁样行为的新方法

摘要

本方案描述了一种新模型，即健康大鼠通过接触慢性不可预测应激（CUS）大鼠，可在一定时间内通过传染方式产生抑郁样行为。

摘要

传染性抑郁是一种尚未被充分认识的现象，其原因在于该领域相关研究资料尚不充分。目前，尚无现成的研究模式可用于探讨传染性抑郁的作用机制、预防、控制及治疗方法。因此，本研究的目的是建立首个传染性抑郁的动物模型。

健康的 rats 在接触抑郁的 rats 后可能会表现出抑郁行为。根据本方案所述，通过在5周内对 rats 施加多种慢性不可预测性应激（CUS）处理，可诱导其产生抑郁。蔗糖偏好实验的成功结果证实了 rats 抑郁状态的形成。随后，将经历 CUS 处理的 rats 与来自传染组的未受干预 rats 同笼饲养（每笼2只抑郁 rats 配1只未受干预 rats），持续额外5周。由经历 CUS 的 rats 与未受干预 rats 共同组成了30个社交群体。

本研究提出的动物抑郁传染方案主要包含将经历慢性不可预知性应激（CUS）的大鼠与健康大鼠同笼饲养5周。为验证该方法的有效性，需进行一系列测试：首先在诱导大鼠产生抑郁状态后进行蔗糖偏好测试，随后在共居期结束时再次进行蔗糖偏好测试，并同时开展旷场实验和强迫游泳实验。整个实验过程中，每只大鼠均被标记编号，并在每次测试后均被放回原笼具中。

该方法存在一些局限性，例如在蔗糖偏好实验中，实验组与对照组之间记录到的差异较弱，以及强迫游泳实验具有不可逆的创伤性结果。在将来应用该方案之前，这些因素可能需要考虑其适用性。尽管如此，在实验结束后， naïve 大鼠在与接受慢性不可预知性应激（CUS）处理的大鼠同笼饲养5周后，出现了传染性抑郁现象。

引言

近期进行的研究表明，精神疾病可能通过传染方式轻易传播给健康个体¹。这种情况被称为社会传染，通过情绪、态度或行为进行传播。只需一名抑郁个体与一个或多个健康个体互动，即可促进情绪的共享。因此，社会关系对情绪状态具有重要作用，它通过模仿和"情绪传染"机制，决定了情绪在个体之间的传递。传染效应所需的时间长短不一²，这不可避免地取决于情绪的强度以及接受者自身的抵抗能力。

情绪传染的显著后果使得过去的研究主要集中在负面方面。负面效应的结果导致传染性抑郁受到极大关注，研究表明，传染性抑郁会增加抑郁症患者的家庭成员和朋友表现出抑郁行为的可能性^3,4,5,6。

治疗抑郁症既有个人层面的意义，也有经济层面的重要性。抑郁症常导致病态发生，其在美国的终生发病率介于13.3%至17.1%之间⁷。世界卫生组织的数据显示，抑郁症在全球疾病负担中位列第四，影响所有性别、年龄和社会背景的人群，可显著损害健康状况，影响人际交往能力^8,9,10,11，并导致过度残疾^12,13。据估计，每年约有85万人死于抑郁相关的自杀¹⁴。临床上通常为患者开具抗抑郁药物，或建议其接受认知行为治疗。这些治疗方法对约60%-80%的患者有效。然而，抑郁症的治疗仍面临重大挑战；并非所有抑郁症患者都能获得治疗。对于接受治疗的患者，部分人会出现副作用，另一些人则对治疗方案依从性较差¹⁵。对治疗产生抵抗的患者比例高达约40%¹⁴。抑郁症还经常以高昂的治疗费用、劳动力减少和提前退休等形式对经济造成影响¹⁶。据估计，抑郁症每年给美国造成约440亿美元的经济损失，几乎占该国生产力损失的一半¹⁷。高昂的治疗成本需要严密的医疗监护，这导致多种医疗支出增加，并需提前预判不良结局以及治疗反应不佳的情况¹⁸。

由于尚未发现已得到验证的动物模型可用于研究抑郁传染机制及其预防与治疗，本假想性动物实验方案首次被采用。该方案提示，通过与经历慢性不可预知性应激（CUS）的大鼠共同饲养，健康大鼠倾向于表现出抑郁样行为。本实验的主要目标是建立一种实验室操作程序，以突出显示抑郁可通过传染方式从经历CUS的大鼠传递给健康大鼠。随后，评估实验结果以确定抑郁的传染效应是否仅局限于抑郁症状，或是否也涉及其他情绪障碍，例如焦虑。本实验的最终目标是更深入地理解抑郁传染机制，从而推动新型治疗策略的研发¹⁹。

方案

以下实验程序遵循《赫尔辛基宣言》和《东京宣言》以及欧洲共同体《实验动物使用指南》的建议。本实验亦经内盖夫本-古里安大学动物护理委员会批准。

1. 实验操作前大鼠的准备

注意：实验操作中，选择无明显病理特征的雄性 Sprague-Dawley 大鼠，每只体重在 300 至 350 g 之间。

1. 每笼饲养三只大鼠，自由摄食饲料并饮水 随意 并给予至少两周的适应时间，交替进行12小时光照和12小时黑暗。
2. 实验开始前，使用为期3天的 depressive-like behaviors 检测方法对所有大鼠进行抑郁样行为测试 蔗糖偏好实验（参见步骤 4）。
3. 排除表现出抑郁样行为的大鼠，以及与这些大鼠同笼饲养的大鼠，以避免在实验开始前抑郁状态可能传播给未受影响的大鼠；首先剔除经检测呈抑郁阳性的大鼠，随后剔除与抑郁大鼠同笼饲养的大鼠。
4. 如有必要，随机剔除额外的大鼠，最终为抑郁实验组保留60只大鼠，传染组30只，对照组30只。
5. 使用编号贴纸对大鼠进行标记，并在整个实验过程中保持标记。实验期间暂时将大鼠转移至单独的笼具中饲养（在CUS、蔗糖偏好和开放场实验期间，置于同一房间并保持相同暗周期；在强迫游泳实验及其中一种应激源处理时，置于不同房间并采用不同暗周期，参见2.1.7），实验结束后将其重新放回原有的群体饲养环境。

2. 大鼠抑郁模型的建立方法

注意：为了诱导抑郁，对CUS暴露组的60只大鼠进行为期五周的多种CUS操作²⁰。

1. 连续5周，每天随机选取以下7种应激源中的任意2种，分别在白天和夜间对大鼠进行暴露。
   1. 将大鼠分组饲养（每笼6只，而非通常的3只，持续18 h）；
   2. 将大鼠置于倾斜的笼子中（沿垂直轴倾斜45°，持续3 h）；
   3. 剥夺大鼠食物（18 h）；
   4. 剥夺大鼠饮水（18 h），并在急性缺水期结束后立即暴露于空水瓶前（1 h）；
   5. 将大鼠置于潮湿垫料笼中（在垫料中倾倒300 mL水），持续8 h（夜间周期）；
   6. 对大鼠进行持续光照（24 h），每周两次采用颠倒的光/暗周期（12 h）；
   7. 将大鼠置于高温环境（40°C，5 min — 夜间周期），使用另一装置提高温度。
2. 通过进行蔗糖偏好实验（参见步骤4）确认抑郁状态的形成。
   注意：在上述每个步骤后，该方案可暂停。此外，若任何大鼠表现出异常行为，则应剔除该大鼠以及可能受其影响的其他大鼠。

3. 在未受干预大鼠中建立抑郁传染的实验步骤

1. 从CUS暴露组（60只）和抑郁传染组（30只）的大鼠中建立30个社交群体：
   1. 每笼饲养两只接受CUS处理的大鼠，共30个笼子。
   2. 将抑郁传染组的一只大鼠分别加入各含有两只CUS应激大鼠的笼子中。
2. 允许 共同居住 用于 5 周 在标准条件下，提供普通饲料和水 随意.
3. 经过5周的共同饲养后，按所示顺序对各组进行蔗糖偏好、开放场地和强迫游泳实验 图1.

4. 蔗糖偏好实验²¹

1. 在黑暗周期期间，将大鼠置于与饲养环境相同的房间内的单独笼子中。
2. 在每个笼子中放置一瓶 100 mL 的 1% (w/v) 蔗糖溶液，持续 24 小时，使其适应。
3. 移除瓶子，并使大鼠禁食禁水 12 小时。
4. 在每个笼子中放置两个瓶子，一个装有 100 mL 蔗糖溶液 (1%, w/v)，另一个装有 100 mL 自来水，持续 4 小时。
5. 记录消耗的蔗糖溶液和水的体积（单位为 mL），并按以下公式计算蔗糖偏好率：
   

5. 开场实验

注意：标准旷场实验常用于评估实验动物的运动能力、探索行为、类似焦虑的行为以及对新奇刺激的行为反应^{22, 23}。该实验也被用于分析抑郁样行为²⁴。旷场实验考察两种相互矛盾的行为参数：啮齿类动物对旷场中央明亮光照区域的恐惧，与其趋向新奇环境的探索欲望之间的权衡。当动物处于焦虑状态时，倾向于躲避暴露区域，紧贴墙壁停留（接触性趋避，thigmotaxis）。这种焦虑程度通过动物回避中央明亮区域的程度来判定。旷场装置由一个黑色无反光丙烯酸箱体（120 cm × 60 cm × 60 cm）构成，分为中央区域（占25%）和周围区域（占75%）。实验在动物饲养房间内进行，时间为黑暗周期期间。在旷场上方约200 cm处悬挂一台视频摄像机，用于记录实验过程^{22, 23}。

1. 每次引入动物前，用5%酒精清洁装置。将大鼠置于开放场的角落，使其面向墙壁。
2. 用摄像机记录大鼠5分钟内的行为。
3. 分析录像后的以下参数：总移动距离、在场地中央区域的运动速度，以及在场地中央区域停留的时间。

6. 强迫游泳实验

注意：强迫游泳实验的原理基于以下事实：当大鼠被置于有限空间内被迫游泳时，它们最终会放弃挣扎而保持静止状态，仅偶尔移动身体以避免溺水^{21, 23}。由于已组装的实验装置体积庞大，该实验在黑暗周期期间于另一房间内进行。

1. 进行适应性训练时，将大鼠放入一个玻璃圆柱形容器（高 100 cm，直径 40 cm，深 40 cm）中，容器内盛有室温水，让大鼠游泳 15 分钟。
2. 将大鼠从容器中取出，用纸巾擦干，并置于温暖的笼子中静置 15 分钟。
3. 将大鼠放回其原来的笼子中；
   注意：此步骤可作为暂停点。此外，若在测试过程中发现任何大鼠出现溺水迹象，应立即将其取出。
4. 次日，录制一段 5 分钟的游泳过程视频，并在录像结束后分析以下指标：静止不动、攀爬行为和排便情况。

结果

蔗糖偏好实验： 在将大鼠暴露于为期5周的慢性不可预知性应激（CUS）以诱导抑郁状态后，再将健康大鼠与经历CUS的大鼠共同饲养5周。在实验结束时，这两组大鼠均表现出类似抑郁的行为（图2）。这种行为的证据体现在抑郁大鼠在CUS后对蔗糖的偏好降低：与对照组30只大鼠（101 ± 7%，图2）相比，CUS处理组大鼠的蔗糖偏好显著下降（65 ± 2.8%，p < 0.001，图2）。在10周时，60只经历CUS的大鼠与对照组30只大鼠相比，蔗糖偏好仍存在统计学显著差异（95 ± 3.4%，图2 vs. 72 ± 3.3%，p < 0.001，图2）；同样，与CUS处理大鼠共处5周后的30只“抑郁传染”大鼠也表现出显著降低的蔗糖偏好（76 ± 4.7%，p < 0.001，

讨论

根据本实验方案的应用结果，健康的实验大鼠与抑郁大鼠长期共同饲养后，会受到抑郁大鼠的负面影响，这与人类的情况相似。共同饲养五周后，原本健康的大鼠受到已抑郁同伴的影响而出现抑郁样行为，首次建立了一个明确的动物抑郁传染模型。此前一项针对猪的研究也提示抑郁猪与健康猪之间存在情绪状态的共享²⁵。

通过应用慢性不可预知性应激（CUS）可诱导大鼠产生抑郁。该方法能够体现日常社会环境应激源的常见特征。文献资料显示，CUS是动物抑郁诱导中使用最广泛的方法。采用该方法获得的结果与临床症状及类抑郁行为具有高度相似性。若在大鼠上正确实施，大鼠可表现出所有已知的抑郁症状²⁶。该方法在大鼠上能够诱发全部类抑郁行为，证明了CUS作为一种抑郁诱导方法具有高度的可预测性和构效效度^27，28。CUS方法同样被用作动物抑郁模型，用于分析抑郁病理生理过程中的细胞与分子机制，以及研究抗抑郁药物的作用机制

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
大鼠笼具	Techniplast	2000P	啮齿类动物常规饲养笼具。本实验全程用于饲养大鼠
水	-	-	实验各阶段使用的普通自来水
普瑞纳饲料	Purina	5001	提供给大鼠、小鼠和仓鼠的啮齿类动物实验室饲料，是一种生命周期营养饲料，已在生物医学研究中使用超过50年。本实验中大鼠可自由取食
水瓶	Techniplast	ACBT0262SU	150 ml 水瓶，分别装有 100 ml 水和 100 ml 1%（w/v）蔗糖溶液
黑色无光泽有机玻璃箱	-	-	（120 cm × 60 cm × 60 cm），分为中央区域（占25%）和周围边缘区域
视频摄像机	Canon	-	用于开放场实验中高清记录大鼠行为的数码摄像机
酒精	药房	-	将99%药用酒精稀释至5%，用于在每只大鼠测试前清洁开放场实验箱
玻璃圆柱	-	-	高100 cm、直径40 cm、深40 cm的圆柱形容器，用于进行强迫游泳实验
纸巾	药房	-	干燥纸巾，用于将大鼠从水中取出后擦干体表
记号笔	-	-	常用的粗头记号笔，用于标记大鼠