Method Article

小鼠嗅觉学习和鉴别的客观和可重复性试验

DOI:

10.3791/57142

⸱

March 22nd, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 2Medical Scientist Training Program, Baylor College of Medicine, 3Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine, 4Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 5Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute at Texas Children's Hospital

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在这里, 我们训练老鼠的结合学习任务, 以测试气味歧视。这项议定书还允许对学习诱发的大脑结构变化进行研究。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

嗅觉是小鼠主要的感官形态, 影响着许多重要的行为, 包括觅食、捕食者的检测、交配和养育。重要的是, 老鼠可以被训练, 以联想到新的气味与特定的行为反应, 以提供洞察嗅觉电路功能。本协议详细介绍了训练小鼠进行去/不去操作学习任务的过程。在这种方法中, 老鼠每天都接受数以百计的自动试验的训练, 2–4周, 然后可以测试新的去/不去气味对评估嗅觉歧视, 或用于研究气味学习如何改变嗅觉的结构或功能电路.此外, 鼠标嗅球 (OB) 的特点是不断整合成人出生的神经元。有趣的是, 嗅觉学习增加了这些成年神经元的生存和突触连接。因此, 该协议可以结合其他生物化学, 电生理和成像技术, 以研究学习和活动相关的因素, 调解神经元的生存和可塑性。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

老鼠 OB, 气味信息首先进入中枢神经系统 (CNS), 提供了一个很好的模型来研究经验依赖的结构变化。OB 迂回以活动依赖性的方式不断整合成人出生的神经元。成人出生的神经元前体分裂从祖细胞, 线的脑室下层区相邻的侧脑室 1.当迁移到 OB, 这些神经元前体要么生存, 分化, 并整合为抑制颗粒细胞, 或经历凋亡2。细胞命运的选择受嗅觉活动的影响, 包括嗅觉学习3,4,5,6。整合后, 学习诱导的突触变化发生在颗粒细胞在两个星期的关键期间7,8。因此, 嗅觉学习的化验对于研究经验依赖性可塑性如何影响成熟脑回路的结构和功能重组是有用的。

该协议提供了一种嗅觉训练的方法, 使用一个操作的调节范式。在这项任务中, 缺水的老鼠被训练成将一种气味 ("去" 气味) 与水奖励和另一种气味 ("不去" 气味) 联系在一起试用超时处罚。在2-4 周的过程中, 小鼠通过一系列分级训练阶段取得进展。当训练完成后, 老鼠会用离散的、相应的行为 (在试验中寻求水奖励, 而不寻求不去试验的水奖励) 对去或不去的气味作出反应 (图 1a)。训练完成后, 老鼠可以进一步挑战与化学相似的气味对测试歧视或转变为研究如何嗅觉学习改变的结构或功能的 OB。虽然以前已经描述过气味识别任务, 但大多数依赖于主观测量, 例如两个气味9、10之间的嗅探次数。此外, 人类对这类任务的评分也需要耗费时间。这个协议中描述的去/不去嗅觉学习任务提供了一种无偏见, 直接测量气味歧视和嗅觉学习。

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所有老鼠都是根据国立卫生研究院的标准, 由贝勒医学院动物保育和使用委员会批准的一项议定书使用的。在本议定书中使用的老鼠都是成年小鼠 (> 6 周龄) 的 C57BL6/j 背景, 包括雄性和雌性小鼠。在训练/分期任务后, 老鼠被送回自己的笼子里。

1. 使用操作性学习框的构造和一般规则 (图 1B、C)

  1. 用房间地板组装一个小鼠室。保持训练箱在低流量, 昏暗的灯光区域, 以避免分心。
  2. 钻每个水口, 上面有一个小孔, 允许18口径的针头在港口内分配水。
  3. 填充玻璃瓶与气味溶解在矿物油 (更换每周), 并安全收紧瓶盖。
  4. 将18口径针连接到硅胶油管。皮尔斯玻璃瓶帽与18口径针, 并连接其他端的硅胶管的入口的气味端口。
  5. 将每个硅胶管放入一个气味阀。
  6. 将真空线连接到异味端口。
  7. 将两个10毫升注射器连接到金属夹杆上, 并将油管与注射器相连。将油管的另一侧连接到18克针。将针放入鼠标室的鼻戳口钻孔。将油管的另一端连接到水阀。
  8. 用啮齿动物的饮用水填满这两个10毫升注射器。
  9. 将空气流量计与进气口连接, 并保持3–5升/分钟的气流。
  10. 连接2个阀门, 2 个气味阀门, 2 个水端口, 气味端口, 电源到 USB 接口系统。将所有阀门连接到 "输出" 端口、所有的气味和水端口到 "输入" 端口。将所有设备连接到 usb 接口框中的电源输出, 最后将 usb 接口框连接到电源。
  11. 调整真空吸力, 避免试验之间的异味交叉污染。
  12. 使用气味特定的油管连接气味瓶到房间。

2. 鼠标准备: 1–3天

  1. 把老鼠分成3组: 控制 (不需要嗅觉训练), 伪训练 (随机接受奖励或惩罚的老鼠) 和训练有素的团体。将伪训练的小鼠暴露在训练箱和气味的传递上, 但不提供嗅觉训练, 因为奖励与惩罚的结果是随机关联的气味传递。
    注: 伪训练组将在 "Pseudotraining" 阶段完成训练范式。训练有素的老鼠将完成所有训练阶段。Pseudotraining 是可选的, 如果实验的目的是检测气味歧视或学习的行为差异。这里提供的协议增加了这个小组, 如果实验者想探索在训练前后的神经元差异。pseudotrained 组将控制被动气味暴露和非嗅觉相关训练。
  2. 开始在小鼠的水限制到40毫升/公斤/天。避免体重损失大于20% 的动物的基线重量, 以避免遇险 (图 2A)。
  3. 每天对老鼠进行称量, 以确保它们比基线重量高80% 以上。如果鼠标低于此阈值, 请将鼠标从研究中移除, 并提供免费的水访问。
  4. 在整个协议中保持所有环境因素恒定, 包括温度、噪音和杂散气味 (包括个人身体和香水/科隆/除臭气味)。
    注意: 与所有动物行为测试一样, 小环境变化会对结果产生很大影响。

3. 所有阶段的指示

  1. 下面每个阶段的代码培训软件。在行为软件上运行软件。
    注意: 所有阶段的编码都包含在补充编码文件中。20条路径的数据被分组为单个块, 并且跨块显示鼠标性能。此外, 每个阶段都可以在鼠标上重复数天, 直到达到完成标准。
  2. 不要把老鼠放在行为盒里超过60分钟/天。
  3. 在每只老鼠被转移到笼子之前, 从笼子里清理老鼠废物。喷雾和擦拭房间与70% 乙醇, 以减少鼠标气味分心。

4. 培训阶段 1: 将水奖励与中心鼻子戳、1–3天联系起来

  1. 在这个阶段, 把老鼠和水的奖励联系在水口的勘探上。
  2. 培训阶段1编程说明
    1. 程序此阶段只使用送水端口。让老鼠收到水奖励每个鼻子戳。
      注: 该程序将输出试验的时间长短和收到的水奖励的总数量。
  3. 设置 pseudotraining 阶段1编程与训练阶段1相同。
  4. 框配置和鼠标设置
    1. 将 "行为" 框配置为中心的水口, 并使所有侧面端口无法访问。把一只老鼠放进房间。关闭鼠标室并开始1阶段程序。
  5. 当鼠标在60分钟内完成100项试验时, 请将此阶段视为完整. 在60分钟或100次试验完成后从会议厅中取出鼠标 (图 2B)。
    注意: 由于个体的差异, 一些老鼠自然会避免探索这个盒子。
  6. 如果需要鼓励, 手动将水输送到水口。重复这个阶段长达3天。
    注意: 已经训练过的老鼠可以进一步重复以保持奇偶校验, 并使它们保持液体的限制。当组平均达到 100 trials/60 分钟时, 也可以将整个组提升到2级。这将允许所有老鼠在同一天继续训练。

5. 培训阶段 2: 将侧口水奖励与中心口鼻戳、1–5天关联

  1. 在这个阶段, 让老鼠戳他们的鼻子在中心港口, 然后立即收到水奖励的侧面端口。
  2. 框配置和鼠标设置
    1. 配置这个和每一个后续阶段有2个水端口两侧和气味端口在中间。把一只老鼠放进房间。关闭鼠标室并开始2阶段程序。
  3. 培训阶段2编程说明
    1. 为鼠标提供即时的水奖励双方后, 鼻子戳到中心的气味传递端口。将此阶段的输出参数设置为试验的时间长短、开始的试验次数以及在5秒内收到的水奖赏数量。
  4. 设置 pseudotraining 阶段2编程与训练阶段2相同。
  5. 考虑到这个阶段是完整的, 当至少有40项试验是在60分钟内进行, 最少有25% 的水奖励在中心口鼻戳的5秒内收到。完成此阶段后移除鼠标 (图 2C)。
    注: 培训计划以及时的方式计算收到的水奖励的百分比, 以确定这个阶段的完成情况。虽然小鼠在完成这个阶段的速度不同, 但大多数老鼠在5天内就能达到完成标准。但是, 如果鼠标没有在5天内完成此阶段, 则不要将鼠标推进到下一阶段。此鼠标将从队列中删除。

6. 培训阶段 3: 将水奖励与特定的气味联系起来, 在特定的时间窗口内, 1–3天

  1. 在这个阶段, 让老鼠在中心端口的鼻子戳时收到一股 (S +) 气味。随后, 在5秒内, 当鼻子戳入侧水端口时, 产生水的奖赏。
  2. 培训阶段3编程说明
    1. 在中心气味端口提供 S + 气味。
    2. 提供水奖励, 如果鼠标在 5 s 的气味传递的侧面端口。
      注意: 该程序开始时只需要在中心端口100毫秒的鼻子戳, 以获得水奖励。一旦鼠标在80% 的试验中对中心端口进行正确的时间戳, 水奖励所需的鼻腔戳的时间长度将增加50毫秒, 达到400毫秒。
    3. 将输出参数设置为与阶段2相同。
  3. 设置 pseudotraining 阶段3编程指令与训练阶段3相同。但是, 不要将 s + 气味与气味传递控制器连接, 以确保 s + 气味与水奖励没有关联。
  4. 框配置和鼠标设置
    1. 在阶段2设置相同的配置。
    2. 将 S + 气味连接到气味传递控制器。把一只老鼠放进房间。关闭鼠标室并开始3阶段程序。完成此阶段后, 请移除鼠标。
  5. 如果在60分钟内有大于60的奖励 (图 2D), 则将此阶段视为完成。

7. 阶段 4A: 关联不去 (S) 气味和超时处罚, 几天

  1. 在这个阶段, 把老鼠介绍给一个不去的气味 (S)。在闻到无异味后, 对不正确进入水口的老鼠提供时间惩罚。
  2. 培训阶段4A 编程说明
    1. 在这个阶段仅交付 S + 气味在开始, 与阶段3相同。在小鼠完成40项试验后, 开始随机传递的气味, 包括 s + 和 s-气味。如果老鼠试图在被提出不去的气味后寻求水的奖励, 计划一个2的时间惩罚。
      注意 : 为了帮助区分去与不去 , 红外线侧灯可以纵 , 他们是在气味和关闭期间 , 在不去气味。在最初的训练中, 这些灯作为辅助提示来帮助老鼠。一旦老鼠接受了灯光的训练, 他们就应该在没有灯光的情况下进行训练, 以确认他们已经学会了气味的任务。
    2. 将输出参数设置为试用时间、开始的试验次数、完成的试验次数、% 正确率以及收到的总奖励数。
  3. 设置 pseudotraining 阶段4A 编程指令与训练阶段 4S, 除 s + 和 s 气味以外从开始随机地被提出。无论任务表现如何, 随机给予水奖励或超时处罚。
  4. 框配置和鼠标设置
    1. 将框配置设置为与上一阶段3相同。
    2. 将 s + 和 s 气味连接到气味传递控制器。把一只老鼠放进房间。关闭鼠标室并开始4A 阶段程序。在小鼠完成40项试验后, 切换程序随机传递气味。完成此阶段后, 请移除鼠标。
  5. 当有40项试验 > 60% 正确的反应时, 请将这个阶段视为完整的。

8. 阶段 4B: 关联不去 (S) 气味和时间惩罚, 5–11天

  1. 培训阶段4B 编程说明
    1. 使这个阶段相同的阶段 4A, 但时间的惩罚, 试图水奖励后, s 气味是 4 s。
  2. 设置 pseudotraining 阶段4B 编程指令相同的阶段 4A, 但水奖励和超时处罚随机交付每审判。
  3. 框配置和鼠标设置
    1. 将框配置设置为与上一阶段4A 相同。
    2. 将 s + 和 s 气味连接到气味传递控制器。把一只老鼠放进房间。关闭鼠标室并开始4B 阶段程序。在60分钟内有 > 100 项试验, 精确度 > 85% (图 2E) 时, 请考虑此阶段完成情况。
  4. 监视每个会话的最大和最小百分比正确, 以跟踪每个鼠标在这个阶段的进度。大约85-90% 的老鼠达到了这个阶段的完成标准。排除没有完成这个阶段的老鼠去/不去测试阶段。
  5. 选)在这个阶段结束时, 应用一个反向训练, 在那里去/不去气味在气味瓶平台上切换。确保小鼠不与另一种刺激相关联, 如与侧面端口相关的阀门的声音。

9. 去/不去化验任务: 1 天, 每只老鼠每天20分钟

  1. 认为这是确定气味联想识别准确性和学习辨别气味对的最后阶段。
    注: 新的气味用于 s +/s-以测试动物花多长时间学习新的协会。结构上类似的气味对用于增加任务难度。例子包括 1-丁醇对1戊醇, 乙酸异戊酯和丁酸异戊, + 香芹酮 vs. 香芹酮。
  2. 编程说明
    1. 让训练软件检测鼻子戳的长度。程序 300 ms 鼻子戳在中心气味端口执行任务。
    2. 将输出参数设置为与阶段4B 相同, 但不使用任何光引导提示。
  3. 框配置和鼠标设置
    1. 将框配置设置为与上一阶段4B 相同。
    2. 将 s + 和 s 气味连接到气味传递控制器。把一只老鼠放进房间。关闭鼠标室, 开始舞台去/不去程序。让那些已经学会嗅觉学习任务的老鼠接触到新的化学相似的气味。
      注: 在大约10-20 块或200-400 项试验 (图 3A) 之后, 有足够气味歧视的 Wildtype 小鼠达到 > 85% 的准确性, 气味新的。

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

一旦老鼠学会了嗅觉学习的任务, 他们现在可以联想到新的气味对与奖励和惩罚。这些受过训练的老鼠通常在去/不去的任务上以大约50% 的精确度开始。该百分比正确可由试用块绘制为新的气味对的学习曲线 (图 3a)。在10块试验中, 大多数小鼠的表现都不到30分钟, 小鼠能够正确辨别出大于85% 精度的气味 (红线)。这表明, 我们的协议已经成功地训练 wildtype 老鼠把一种气味和水奖励联系起来, 另一种是超时惩罚。为了评估两个群体之间的歧视能力, 可以进一步分析这些数据, 以比较达到85% 熟练程度 (图 3B) 或在达到熟练程度后平均百分比正确的试验次数。

一旦老鼠学会了这个任务, 气味对就可以被修改来增加或减少任务难度。例如, 减少气味对浓度会增加任务难度 (

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

啮齿动物嗅觉系统为研究感官依赖性可塑性提供了一个独特的模型。在这里, 我们提出了一个嗅觉学习范式, 训练小鼠将气味对与奖励或惩罚联系起来。通过这项学习任务, 可以在后续实验 (电生理学,体内神经元成像,等) 中研究下游电路的变化。完成后, 小鼠将学会执行一个简单的气味提示任务, 使水奖励与一种气味, 以及超时处罚与另一种气味。

由于这是一种行为分析, 我们建议在实验和控制动物群中利用年龄和性别的平等分布。老鼠之间的条件必须尽可能保持恒定。例如, 确保在整个培训过程中, 鼠标处理程序和光照条件保持不变。如果许多鼠标不按预期执行任务, 请确保满足以下条件: (1) 使行为设置尽可能安静。(2) 水对老鼠的剥夺足够。我们发现, 即使在整整一天的缺水之后, 许多老鼠也不能充分饮用1级的中心端口, 达到完成标准。(3) 在每一个新的鼠标开始, 检查气味/水阀门和管道, 以确保适当的放置。(4) 气味的波动性不同, 因此有些蒸发速度比其他的快。每天用更高的蒸汽压力取代更挥发性的气味, 而不是每周, 特别是如果使用较低浓度。

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明没有利益冲突, 也没有竞争利益。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本协议适用于我们实验室中以前的工作 (黄et )。8). 这里描述的所有方法都得到了贝勒医学院动物护理和使用委员会 (ACUC) 的批准。它得到了 NINDS 医疗机构的支持, R01NS078294 B.R.A.、NIH IDDRC 赠款 U54HD083092、NIDDK 赠款 F30DK112571 到就业选配和 NINDS F31NS092435。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
玻璃瓶QorpakGLC-01016
硅胶管Thermo Scientific86000030
18 号针头BD305196
1-丁醇Sigma Aldrich437603
丙酸Sigma Aldrich402907
小鼠室Med AssociatesENV-307W
Chamber FloorMed AssociatesENV-307W-GFW
水港Med AssociatesENV-313W需要两个
气味刺激Med AssociatesENV-275包含 2 个阀门以门臭传递 
Odor PortMed AssociatesENV-375W-NPP
USB接口Med AssociatesDIG-703A-USB
台式电脑，带Windows 2000、XP、Vista或7
流量计VWR97004-952
行为软件Med AssociatesSOF-735该软件运行每个培训阶段，现已替换为Med-PC V
数据传输软件Med AssociatesSOF-731该软件将数据格式化为 Excel
培训软件Med AssociatesDIG-703A-USB该软件用于对每个培训阶段进行编程
水阀Neptune Research225P012-11该阀门用于对输水进行门控。需要两个
气味阀门Neptune Research360P012-42这个阀门用于门控气味传递。需要两个

References

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