方法文章

用于研究植物-微生物互作的实验室生态系统构建（EcoFAB）协议

19.2K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/57170

⸱

2018年4月10日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Environmental Genomics and Systems Biology Division, Lawrence Berkeley National Laboratory, 2Joint Genome Institute, Department of Energy, 3Joint BioEnergy Institute, 4Department of Environmental Science Policy and Management, University of California

本文内容

摘要

本文详细描述了生态系统器件制造装置（EcoFABs）的构建方案，该装置可在高度受控的实验室条件下用于研究植物及其与微生物的相互作用。

摘要

有益的植物-微生物互作提供了一种可持续的生物学解决方案，有望促进低投入的粮食和生物能源生产。深入理解这些复杂的植物-微生物互作机制，对于提高植物生产力以及开展探究植物-土壤-微生物相互作用的基础生态学研究至关重要。本文详细描述了一种利用广泛可用的3D打印技术构建生态系统（EcoFABs）的方法，以创建受控的实验室生境，用于在特定环境条件下对植物-微生物互作进行机制性研究。文中介绍了两种尺寸的EcoFAB装置，适用于研究多种植物物种的微生物互作，包括Arabidopsis thaliana、Brachypodium distachyon和Panicum virgatum。这些流通式装置可实现对根际微生物组、根系化学特性以及根系形态和微生物定位的精确调控与取样。本实验方案包含在EcoFABs内维持无菌条件的详细步骤，以及将独立LED光照系统安装至EcoFABs的方法。此外，还详细阐述了添加不同类型培养基的方法，包括土壤、沙子和液体培养基，并结合成像技术和代谢组学对系统进行表征。综上所述，这些系统能够在受控环境条件下，动态且深入地研究植物及其微生物群落，包括调控微生物组组成（含突变体）、监测植物生长、根系形态、根系分泌物成分以及微生物的定殖位置。我们预期，这些详细的实验方案将为其他研究人员提供重要的起点，理想情况下有助于建立研究植物-微生物互作的标准化实验体系。

引言

将有益植物微生物应用于农业具有巨大潜力，可提高可持续粮食和生物燃料的生产，以满足不断增长的人口需求1,2,3,4大量研究证实，植物微生物组在植物养分吸收、抗逆性及抗病性方面具有重要作用5,6,7,8然而，由于田间生态系统的复杂性以及由此导致的不可重复性，加之难以精确控制微生物组的组成和遗传特性，使得研究植物与微生物相互作用的这些机制变得十分困难。例如，使用微生物突变体）4,9,10.

一种策略是构建简化的模型生态系统，以开展可控的、可重复的实验室实验，研究植物与微生物的相互作用，从而获得可在田间进一步验证的见解10,11,12。这一理念基于传统方法，即在温室或培养箱中使用装有土壤的花盆或琼脂平板培养植物13。尽管这些方法可能仍是最广泛使用的方式，但它们难以精确监测和调控植物生长环境。为此，根盒（rhizoboxes）和根室（rhizotrons）显著提升了对地下过程的研究能力14,15，并已有首个用于分析土壤中根际代谢物的实验方案发表16。近年来，为实现高通量分析，已开发出先进的微流控装置13,17 ，例如 Plant Chip18,19、RootArray20 和 RootChip21，这些装置可作为高效的植物表型分析工具，以微米级空间分辨率监测小型模式植物 Arabidopsis thaliana 在液体流动培养基中的早期生长阶段。最近，已有研究报道了一种双层成像平台，可在微流控平台上实现对 Arabidopsis thaliana 幼苗期根毛的成像22。

本文提供了构建用于研究植物-微生物相互作用的受控实验室装置（EcoFABs）的详细方案，并展示了该系统可用于研究多种植物，包括Arabidopsis thaliana、Brachypodium distachyon23、生态学上重要的野生燕麦Avena barbata以及生物能源作物Panicum virgatum（柳枝稷）。EcoFAB是一种无菌植物培养平台，包含两个主要组成部分：EcoFAB装置和无菌的、适合植物大小的透明容器。EcoFAB装置采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）制造工艺制备，该工艺涉及使用3D打印塑料模具浇铸PDMS层，并通过已有报道的方法24,25将PDMS层键合到显微镜载玻片上。本方案中描述了EcoFAB工作流程的详细步骤，包括装置制备、灭菌、种子萌发、幼苗移栽、微生物接种/共培养、样品制备与分析（图1）。此外，还介绍了对基本工作流程的进一步改进，包括安装计算机控制的LED生长灯以及使用固体基质的方法。文中还阐述了利用成像技术研究根系形态变化、根部微生物定殖以及根系分泌物的质谱成像分析。我们预期，基于易得材料的简单且低成本的设计，以及本文所提供的详细操作方案，将使EcoFAB平台成为一种公共资源，推动实验室中植物-微生物组研究的标准化。

方案

注意：本实验方案涉及危险化学品、尖锐物品、电气设备、高温物体及其他可能导致伤害的危险因素。应佩戴适当的个人防护装备（PPE， 例如，耐化学手套、护目镜、实验服、长袖衣物、封闭式鞋履 等等应穿戴适当的个人防护装备，并遵守相应的安全规程（安全培训、使用通风橱、 等等。）应予以遵循。

1. EcoFAB 装置制备：浇铸 PDMS 层（图 2 & 图 3）

  1. 使用3D打印技术构建EcoFAB模具（设计文件可从 获取）。每个模具包含三个部分：浇铸框、带特征的模具底座和嵌件，如图所示 图2使用3D塑料打印机，采用刚性不透明光敏聚合物材料打印模具基座和嵌件。打印分辨率不得低于100 µm，并使用丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物（ABS）打印浇铸框架。
  2. 将40 mL硅氧烷弹性体基质与固化剂在一次性1 L容器中混合。根据所需实验（步骤2.1和2.2），采用不同体积比（v/v）的弹性体基质与固化剂（5:1、15:1或30:1）。所有类型的混合物均继续进行步骤1.3至1.8。
    注意：佩戴耐化学腐蚀手套、安全护目镜及其他个人防护装备。
  3. 将容器放入真空室中至少30分钟，以去除弹性体混合物中的气泡。
  4. 将混合物倒入组装好的3D打印塑料模具中（图3A）并将模具置于85 °C的加热块上保持4 h（图3B).
    注意：穿戴个人防护装备以避免灼伤。
  5. 让模具冷却5分钟，然后轻轻将嵌件从模具中取出（图3C），然后将美工刀缓慢插入浇铸模具与PDMS（固化的弹性体混合物）之间，将其分离（图 2D).
  6. 将带有PDMS的模具基底从浇铸框架中向上压出（图 3E）。使用刀片或其他工具在边缘处轻轻将PDMS层从模具基底上分离（图 3F），然后从模具表面缓慢剥离图 3G).
  7. 使用15号钝头针在PDMS层上制备直径约1.6 mm的进样口和出样口，以形成进液通道和出液通道图 3H，我).
    注意：标准模具具有进样口和出样口，而宽出口模具仅需进样口（图 3H，我).
  8. 使用剪刀修剪PDMS层的边缘.
    注意：小型EcoFAB装置所需的PDMS层应修剪为不小于76 mm × 51 mm的矩形，大型EcoFAB装置则应不小于102 mm × 83 mm的矩形。

2. EcoFAB装置制备：将PDMS层化学键合至显微镜载玻片图3 & 图4)

  1. 将PDMS层永久性键合到显微镜载玻片上
    1. 用甲醇冲洗PDMS层（由15:1的弹性体基质与固化剂混合制成）的键合面以及7.6 × 5 cm的显微镜载玻片，然后用压缩空气或超纯氮气吹干。
      注意：甲醇具有毒性。请在通风橱中操作，并佩戴护目镜、手套及其他个人防护装备。
    2. 将显微镜载玻片和PDMS层放入等离子清洗仪中，键合面朝上（图3J）。若无等离子清洗仪，可跳至步骤2.2。
    3. 关闭等离子清洗仪的腔室和气体排气阀，开启真空泵，抽真空1分钟。
    4. 开启等离子发生器电源，将射频（RF）功率调至"HI"档，持续1分钟。
    5. 关闭真空泵和等离子电源，向腔室内通气至常压。
    6. 从等离子腔室中取出显微镜载玻片和PDMS层，迅速将PDMS层的四边均匀施压贴合到载玻片上（图3L）。确保PDMS层中央的椭圆形区域（根室）不与载玻片接触。
    7. 将密封好的EcoFAB装置置于120 °C加热块上加热20分钟，以进一步增强PDMS层与显微镜载玻片之间的永久键合。
    8. 让装置冷却5分钟，用刀片修剪掉PDMS层多余的边缘部分。
  2. PDMS层与显微镜载玻片的可逆物理密封
    1. 可逆密封技术使用一组定制夹具（可通过3D塑料打印机打印或金属加工制成，设计图见图4）。
      1. 将显微镜载玻片放入底夹板的切口内，然后将PDMS层（由5:1的弹性体基质与固化剂混合制成）对齐放置在载玻片上方。
      2. 将上夹板覆盖在PDMS层上，使用四个六角头螺钉将上下夹板固定在一起，安装时螺钉应从夹具顶部穿入，螺母从上方旋紧。
    2. 将PDMS直接粘附于显微镜载玻片
      1. 将PDMS层（由30:1的弹性体基质与固化剂混合制成）放置在显微镜载玻片上方。
      2. 将PDMS层按压至载玻片表面。该软性且高度粘附性的PDMS层（30:1）应能牢固粘附于载玻片，形成防水密封，无需永久化学键合或夹具施加的物理压力（图3L）。

3. EcoFAB 的灭菌

  1. 用超纯水冲洗EcoFAB装置。
  2. 将一个EcoFAB装置放入EcoFAB容器中，加入70%乙醇直至完全浸没装置。盖上容器盖子，轻轻摇晃，使容器内所有表面均接触乙醇。确保EcoFAB装置的根系生长室充满乙醇，尽量减少或避免产生气泡。
  3. 室温孵育30分钟后，倒出70%乙醇，并用100%乙醇重复孵育5分钟。
  4. 倒掉乙醇，将灭菌后的EcoFAB置于超净工作台中干燥16小时，确保完全干燥。如有条件，可打开超净台内的紫外灯照射1小时，对系统进行进一步灭菌。
    注意：使用紫外灯时应穿戴适当的个人防护装备（PPE）。
  5. 将灭菌后的EcoFAB储存于无菌超净台或经高压灭菌的袋子中，以备后续使用。

4. 带LED生长灯的EcoFAB（图5）

  1. 将LED灯带安装到EcoFAB容器上
    1. 在EcoFAB容器上标出9个LED夹的安装位置。从容器底部沿边缘向上120 mm处开始标记第一个夹子位置（图5A），然后以螺旋方式继续标记后续夹子位置，每个夹子比前一个低10 mm。9个夹子呈螺旋排列，使1 m长的LED灯带可在容器上缠绕两圈。
    2. 使用热熔胶将LED夹固定在每个标记位置：在容器上对应夹子安装孔的位置涂两个胶点，将夹子的安装孔压入这两个胶点中，然后在孔上方再加一个胶点进行加固。重复此操作，直至9个夹子形成螺旋排列（图5B）。
      注意：使用热熔胶时请佩戴手套及其他个人防护装备，以防烫伤。
    3. 将LED灯带以螺旋形状穿入各夹子中，LED发光面朝向容器内部。灯带应绕行两圈（图5C）。
  2. 通过控制器将LED灯带连接至电源（图5D显示了灯光点亮的EcoFAB培养室，控制器的编程设置见步骤4.3）。
    注意：存在电击危险：连接导线时务必确保电源已断开。
    1. 使用双芯电缆将电源的正负极分别连接至控制器上的"INPUT: V+"和"INPUT: V-"端口（图5E展示了控制器设置的示意图）。
    2. 将一根公对裸端电缆的裸露端负极导线连接至控制器上的一个"OUTPUT"输出通道。
      注：本实验所用控制器共有五个输出通道，因此最多可支持五条1 m长的LED灯带。
    3. 将所有电缆的正极导线连接至一个紧凑型拼接连接器（若需使用多个通道），然后将该连接器连接至控制器的"OUTPUT V+"端口。
    4. 将每条LED灯带插入电缆的母端接口，使每个LED灯带拥有独立的控制通道。如有需要，可使用母对公电缆延长连接距离。
  3. 根据制造商说明，对控制器进行编程以设定所需的光照周期。

5. 在 EcoFAB 中培养植物

  1. 种子灭菌与萌发
    注意：种子灭菌及后续所有幼苗操作必须在无菌条件下进行。以下讨论的灭菌方法适用于种子的 拟南芥，有稃燕麦，二穗短柄草，以及 柳枝稷。柳枝稷 种子应在灭菌前用60%硫酸悬浮处理1小时。考虑到发芽率和发芽均一性，建议每个EcoFAB装置准备1-2粒种子。
    1. 将种子在70%乙醇中浸泡2分钟。
    2. 用移液器除去乙醇，并用无菌水将种子冲洗三次。
    3. 将种子置于10%次氯酸钠溶液中5分钟。
    4. 移除漂白液，并用无菌水将种子彻底清洗三遍。
    5. 向种子中加入无菌水，将微量离心管置于4 °C冰箱中孵育7天。
    6. 将种子均匀地铺在0.5倍MS & 琼脂糖（phytagel）浓度为0.6%的MS培养基，并用微孔胶带密封培养皿。
    7. 将植物培养至根长约5 mm，以便转移至EcoFAB中（图6A）。对于本实验，将植物置于22 °C的培养室中，采用16小时光照/8小时黑暗的光照周期，培养2至7天后转移至EcoFAB（其中拟南芥为2天 Avena barbata 和 短柄草，7天 拟南芥 和 Panicum virgatum).
  2. 将幼苗转移至含液体培养基的EcoFAB中图6)
    1. 使用无菌注射器或微量移液器，用无菌水冲洗 EcoFAB 装置的根室三次，然后用目标生长培养基（例如 0.5 MS 培养基）填充根室图6B，步骤 5.1.6）。
    2. 小心地将一株幼苗插入 EcoFAB 装置的植物储液室中（图6C).
      注意：根部应完全浸没在根室内部，茎部则伸出储液室。
    3. 向容器中加入 3 mL 无菌水，避免接触 EcoFAB 装置。这将增加湿度，并减少根室中培养基的蒸发。
    4. 关闭容器，并用微孔胶带密封盖子（图6D).
    5. 将EcoFAB放入植物培养箱中，或在适合相应植物生长的可控温度环境中使用EcoFAB光照系统（步骤4）。本研究中，将培养室温度设定为24 °C。
    6. 定期检查EcoFAB，为根系生长室补充培养基，并向容器中添加水。所有步骤均须在无菌条件下进行。
      注意：在植物生长早期阶段，每5至7天需补充一次根系生长室内的溶液；在生长后期阶段，每2至3天需补充一次。如需收集根系分泌物，可使用注射器或移液器将根系生长室中的分泌物溶液收集至微量离心管中，并储存于-80 °C超低温冰箱中；同时可使用凝胶成像系统或显微镜对根系形态进行成像观察。
  3. 将幼苗转移至含固体基质的EcoFAB装置中
    1. 如果使用一套定制夹具将根室固定到显微镜载玻片上，请采用由弹性体基质与固化剂按5:1比例配制而成的根室图3K, 图4）；或选择由30:1基础剂与固化剂混合制成的PDMS层，用于将PDMS层直接粘附到载玻片上（如步骤2.2所述）。
    2. 按照步骤3所述对EcoFAB腔室进行灭菌。
    3. 小心地将灭菌的土壤/沙子加入根室，将PDMS层翻转朝下，然后向根室中添加基质。避免任何颗粒物落入将与显微镜载玻片接触的区域，因为这会降低粘附性。
    4. 将显微镜载玻片置于PDMS层上方，并用力按压所有边缘。小心翻转EcoFAB装置，确保土壤/沙子不会从储液口掉落。
      注意：对于由5:1基础剂与固化剂混合物制成的EcoFAB装置，需使用定制夹具来固定密封。
    5. 通过 EcoFAB 装置的入口或出口通道灌注流动的液体培养基或水，并按照步骤 3.3 所述，将幼苗转移至其植物储液区。
  4. 将微生物加入EcoFABs
    1. 将微生物菌落转移至含有8 mL LB液体培养基的培养管中，培养至OD值达到0.5（约12小时）。
    2. 将培养液转移至15 mL离心管中，在室温下以3000 × g离心5分钟，使微生物沉淀。
    3. 移去上清液，加入8 mL用于目标EcoFAB的植物生长培养基。重悬微生物沉淀，于室温下以3000 × g离心5分钟。
    4. 重复步骤 5.4.3 两次，以彻底去除任何 LB 营养物质残留。
    5. 将植物生长培养基加入已洗涤的微生物沉淀中，直至其在600 nm处的光密度约为0.5。
    6. 通过 EcoFAB 出口向根室中加入 20 µL 微生物溶液。本研究中使用的菌株在 2–3 天内迁移至植物根部，并开始定植于根系表面。
    7. 对于经基因改造的化学发光植物，务必在植物生长培养基中加入诱导剂（1 mM IPTG），以诱导荧光素酶的表达。

6. EcoFABs 中根系分泌物的代谢物分析

  1. 基于液相色谱-质谱的代谢组学分析样品制备
    1. 将从 EcoFABs 收集了根系分泌物的微量离心管放入冷冻干燥机中，开启冷冻干燥机以完全去除管中的水分。
    2. 向每个管中加入 300 µL 液相色谱-质谱级甲醇，并超声处理 30 分钟。
      注意：使用甲醇时需佩戴个人防护装备。
    3. 将离心管放入离心机中，在 3000 x g 条件下离心 5 分钟。
    4. 将上清液转移至新的微量离心管中，并在真空浓缩仪中蒸发甲醇。
    5. 向每个管中加入含 1 mM 液相色谱-质谱内标物的 150 µL 甲醇，并将管置于 4 °C 冰箱中孵育 12 小时。
    6. 在 3000 x g 条件下离心 5 分钟，然后将上清液转移至 0.22 µm 滤膜离心管中。
    7. 离心滤膜管，将滤过溶液转移至含有 200 µL 插件的 2.0 mL 液相色谱-质谱样品瓶中。
    8. 将样品瓶放入液相色谱-质谱进样架中，并将进样架装入液相色谱-质谱自动进样器。
  2. 数据分析
    1. 获取 Metabolite Atlas 和自定义 Python 脚本26 的使用权限，或使用其他数据分析软件。
    2. 基于质荷比（m/z）值、保留时间和化合物碎片模式，利用代谢物标准品数据库鉴定代谢物。27

7. 在EcoFAB中对植物根系进行质谱成像（图7）

注意：使用由5:1的弹性体基质与固化剂混合物制成并配有定制夹具的EcoFAB装置（图7A）进行根部印迹至纳米结构引发剂质谱（NIMS）芯片的操作28,29,30，因为PDMS层可逆地结合到NIMS芯片表面。

  1. 用紫外光照射 NIMS 芯片表面 1 小时以进行灭菌。
  2. 从培养箱中取出一株正在生长的植物的EcoFAB，放入无菌操作台中。
  3. 打开EcoFAB容器，取下夹具的顶板。
  4. 将带有植物的PDMS层轻轻抬起，并小心地将带有植物的PDMS层贴附到NIMS芯片上（图7B，D，E).
    注意：一旦根部接触到NIMS芯片表面，便不应再移动，以防止 "涂布" 根部代谢物
  5. 通过PDMS层轻轻按压根部，直至根部完全接触NIMS表面。将根部置于NIMS表面静置20分钟。
  6. 将包含植物的PDMS层从NIMS芯片上取下，再次注意避免根部在NIMS表面移动。如需，将植物重新放回夹具中。
  7. 将NIMS芯片固定在定制的MALDI靶板上，并将靶板装入MALDI质谱仪中进行质谱成像（图7C).
  8. 使用 OpenMSI 程序生成根部代谢物的 NIMS 图像（图7D- G)31.

结果

每个EcoFAB系统包括一个EcoFAB装置和一个用于种植植物的透明塑料容器。一个标准EcoFAB装置包含植物储液区、根系生长室、一个1.6 mm的进液口和一个1.6 mm的出液口。图 2D & 图3H）或用于宽出口EcoFAB装置的10 mm出口（图 2F & 图3I）。植物储液槽设计为梯形，顶部开口宽6 mm，底部开口宽3 mm，该设计可减少液体注入过程中发生泄漏的风险，同时确保植物生长所需的空间。根部生长室采用椭圆形设计，深度为2 mm，可适配多种模式植物的根系结构，如图所示 图2C 和 E标准EcoFAB装置的进液口和出液口均可连接PTFE管，使营养液可在不打开EcoFAB容器的情况下流入根系生长室。宽出口EcoFAB装置显著降低了出口流动阻力，在培养具有粗壮根系的植物或在植物形成复杂根系后需定期收集根系分泌物时，优先选用该装置。

用于制备EcoFAB装置PDMS层的铸造模具在设计软件中完成设计后，使用刚性不透明光敏聚合物进行3D打印，如图2和图3所示。可通过长工作距离显微镜直接观察EcoFAB装置内的植物，从而确保无菌生长环境（图8A，补充文件 1）。带有植物的EcoFAB装置也可适配于高分辨率显微镜载物台，从而实现对植物-微生物相互作用的高分辨率成像（图8B，补充文件 2）。该环境无法维持无菌状态，因此高分辨率成像仅适用于终点测量。

EcoFABs 旨在支持对植物在其整个生命周期不同生长阶段的形态、代谢及微生物群落进行系统性研究。本文探讨了 EcoFABs 作为研究多种植物物种的通用平台的应用。 图8C- 显示7天大 拟南芥，二穗短柄草，以及 Panicum virgatum 在EcoFAB中生长。三种植物均被发现可在EcoFAB中良好生长超过一个月。双子叶植物 拟南芥 单子叶植物， 二穗短柄草 在EcoFABs中被发现能够存活至其繁殖阶段。

可逆密封系统允许使用固体基底（例如，土壤）装入EcoFABs的根系生长室（步骤2.2）。这种可逆密封方法不仅能够将固体基质装入根系生长室，还可实现从根际特定区域采集样品。 图8F- H 显示一组14天大的 二穗短柄草 在水培介质中生长，以及在添加了水培介质的沙子（沙）和土壤（土壤）中生长。根系生长室中薄而致密的基质层允许光线穿透，便于对根系进行显微成像。

根系形态被定义为植物根系的空间构型与分布，已被证实是响应不同生长环境（如养分或水分可利用性）的重要生理反应32,33,34EcoFABs 提供了一种便捷的方法，用于研究植物在不同时间点或不同营养条件下的形态特征。 图9A-F 展示利用EcoFABs追踪植物根系形态的示例 二穗短柄草 在前三周。A 二穗短柄草（Brachypodium distachyon） 将幼苗转移至EcoFAB装置中，并利用BIO-RAD凝胶成像仪内的相机记录其根系结构。可进一步应用图像处理程序（如Image J、python和matlab）对不同时间点或不同培养基环境下的根系形态变化进行定量分析。为期三周的总根面积定量结果显示，在早期阶段呈逐渐增加趋势<1周）后呈线性增长趋势，持续至3周结束，如图所示 图9G.

构建EcoFAB的一个主要动机是研究植物-微生物相互作用。如步骤5.4所述，微生物通过EcoFAB装置的入口通道被转移至根系生长室。 图10 显示，一个含有 EcoFAB 的 假单胞菌 Simea （原名为，荧光假单胞菌) WCS417（WCS417），一种带有化学发光标记的促植物生长根际细菌，以10的浓度加入植物根系中6 每株植物的细胞数。使用凝胶成像仪检测到WCS417信号，表明WCS417微生物在根部生长室中具有明显的空间分布特征。无论是在含砂固体基质的MS液体培养基中，还是不含砂固体基质的MS液体培养基中，WCS417微生物均定植于整个根系表面，且微生物在根尖区域周围较为集中，这可能与根尖活跃的营养物质分泌有关。图10G&H)35另一方面，WCS417 微生物在土壤基质中聚集于植物储水区域周围，而非根尖部位。图10I）。由于微生物通过出口通道加入，它们也能在土壤基质中移动，但并未在根部积累，这一点在含沙或不含沙的液体培养基中均未观察到。这可能表明土壤本身已提供了充足的营养，微生物因而迁移至植物储层以获得最佳的呼吸条件。

为研究植物根系分泌物的代谢物谱型以及植物-微生物互作过程中的代谢物吸收与释放，通过EcoFAB装置在植物不同生长阶段收集根部生长室中的分泌液。如步骤6所述，随后对分泌液样品进行提取，并用于LC-MS分析。利用该方法，已检测到一系列由植物分泌并被微生物消耗的代谢物，目前正进一步研究在有无微生物定殖条件下根系分泌物的相关代谢物谱型。

EcoFAB 的萌发装置示意图、植物转移、微生物添加及根系生长监测。
图1：EcoFAB 工作流程。 植物在培养皿中萌发后，转移至灭菌的 EcoFAB 中，可添加微生物。非破坏性取样：可采集并成像根系分泌物，同时可视化观察根系形态；破坏性取样则可用于深入分析微生物、根系和地上部分的各项参数。

带有尺寸和组装细节的盒子组件工程设计图
图 2：用于 EcoFAB 装置制造的 3D 打印模具组件。 （A）浇铸框的俯视图和倾斜视图。（B）嵌件的俯视图和倾斜视图。（C）标准模具底座的俯视图和倾斜视图。（E）宽出口模具底座的俯视图和倾斜视图。（D，F）分别为用于制造标准型和宽出口型 EcoFAB 装置的组装模具。椭圆形尺寸分别为小型 EcoFAB 模具 51 mm × 34 mm，大型 EcoFAB 模具 76 mm × 62 mm。请点击此处查看此图的放大版本。

微流控装置制备流程，包括模具组装、浇铸、固化和脱模步骤。
图3：EcoFAB装置的制备。 （A）将弹性体基质与固化剂的混合物倒入模具中。（B）在85 °C下加热含混合物的模具4小时。（C）从模具中取出插入件。（D）将PDMS从浇铸框中分离。（E）将模具基底从浇铸框中推出。（F）使用刀具沿边缘将PDMS从模具上剥离。（G）缓慢地将PDMS层从模具基底上剥离下来。（H）在标准PDMS层的进样和出样通道处打孔。（I）在宽出口PDMS层的进样通道处打孔。（J）将PDMS层（由15:1的弹性体基质与固化剂混合而成）和显微镜载玻片清洗后转移至等离子清洗仪中进行键合。（K）使用夹具将PDMS层（由5:1的弹性体基质与固化剂混合而成）固定在显微镜载玻片上。（L）将PDMS层（由30:1的弹性体基质与固化剂混合而成）直接压附在显微镜载玻片上。请点击此处查看该图的放大版本。

带有尺寸规格的模具设计图，顶视图和等轴测视图（A，B，C）
图4：定制夹具的设计。 （A）上夹板的顶视图和倾斜视图。（B）下夹板的顶视图和倾斜视图。（C）装配完成的夹具的顶视图和倾斜视图，包含四组六角头螺钉。 请点击此处查看该图的放大版本。

LED 立方体组件示意图及尺寸；光照装置；24V 电源连接图；照明实验
图 5：安装 LED 植物生长灯。 (A) 在 EcoFAB 容器周围以螺旋方式标出 9 个 LED 固定夹的安装位置。(B) LED 固定夹已安装在 EcoFAB 容器上。(C) 将 LED 灯带穿过这些固定夹。(D) 将 LED 灯带连接至配备 24V 电源的控制器。(E) 控制器的线路连接示意图。请点击此处查看该图的放大版本。

种子在琼脂上萌发实验，注射器装置，幼苗转移，容器密封。
图6：将幼苗转移至EcoFAB装置中。 （A）在0.5 MS培养基平板上培养2天的Brachypodium distachyon植株。（B）向根室中加入植物生长培养基。（C）使用镊子小心地将根插入植物储液室中。（D）向容器底部加入3 mL水后，用微孔胶带密封EcoFAB容器。请点击此处查看该图的放大版本。

微流控装置中的植物生长；质谱分析。显示 m/z 数据的示意图。
图 7：EcoFAB 中植物根部的 NIMS 成像。 （A）在无菌 EcoFAB 中生长的 Brachypodium distachyon。 （B）将带有植物的 PDMS 层固定到 NIMS 芯片上，持续 20 分钟。 （C）使用铜胶带将 NIMS 芯片固定至定制的 MALDI 载样板，并将其装入 MALDI 质谱仪。 （D–G）分别使用一株 7 天龄和一株 20 天龄的 Brachypodium distachyon 植物进行 NIMS 成像（D, E），及其对应的 NIMS 图像（F, G）。主要离子以红色、绿色和蓝色突出显示。 请点击此处查看该图的高清版本。

植物生长实验；玉米水培装置；种子萌发阶段；根系发育。
图 8：EcoFAB 的通用应用。 （A）使用长工作距离显微镜装置，在 EcoFAB 中直接捕获二穗短柄草（Brachypodium distachyon）的根系生长过程。（B）利用高分辨率显微镜装置直接观察根-微生物相互作用。（C-E）分别在 0.5 MS 水培培养基中培养 7 天的拟南芥（Arabidopsis thaliana）（C）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）（D）和柳枝稷（Panicum virgatum）（E）。（F-H）在不同基质中供给 0.5 MS 培养基和水培养 14 天的二穗短柄草（Brachypodium distachyon）：水培（F）、沙基质（G）和土壤基质（H）。请点击此处查看该图的放大版本。

短柄草根系生长阶段（A-F）及面积增长图（G），比例尺为1 cm，显示年龄效应。
图9：利用EcoFAB装置研究根系形态学。（A-F）在装有0.5 MS培养基的EcoFAB装置中培养的Brachypodium distachyon在前三周内的根系发育情况：（A）生长2天，（B）4天，（C）7天，（D）11天，（E）14天，（F）21天。（G）通过ImageJ软件估算的平均根表面积。请点击此处查看该图的放大版本。

水浴中种子萌发过程示意图及根系发育的显微镜分析。
图10：利用EcoFAB研究根际-微生物相互作用。 （A, B, C）15天龄的Brachypodium distachyon在不同培养基中与Pseudomonas fluorescens WCS417共培养，培养基形式包括MS液体溶液、沙质基质和土壤基质。（D, E, F）其根系的明场显微图像。（G, H, I）共培养14天后相应根系的化学发光图像。请点击此处查看该图的放大版本。

补充文件1. 使用EcoFAB捕获根系生长过程。 请点击此处下载该文件。

补充文件 2. 利用 EcoFAB 捕获根系-微生物相互作用。 请点击此处下载该文件。

讨论

本文报道的利用生态系统构建技术创建EcoFAB的方案，为在高度受控的实验室条件下开展系统性植物生物学研究提供了公共资源。3D打印技术的进步为构建和迭代优化EcoFAB设计提供了广泛可及的技术手段。本文所展示的根室结构非常适合成像显微镜观察并维持无菌状态，从而可精确添加微生物以研究植物-微生物相互作用。EcoFAB平台适用于多种植物物种。需要注意的是，植物在狭窄根室中生长可能产生特定的生理效应，因此需要进一步实验，才能将研究结果推广至自然环境中生长的植物。

使用无菌培养室和LED生长灯，可平行研究不同光照条件（包括波长、强度和持续时间）对植物生长及相关生理参数的影响。可逆封接的根室允许使用固体基质，并可对固体样品进行空间定位采集，用于生化和遗传分析。使用土壤、沙子和石英珠等固体基质，使EcoFAB系统可用于构建更具生态相关性的实验室生态系统。然而，本文介绍的所有系统均采用饱和液体环境（水培培养），并不能准确反映大多数土壤的真实状况，因此有必要进一步优化这些设计，以在基质中保留空气孔隙，使其更接近自然土壤条件。

本文描述了如何利用普通相机和显微镜对根系形态发育从整体到细胞水平进行成像。该方法适用于根系形态的监测、成像与量化分析，有望有助于理解植物基因型对生长条件适应所触发的生理与分子信号调控机制。然而，研究根系生理发育的一个局限在于目前EcoFAB装置为水平放置。在自然环境中，根系的向重力性反应导致根系主要呈垂直方向生长。因此，本文所展示的水平系统在某些方面可能与自然环境存在差异，未来EcoFAB装置的理想改进方向是实现根室的垂直放置。尽管当前的EcoFAB装置为水平放置，仍可在不同条件下或在微生物作用下对根系形态参数进行分析。通过高分辨率成像，可捕捉单一菌株或微生物群落的根系定殖动态，揭示在营养充足或缺乏条件下植物不同部位的定殖情况。预计此类研究将为植物微生物组的组装机制及其随时间的变化规律（例如随着根系发育）提供重要的新见解。

微流控设备能够对非常幼小的植物进行成像，但通常收集到的代谢物量不足以用于液相色谱-质谱（LCMS）分析。基于土壤的系统（如根际观察装置，rhizotrons）可在植物转入化学发光构建体（Glo-root）或采用基于核磁共振（NMR）的方法时，实现对根系形态的成像33,34。然而，由于样品体积较大，从这些系统中提取代谢物的过程十分耗时。EcoFABs 结合了上述两种系统的优点：其制造方式类似于微流控设备，设计上力求简单且成本低廉，易于复制；同时，其腔室尺寸可调，可用于培养具有较小或较大根系的植物，直至其进入生殖阶段。该系统可同时观察根系形态变化与根系分泌物的动态过程，并且具备无菌环境，便于精确添加特定微生物。

EcoFABs 旨在实现对微生物和代谢物的受控引入与取样。具体而言，从根系生长室收集的样品足以用于质谱代谢物分析。质谱成像技术的整合（例如., 本文介绍的NIMS技术为研究根系代谢物的空间分布提供了一种非破坏性方法。该技术在未来稳定同位素示踪实验以及微生物在特定代谢物上定位的成像研究中具有潜在应用价值。36尽管本实验方案主要针对单一分离菌株，但相同的设计也可用于更复杂的微生物群落研究。EcoFABs 中的样品体积和生物量很可能已充分满足与DNA测序技术进一步整合的需求，这对于表征和监测微生物群落结构及基因表达具有重要意义。

综上所述，本实验方案详细描述了用于研究植物-微生物相互作用的实验室生态系统（EcoFAB）的构建方法，重点在于提供简单且易于获取的技术，便于全球研究人员快速实施和拓展。目前的研究工作旨在验证不同实验室之间的可重复性，并集成温度控制系统，使每个EcoFAB装置能够独立调控光照和温度。该系统的进一步改进将包括实现EcoFAB根室的自动取样与补充液体，以及建立在EcoFAB内构建相关植物微生物组的可重复性实验方案。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由劳伦斯伯克利国家实验室的实验室主导研究与开发（LDRD）项目资助，该项目由美国能源部科学办公室根据合同号 DE-AC02-05CH11231 提供支持，同时获得美国能源部科学办公室授予加州大学伯克利分校的奖项 DE-SC0014079 资助。分子铸造厂（Molecular Foundry）的工作也得到美国能源部合同号 DE-AC02-05CH11231 的支持。我们还感谢劳伦斯伯克利国家实验室的 Suzanne M. Kosina、Katherine Louie、Benjamin P. Bowen 和 Benjamin J. Cole 提供的全部帮助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3D打印定制模具LBNLSTL文件可在此处获取：www.eco-fab.org；本文所述EcoFAB模具由FATHOM打印：http://studiofathom.com
道康宁Sylgard 184透明硅橡胶套件艾尔思沃斯粘合剂公司184 SIL ELAST KIT 0.5KG
空气除尘喷雾剂VWR75780-350任何压缩气体除尘剂均可使用
15号钝头针VWR89166-240
5 mL带鲁尔锁扣接头的注射器VWRBD309646
3”x2”显微镜玻璃载片VWR48382-179
1.75" x 2.56" x 3.56" EcoFAB盒亚马逊B005GAQ25Q
4” x 3 ¼”显微镜玻璃载片Ted Pella260231
4.87" x 4.87" x 5.50" EcoFAB盒亚马逊B00P9QVOS2
等离子清洗机Harrick PlasmaPDC-001
3D打印定制夹具LBNLSTL文件可从Trent Northen实验室获取
无菌操作台AirClean SystemsAC600系列PCR工作站
聚四氟乙烯注射器管路Sigma-AldrichZ117315-1EA
乙醇VWR89125-172
漂白剂
Murashige和Skoog（MS）大量营养盐基础Phytotechnologies LaboratoriesM502
Murashige和Skoog（MS）微量营养盐基础Phytotechnologies LaboratoriesM554
土壤Hummert InternationalPro-Mix PGX
PhytagelSigma-Aldrich71010-52-1
Arabidopsis thalianaLehle SeedsWT-24 Col-4哥伦比亚野生型
Brachypodium distachyonLBNL标准Bd-21品系可从John Vogel实验室获取
Panicum virgatum塞缪尔·罗伯茨·诺布尔基金会阿拉莫柳枝稷
微孔胶带VWR56222-182
液相色谱-质谱级甲醇VWRJT9830-3
冷冻干燥机LABCONCOFreeZone 2.5 Plus
SpeedVAC浓缩仪Thermo ScientificSavant™ SPD111 SpeedVac
Ultrafree-MC GV离心滤膜-0.22 µmMilliporeUFC30GV00
液相色谱系统AgilentAgilent 1290 LC系统
Q Exactive质谱仪Thermo ScientificQ Exactive™混合四极杆-轨道阱质谱仪
NIMS芯片和定制MALDI靶板LBNL详细实验方案请参见：doi:10.1038/nprot.2008.110
MALDI质谱仪AB SciexTOF/TOF 5800 MALDI质谱仪
纳米涂层LED植物生长灯条LED World LightingHH-SRB60F010-2835
电源LED World LightingMD45W24VA, LV100-24N-UNV-J
TC420控制器亚马逊B0197U7R8Q
硅胶LED固定夹亚马逊B00N9X1GI0
热熔胶枪亚马逊B006IY359K
母头至裸线LED连接电缆LED World LightingHH-F05
母头至母头LED延长连接电缆LED World LightingHH-MF1
20AWG双芯电缆LED World Lighting6102051TFT4
WAGO 221-415拼接连接器LED World Lighting221-415

参考文献

  1. Morrissey, J. P., Dow, J. M., Mark, G. L., O'Gara, F. Are microbes at the root of a solution to world food production. EMBO Rep. 5 (10), 922-926 (2004).
  2. Farrar, K., Bryant, D., Cope-Selby, N. Understanding and engineering beneficial plant-microbe interactions: plant growth promotion in energy crops. Plant Biotechnol J. 12 (9), 1193-1206 (2014).
  3. Singh, J. S., Abhilash, P. C., Gupta, V. K. Agriculturally Important Microbes in Sustainable Food Production. Trends Biotechnol. 34 (10), 773-775 (2016).
  4. Dubey, R. K., Tripathi, V., Dubey, P. K., Singh, H. B., Abhilash, P. C. Exploring rhizospheric interactions for agricultural sustainability: the need of integrative research on multi-trophic interactions. J Clean Prod. 115, 362-365 (2016).
  5. Hunter, P. Plant microbiomes and sustainable agriculture. EMBO Rep. 17 (12), 1696-1699 (2016).
  6. van der Heijden, M. G. A., Hartmann, M. Networking in the Plant Microbiome. PLoS Biol. 14 (2), e1002378(2016).
  7. Vessey, J. K. Plant growth promoting rhizobacteria as biofertilizers. Plant Soil. 255 (2), 571-586 (2003).
  8. Yang, J., Kloepper, J. W., Ryu, C. -M. Rhizosphere bacteria help plants tolerate abiotic stress. Trends Plant Sci. 14 (1), 1-4 (2009).
  9. Reynolds, H. L., Packer, A., Bever, J. D., Clay, K. GRASSROOTS ECOLOGY: PLANT-MICROBE-SOIL INTERACTIONS AS DRIVERS OF PLANT COMMUNITY STRUCTURE AND DYNAMICS. Ecology. 84 (9), 2281-2291 (2003).
  10. Finkel, O. M., Castrillo, G., Herrera Paredes, S., Salas González, I., Dangl, J. L. Understanding and exploiting plant beneficial microbes. Curr Opin Plant Biol. 38, 155-163 (2017).
  11. Northen, T. R., Zhang, Z., Gao, J., Swenson, T., Yoshikuni, Y. Advancing Our Understanding of the Chemistry of Soil Microbiomes. National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. 2017. The Chemistry of Microbiomes: Proceedings of a Seminar Series. , The National Academies Press. Washington, DC. (2017).
  12. Busby, P. E., et al. Research priorities for harnessing plant microbiomes in sustainable agriculture. PLOS Biology. 15 (3), e2001793(2017).
  13. Sanati Nezhad, A. Microfluidic platforms for plant cells studies. Lab Chip. 14 (17), 3262-3274 (2014).
  14. Oburger, E., et al. Evaluation of a novel tool for sampling root exudates from soil-grown plants compared to conventional techniques. Environ Exp Bot. 87, 235-247 (2013).
  15. Van Der Krift, T. A. J., Berendse, F. Root life spans of four grass species from habitats differing in nutrient availability. Funct Ecol. 16 (2), 198-203 (2002).
  16. Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. P Natl. Acad. Sci. USA. 114 (17), 4549-4554 (2017).
  17. Sanati Nezhad, A., Naghavi, M., Packirisamy, M., Bhat, R., Geitmann, A. Quantification of cellular penetrative forces using lab-on-a-chip technology and finite element modeling. P Natl. Acad. Sci. USA. 110 (20), 8093-8098 (2013).
  18. Jiang, H., Xu, Z., Aluru, M. R., Dong, L. Plant chip for high-throughput phenotyping of Arabidopsis. Lab Chip. 14 (7), 1281-1293 (2014).
  19. Parashar, A., Pandey, S. Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis. Appl. Phys. Lett. 98 (26), 263703(2011).
  20. Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nat Methods. 9 (11), 1101-1106 (2012).
  21. Grossmann, G., et al. The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science. Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).
  22. Aufrecht, J. A., Ryan, J. M., Hasim, S., Allison, D. P., Nebenführ, A., Doktycz, M. J., Retterer, S. T. Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform. J. Vis. Exp. (126), (2017).
  23. Garvin, D. F., et al. Development of Genetic and Genomic Research Resources for Brachypodium distachyon, a New Model System for Grass Crop Research. Crop Sci. 48 (Supplement_1), S69-S84 (2008).
  24. Lisensky, G. C., et al. Replication and Compression of Surface Structures with Polydimethylsiloxane Elastomer. J. Chem. Educ. 76 (4), 537(1999).
  25. Friend, J., Yeo, L. Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane. Biomicrofluidics. 4 (2), 026502(2010).
  26. Yao, Y., et al. Analysis of Metabolomics Datasets with High-Performance Computing and Metabolite Atlases. Metabolites. 5 (3), 431-442 (2015).
  27. Sumner, L. W., et al. Proposed minimum reporting standards for chemical analysis Chemical Analysis Working Group (CAWG) Metabolomics Standards Initiative (MSI). Metabolomics. 3 (3), 211-221 (2007).
  28. Gao, J., de Raad, M., Bowen, B. P., Zuckermann, R. N., Northen, T. R. Application of Black Silicon for Nanostructure-Initiator Mass Spectrometry. Anal. Chem. 88 (3), 1625-1630 (2016).
  29. Gao, J., et al. Morphology-Driven Control of Metabolite Selectivity Using Nanostructure-Initiator Mass Spectrometry. Anal. Chem. 89 (12), 6521-6526 (2017).
  30. Woo, H. -K., Northen, T. R., Yanes, O., Siuzdak, G. Nanostructure-initiator mass spectrometry: a protocol for preparing and applying NIMS surfaces for high-sensitivity mass analysis. Nat. Protoc. 3 (8), 1341-1349 (2008).
  31. Rübel, O., et al. OpenMSI: A High-Performance Web-Based Platform for Mass Spectrometry Imaging. Anal. Chem. 85 (21), 10354-10361 (2013).
  32. López-Bucio, J., Cruz-Ramı́rez, A., Herrera-Estrella, L. The role of nutrient availability in regulating root architecture. Curr Opin Plant Biol. 6 (3), 280-287 (2003).
  33. Lynch, J. P. Steep, cheap and deep: an ideotype to optimize water and N acquisition by maize root systems. Ann. Bot. 112 (2), 347-357 (2013).
  34. Rellán-Álvarez, R., et al. GLO-Roots: an imaging platform enabling multidimensional characterization of soil-grown root systems. eLife. 4, e07597(2015).
  35. Kamilova, F., Validov, S., Azarova, T., Mulders, I., Lugtenberg, B. Enrichment for enhanced competitive plant root tip colonizers selects for a new class of biocontrol bacteria. Environ. Microbiol. 7 (11), 1809-1817 (2005).
  36. Klitgaard, A., Nielsen, J. B., Frandsen, R. J. N., Andersen, M. R., Nielsen, K. F. Combining Stable Isotope Labeling and Molecular Networking for Biosynthetic Pathway Characterization. Anal. Chem. 87 (13), 6520-6526 (2015).

重印与许可

标签

3D打印技术PDMS层形成等离子体灭菌法根室成像受控环境条件微生物组组成分析植物生长监测代谢物谱型分析方法
用于研究植物-微生物互作的实验室生态系统构建（EcoFAB）协议
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。