Analyser av mitokondrie kalsium tilstrømning av isolerte mitokondrier og kultivert celler

Summary

Her presenterer vi to protokoller for måling av mitokondrie Ca^{2 +} tilstrømningen i isolerte mitokondrier og kultivert celler. For isolert mitokondriene, detalj vi en plate leser-baserte Ca^{2 +} import analysen ved hjelp av Ca^{2 +} følsom fargestoff kalsium grønn-5N. For kulturperler celler beskriver vi en AC confocal mikroskopi-metode som bruker Ca^{2 +} fargestoff Rhod-2/AM.

Abstract

Ca^{2 +} av mitokondrier er en viktig funksjon regulere både fysiologiske og patofysiologiske prosesser i et bredt spekter av celler. Muligheten til å måle nøyaktig tilstrømningen og middelklasseinnbyggere av Ca^{2 +} fra mitokondrier er viktig for å bestemme rollen mitokondrie Ca^{2 +} håndtering i disse prosessene. I denne rapporten presenterer vi to metoder for måling av mitokondrie Ca^{2 +} håndtering både isolert mitokondrier og kultivert celler. Vi først detalj en plate leser-basert plattform for å måle mitokondrie Ca^{2 +} opptak ved hjelp av Ca^{2 +} følsom fargestoff kalsium grønn-5N. Plate leser-basert format omgår behovet for spesialisert utstyr, og kalsium grønn-5N fargestoff er ideell for å måle Ca^{2 +} fra isolert vev mitokondrier. For vårt program beskriver vi måling av mitokondrie Ca^{2 +} opptak i mitokondrier isolert fra mus hjertet vev; denne fremgangsmåten kan imidlertid brukes til å måle mitokondrie Ca^{2 +} opptak i mitokondrier isolert fra andre vev som leveren, skjelettlidelser muskel og hjernen. For det andre, beskriver vi en AC confocal mikroskopi-baserte analysen for måling av mitokondrie Ca^{2 +} i permeabilized celler ved hjelp av Ca^{2 +} følsom fargestoff Rhod-2/AM og imaging bruker 2-dimensjonal laser-skanning mikroskopi. Denne permeabilization protokollen eliminerer cytosolic fargestoff forurensning, slik at bestemte opptak av endringer i mitokondrie Ca^{2 +}. Videre gir laser-skanning mikroskopi høy bildefrekvens å fange raske endringer i mitokondrie Ca^{2 +} ulike rusmidler eller reagenser brukes i eksterne løsningen. Denne protokollen kan brukes for å måle mitokondrie Ca^{2 +} opptak i mange celletyper inkludert primær celler som hjerte myocytter og neurons og udødeliggjort linjer.

Introduction

Mitokondrier er kritiske områder intracellulær Ca^{2 +} lagring og signalering. Tiår med forskning har vist at mitokondrier har muligheten til å importere og beslaglegge Ca^{2 + 1,2}. Mitokondrier, er imidlertid ikke bare passiv områder av Ca^{2 +} lagring. Ca^{2 +} i mitokondrie batterirommet utfører grunnleggende signalnettverk funksjoner inkludert regulering av metabolske og aktivering av mitokondrie-mediert celle død, som har vært vurdert tidligere³. Metabolsk regulering øker Ca^{2 +} aktiviteten av tre matrix-lokalisert dehydrogenases tricarboxylic syre syklus samt åndedretts kjeden komplekser, øke mitokondrie energi produksjon^4,5 . Mitokondrielt Ca^{2 +} overbelastning og dysregulated mitokondrie Ca^{2 +} håndtering, Ca^{2 +} utløsere mitokondrie permeabilitet overgangen pore (MPTP) åpning, fører til mitokondrie indre membran permeabilization, membran potensielle tap, mitokondrie dysfunksjon, hevelse, brudd og til slutt cellen død^6,7,8,9. Dermed påvirker mitokondrie Ca^{2 +} signalering direkte både mobilnettet liv og død stier gjennom metabolske kontroll og MPTP-død akse.

De siste årene, det har blitt raskt voksende interesse for studiet av mitokondrie Ca^{2 +} dynamikken grunn i stor del til identifisering av molekylære bestanddeler av mitokondrie Ca^{2 +} uniporter komplekse, en mitokondrie indre membran transporter som en primære modus for Ca^{2 +} importere i mitokondrie matrix ^10,11,12. Identifikasjon av disse strukturelle og regulatoriske underenheter av uniporter har frembragt muligheten for målretting genetisk mitokondrie Ca^{2 +} tilstrømningen å modulere mitokondrie funksjon og dysfunksjon og tilrettelagt studiet av den bidrag av uniporter komplekse og mitokondrie Ca^{2 +} tilstrømningen til sykdom^13,14,15. Faktisk har mitokondrie Ca^{2 +} signalering vært innblandet i patologi av et variert utvalg av sykdommer, fra hjerte sykdom til neurodegeneration og kreft^{16,17,18, 19,20}.

Gitt den grunnleggende betydningen av mitokondrie Ca^{2 +} signalering i stoffskiftet og celledød, og kombinert med den store rekkevidden biologiske systemer påvirker som mitokondrie Ca^{2 +} signalering, metoder for å vurdere mitokondrie Ca^{2 +} strøm er av stor interesse. Ikke overraskende, en rekke teknikker og verktøy til å måle mitokondrie Ca^{2 +} er utviklet. Disse omfatter metoder som bruker verktøy som fluorescerende Ca^{2 +}-sensitive fargestoffer^21,22 og genetisk kodet Ca^{2 +} sensorer rettet mot mitochondria, som cameleon og aequorin^{23, 24}. Målet med denne artikkelen er å markere ulike metoder og modellere systemer der mitokondrie Ca^{2 +} opptak kan måles. Vi presenterer to eksperimentelle metoder for å vurdere mitokondrie Ca^{2 +} tilstrømningen kapasitet. Bruke cardiac mitokondrier som et eksempel, detalj vi en plate leser-basert plattform for å måle mitokondrie Ca^{2 +} opptak ved hjelp av Ca^{2 +} følsom fargestoff kalsium grønn-5N som er ideell for isolert vev mitokondrier¹⁴ . Bruke kulturperler NIH 3T3 celler, beskrive vi også en AC confocal mikroskopi imaging-baserte analysen for måling av mitokondrie Ca^{2 +} i permeabilized celler ved hjelp av Ca^{2 +} følsom fargestoff Rhod-2/AM²⁵.

Protocol

Alle metodene som er beskrevet i denne protokollen er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen av Emory University. Merk: Den første delen er den eksperimentelle prosedyren for å måle mitokondrie Ca2 + tilstrømning av isolerte cardiac mitokondrier likner en plate. 1. reagenser og løsninger Gjøre 500 mL MS-EGTA buffer for mitokondrie isolasjon: 225 mM mannitol, 75 mM sakkarose, 5 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfo…

Representative Results

Figur 1 viser mitokondrie Ca2 + opptak målinger i isolerte cardiac mitokondrier bruker plate leser-baserte plattformen og Ca2 + farge kalsium grønn-5N. Under kontroll forhold (figur 1A), hjertestans mitokondrier ble suspendert i KCl buffer inneholder kalsium grønn-5N og deretter utfordret med sekvensiell pulser av CaCl2 (5 μL en 0.6 mM CaCl2 løsning) lagt på 30 s, 150 s, 300 s, 48…

Discussion

Her beskriver vi to ulike tilnærminger for å måle mitokondrie Ca^{2 +} tilstrømningen. Plate leser-baserte kalsium grønn-5N metoden skjermer extramitochondrial Ca^{2 +} nivåer og er en Ca^{2 +} opptaksanalyse som er godt egnet for målinger i isolerte mitokondrier. Mens vi har vist representant resultater fra isolert murine cardiac mitokondrier, kan denne analysen være lett tilpasset mitokondrier isolert fra vev med høy mitokondrie overflod inkludert lever, skjelettlidelser muskel og hjern…

Materials

Olympus FV1000 Laser Scanning confocal microscope	Olympus	FV1000
Synergy Neo2 Multimode microplate reader with injectors	Biotek
Tissue Homogenizer	Kimble	886000-0022
22 x 22 mm coverslips	Corning	2850-22
96 well plate	Corning	3628
6 well plate	Corning	3506
Calcium Green-5N	Invitrogen	C3737
MitoTracker green FM	Invitrogen	M7514
Rhod-2, AM	Invitrogen	R1244
DMSO	Invitrogen	D12345
Pluronic F-127	Invitrogen	P3000MP
D-Mannitol	Sigma	M9546
Sucrose	EMD Millipore	8510
HEPES	Sigma	H3375
EGTA	Sigma	E8145
Potassium chloride	Fisher	BP366-500
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P0662
Magnesium chloride	Sigma	M2670
Sodium pyruvate	Sigma	P2256
L-malic acid	Sigma	M1125
Calcium chloride	Sigma	C4901
Potassium acetate	Fisher	BP364-500
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Phosphocreatine disodium salt	Sigma	P7936
Saponin	Sigma	S7900
Ru360	Calbiochem	557440