从心律失常性心肌病患者心内膜心肌活检样本中分离与鉴定心脏间充质基质细胞

摘要

本文提供了一种从致心律失常性心肌病患者心内膜心肌活检样本中分离心脏间充质基质细胞的方法，并描述了这些细胞的表征及其促进成脂分化的实验方案。

摘要

正常成人心脏由多种不同类型的细胞组成，其中心脏间充质基质细胞是数量丰富的细胞群体。分离这些细胞不仅有助于研究其在心脏疾病中的作用，还可提供一种有用的原代细胞模型，用于探究生物学机制。

本文描述了从致心律失常性心肌病（ACM）患者心内膜活检样本中分离C-MSC的方法。心内膜心肌活检在电-解剖标测所显示的瘢痕邻近的右心室区域进行引导取样。活检组织经胶原酶消化后，接种于含培养基的塑料培养皿中，以促进C-MSC的生长。分离的细胞可在体外培养中连续传代扩增。为确认其间充质细胞表型，文中提供了免疫表型鉴定方法。C-MSC具有向多种细胞类型分化的能力，包括脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞；鉴于ACM患者心脏中存在脂肪细胞沉积的特征，本文还详细描述了C-MSC向脂肪细胞分化的实验方案以及脂滴积累的鉴定方法。

引言

间充质基质细胞（MSC）是一类在多种组织中具有重要支持功能的成体细胞¹。骨髓是MSC的传统来源，但也可从其他多种组织中分离获得，包括胎盘、脂肪组织、脐带血、肝脏和心脏^1,2。

2006年，国际细胞治疗学会（International Society for Cellular Therapy, ISCT）首次明确规定了定义人类MSC的最低标准³。具体而言，MSC必须具有贴附于塑料表面的能力。它们表达特定的表面抗原：对CD44、CD105、CD29和CD90等间充质标记物呈阳性，对CD14、CD45、CD34和CD31等造血及内皮细胞标记物呈阴性，这是MSC的特征。由于不表达HLA-DR，MSC不会引发同种异体免疫反应。此外，MSC具有多向分化潜能，可分化为脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞谱系^1,3。

关注心脏的细胞组成，心脏间充质基质细胞（C-MSC）在正常成人心脏中含量丰富^4,5。它们在心脏的正常生理功能和病理状态下均发挥关键作用。生理条件下，C-MSC提供支持心肌结构和功能完整性的微环境；而在心脏疾病中，它们会因心脏损伤而被激活，参与伤口愈合和纤维化重塑过程^6,7。

最近已证实，C-MSC 参与致心律失常性心肌病（ACM）中的脂肪替代过程⁸特别是，ACM 是一种主要由桥粒基因突变引起的遗传性疾病，导致心肌发生纤维脂肪性替代，主要累及右心室。⁹这种替代从心外膜延伸至心内膜，形成一种无传导性的基质，可引发进行性心力衰竭并加重室性心律失常，在严重情况下可能导致猝死。Sommariva 等 证明了致心律失常性心肌病（ACM）患者心脏组织切片中存在前脂肪细胞的间充质来源。此外，从ACM患者心内膜心肌活检组织中分离出的C-MSC表达桥粒基因，因此可能受到这些基因突变的影响。特别是在脂肪生成条件下，ACM患者的C-MSC比对照组心脏来源的C-MSC积累更多的脂质。这些证据表明，C-MSC不仅在疾病发病机制中发挥积极作用，而且是研究ACM的一种有效细胞模型。

为了促进在此背景下或其他需要进行心内膜心肌活检的心脏疾病中的未来研究，本文提供了一项详细方案，用于从小块心内膜心肌组织中分离心脏间充质干细胞（C-MSC）、扩增这些细胞、进行免疫表型表征以及成脂分化。

方案

该方法符合《赫尔辛基宣言》的要求，且右心室样本的采集已获得"Centro Cardiologico Monzino IRCCS"伦理委员会的批准（2012年6月7日）。

1. 溶液

1. 使用Iscove改良杜尔贝科培养基（IMDM），添加20%胎牛血清（FBS）、10 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、10,000 U/mL青霉素、10,000 µg/mL链霉素和0.02 M L-谷氨酰胺，配制C-MSC培养用的TMES培养基。使用0.22 µm无菌滤器过滤TMES培养基，并于4 °C保存。
2. 配制胶原酶溶液时，将胶原酶NB4混合物溶于IMDM培养基中，得到终浓度为3 mg/mL的溶液。轻轻涡旋以溶解粉末，再使用0.2 µm注射器滤器过滤胶原酶溶液。将溶液以每管1 mL分装至2 mL无菌离心管中，于-20 °C保存，待用时取出。
3. 配制T. ADIPO培养基时，使用IMDM培养基并添加10% FBS、0.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（用二甲基亚砜（DMSO）预稀释至0.5 M浓度，-20 °C保存备用）、1 µM氢化可的松（用DMSO预稀释至100 mM，再用无菌蒸馏水进一步稀释至10 mM，-20 °C保存备用）以及0.1 mM吲哚美辛（用DMSO预稀释至0.5 M浓度，-20 °C保存备用），制成成脂诱导培养基。使用0.22 µm无菌滤器过滤T. ADIPO培养基，并于4 °C保存。
4. 配制洗涤缓冲液，成分为0.0067 M PO₄磷酸盐缓冲液（PBS）、5 mM乙二胺四乙酸（EDTA）和5%牛血清白蛋白，于4 °C保存。
5. 通过将1%油红O（ORO）粉末溶于60%异丙醇中，混匀2小时，并使用0.22 µm滤器过滤以去除沉淀物，配制油红O工作液。工作液于室温（RT）保存。

2. 心脏间充质基质细胞的分离

1. 心脏活检样本的采集与处理
   注意：开始前，请确保已准备好胶原酶溶液和TMES培养基。
   1. 将ACM心内膜心肌活检样本（通常约5 mg组织）放入盛有TMES的无菌管中，并运送至实验室。
      注意：根据既往报道¹⁰，ACM活检样本在电生理手术室中采集。简言之，通过右心室内的电-解剖标测与心腔内超声心动图的整合（见视频1），指导对病变心肌边界区进行心内膜心肌活检（见视频2，X线透视成像）。健康对照（HC）样本由组织生物样本库提供，取自意外死亡的健康供体在死亡后24小时内获取的右心室游离壁组织。在运输过程中以及解剖前，将活检样本保存于4 °C的TMES中。活检采集至组织处理之间的时间应尽量缩短（最长不超过24小时）。
   2. 在生物安全柜中准备好进行操作所需的全部试剂，直至完成酶消化步骤。
   3. 将灭菌器置于通风橱下，使用前15分钟开启仪器，使其温度升至200–250 °C。
   4. 将剪刀和镊子灭菌10秒。确保灭菌后的器械在使用前已冷却。同时准备一次性无菌手术刀片。
   5. 将装有活检样本的试管放入无菌操作台内。打开试管，将活检组织转移至无菌培养皿中。
   6. 用3 mL无菌PBS清洗右心室活检样本两次。如需在显微镜下拍摄活检样本图像，可在此步骤进行。
   7. 使用无菌镊子将右心室活检样本转移至含有1 mL胶原酶溶液的无菌2 mL离心管中。
   8. 用无菌剪刀将组织剪成0.5–1 mm³大小的碎块。
   9. 在37 °C条件下持续旋转振荡孵育1.5小时。
   10. 在室温下以400 × g离心10分钟，收集消化后的细胞悬液。
   11. 弃去上清液，加入1 mL无菌PBS重悬沉淀以进行洗涤。
   12. 在室温下再次以400 × g离心10分钟。
   13. 弃去上清液，将沉淀重悬于1 mL TMES培养基中。
   14. 将所得细胞悬液接种至无菌的60 mm组织培养处理培养皿中，并加入TMES培养基至终体积为3 mL。将培养皿置于细胞培养箱中，在37 °C、5% CO₂条件下孵育。
       注意：过高的培养基体积可能影响消化后组织碎片的正常贴壁。
   15. 24小时后，弃去培养基以去除未贴壁的细胞和碎片。
       注意：单个解离的间充质细胞可贴附于塑料表面并形成克隆；此外，未完全消化的小块组织碎片也可贴壁并支持细胞出芽生长。
   16. 用5 mL无菌PBS清洗培养皿两次，然后加入3 mL新鲜TMES培养基。
   17. 每周更换TMES培养基三次，直至细胞融合度达到80%。
       注意：贴壁细胞的数量取决于组织质量、组织量以及消化效率。

3. 细胞扩增

注意：开始前请确保已准备好 TMES 培养基。

1. 当细胞融合度达到80%时，将消化后的小型活检样本转移至新的无菌60 mm组织培养处理培养皿中，并加入3 mL新鲜TMES培养基。
   注意：活检样本可重复用于进一步的C-MSC分离。可重复此操作，直至获得足够数量的分离细胞。
2. 用3 mL无菌PBS洗涤贴壁细胞两次。加入胰蛋白酶-EDTA溶液（60 mm培养皿加0.5 mL），于37 °C孵育3 - 5分钟，以使细胞脱落。
3. 当细胞从培养皿表面脱落时，加入0.5 mL无菌FBS以终止胰蛋白酶活性，并将细胞收集至新的50 mL无菌离心管中。
4. 用5 mL无菌PBS洗涤培养皿两次，将残留细胞一并加入同一离心管中。
5. 在室温下以400 × g离心10分钟。
6. 弃去上清液，将沉淀重悬于1 mL TMES培养基中。
7. 取10 µL细胞悬液加入细胞计数板中。
   注意：若细胞浓度过高，可用PBS将初始悬液按1:10稀释，再取10 µL稀释后的细胞悬液加入细胞计数板中。
8. 在显微镜下计数3个大方格及其其中两条边线上的细胞数，并计算平均细胞数。
   注意：为获得细胞数/mL，需将计数所得平均细胞数乘以10⁴（即细胞计数板的稀释因子）。若细胞经过额外稀释，还需再乘以相应的稀释倍数。所需接种细胞数与细胞浓度（细胞数/mL）之比，即为下一步（步骤3.9）接种时所需初始悬液的体积（mL）。
9. 将重悬的细胞以5,000 - 10,000个细胞/cm²的终浓度接种于无菌100 mm组织培养处理培养皿中，并加入TMES培养基至终体积8 mL。将培养皿置于细胞培养箱中孵育。
   注意：当细胞融合度达到70 - 80%时，重复细胞扩增操作。每次传代（P）时，建议冻存部分细胞，其余继续接种培养。将细胞扩增至P3或P4代，用于荧光激活细胞分选（FACS）分析（第4节）和成脂分化（第5节）。
10. 细胞消化脱落后如需冻存，于室温下以400 × g离心10分钟。
11. 按前述方法计数细胞（步骤3.7 - 3.8），将1 × 10⁶个细胞重悬于900 µL无菌FBS中。转移至无菌冻存管，加入100 µL无菌DMSO并混匀。
12. 迅速将冻存管放入-80 °C冷冻容器中，至少保存2天后转移至液氮中长期保存。

4. 通过流式细胞术表征心脏间充质基质细胞

注意：开始之前，请确保已准备好细胞解离试剂、洗涤缓冲液以及特异性抗体。

1. 当细胞数量达到至少 3 x 10⁶ 时（按 3.7 - 3.8 步骤所述计数细胞），用 10 mL 无菌 PBS 将 100-mm 培养皿清洗两次。
2. 加入 5 mL 细胞解离试剂，在室温下静置 7 - 10 分钟，使细胞脱落。
3. 当细胞从培养皿表面脱落时，加入 15 mL 无菌洗涤缓冲液，并将悬液收集至一个新的 50 mL 无菌离心管中。
4. 用 10 mL 洗涤缓冲液将培养皿再清洗两次，并将残留的细胞并入同一离心管中。
5. 在室温下以 400 x g 离心 10 分钟，弃上清，将沉淀重悬于 1 mL 洗涤缓冲液中。
6. 按前述方法计数细胞（步骤 3.7 - 3.8），取 3 x 10⁶ 个细胞转移至新的无菌离心管中，并加入洗涤缓冲液至终体积为 1.5 mL。
   注意： 总细胞数和洗涤缓冲液的总体积取决于分析所用标记物的数量（每根 FACS 聚苯乙烯管中为 3 x 10⁵ 个细胞/100 µL）。
7. 将 100 µL 细胞悬液分装至 12 根不同的 FACS 聚苯乙烯管中，按产品说明书推荐浓度加入相应的特异性抗体。
   注意： 用于 C-MSC 表征的抗体包括 CD34、CD105、CD45、CD29、CD90、CD44、CD31、CD14 和 HLA-DR（表 1）。需制备对照样本，即在 100 µL 重悬细胞中加入同型对照抗体，以检测信号的特异性。
8. 将样本在避光条件下孵育 15 分钟。
9. 每管加入 1 mL 无菌洗涤缓冲液以终止反应。
10. 在室温下以 400 x g 离心 10 分钟。
11. 弃去上清液，将沉淀重悬于 250 µL 洗涤缓冲液中。
12. 进行流式细胞术分析以完成 C-MSC 的表征。

5. 心脏间充质基质细胞的脂肪成脂分化

注意：开始之前，请确保已准备好 T. ADIPO 培养基和 ORO 工作液。

1. 在 T. ADIPO 培养基中培养
   1. 按照第 3 节所述方法消化并计数细胞。
   2. 在无菌的 6 孔组织培养板中，每孔加入 2 mL T. ADIPO 培养基，并接种 3 × 10⁵ 个细胞。
   3. 让 C-MSC 在 T. ADIPO 培养基中分化 72 小时或 1 周，每 2–3 天更换一次培养基。
2. 油红 O 染色
   注意：使用油红 O（ORO）染色检测 C-MSC 中的脂质积累。
   1. 将 6 孔组织培养板置于通风橱中。
   2. 移除成脂诱导培养基，并用 2 mL PBS 洗涤细胞两次。
   3. 加入足量的 4% 多聚甲醛（PFA），以完全覆盖每个孔。在室温下固定细胞 5 分钟。
   4. 弃去 PFA，并用 2 mL PBS 洗涤细胞两次。
   5. 在室温下，用足量油红 O 工作液覆盖各孔，孵育固定后的细胞 1 小时。
      注意：油红 O 孵育期间，不要将 6 孔组织培养板留在通风橱内，以避免油红 O 工作液蒸发。
   6. 完全移除油红 O 工作液，并用 2 mL PBS 洗涤 3–5 次，直至孔板彻底清洁；弃去洗涤液。当 PBS 洗涤液变得澄清，且在显微镜下观察不到细胞外的非特异性染色时，停止洗涤。
   7. 使用倒置组织培养相差显微镜，对每个孔在 20 倍放大倍数下拍摄 20 张图像。
   8. 使用图像处理程序打开图片，以定量分析细胞中油红 O 的积累量。
   9. 通过图像处理软件中的 "拆分通道"功能分离不同颜色通道，仅对 255-红色通道的亮度进行定量分析。
   10. 通过计数细胞核数量来统计每张图片中的细胞数，并将油红 O 信号强度归一化至细胞数量。
   11. 计算同一样本各图片所得结果的平均值。

结果

心脏间质细胞的分离： 从心内膜心肌活检中分离C-MSC的操作流程见图1。

心脏基质细胞的间充质表征：根据国际细胞治疗学会（ISCT）的规定，定义多能间充质基质细胞的最低标准包括其免疫表型特征³。具体而言，为确认其间充质谱系来源，需将细胞与相应的FITC/PE/APC标记抗体孵育，并通过流式细胞术进行分析。用于C-MSC表征的所有抗体均列于材料表中。

如图2所示，从活检组织中获得的C-MSC表达特异性间充质表面抗原CD29、CD44和CD105。CD90阳性细胞的比例存在差异，这与先前报道一致¹¹。这些细胞不表达内皮细胞标记物（CD31、CD34）、单核细胞/巨噬细胞标记物（CD14）、造血细胞标记物（CD45）以及主要组织相容性复合体（HLA-DR）（图2）。

心脏间充质基质细胞的成脂分化：为诱导其成脂分化，需将从致心律失常性心肌病（ACM）患者和健康对照者（HC）获得的心脏间充质基质细胞（C-MSC）在T. ADIPO培养基中培养（见溶液部分）。细胞培养72小时或1周，每周更换培养基两次。

细胞内脂滴的积累通过油红O染色得以证实（图3）。从ACM和HC来源的细胞在分化能力及分化程度上均存在差异。如代表性图像所示，在成脂诱导培养基中培养72小时后，ACM来源的C-MSC比HC来源的C-MSC积累更多的脂滴（图3）。即使在成脂分化条件下培养更长时间（1周），这些差异仍然存在（图3）。

视频 1：电生理解剖标测与心腔内超声心动图的整合。 一名接受心内膜心肌活检的患者右心室心内膜单极电生理解剖图（左前斜位和右前斜位视图，下层面）。心尖区域可见局限性低电压区（红色/绿色）。在病变心肌及室间隔部位采集心内膜心肌活检样本（以圆圈标记）。实时心腔内超声心动图可用于确认活检钳在目标区域的正确位置（上层面）。 请点击此处观看该视频。（右键可下载。）

视频 2：右前斜位透视视频。 将活检钳经由长可调弯鞘管插入并送入心室。在仔细确认活检钳与心肌接触后，打开钳口，然后牢固闭合以采集样本。 请点击此处观看该视频。（右键单击可下载。）

图1：实验流程示意图。 使用活检导管（一种小型钳状切割器械）采集心内膜心肌活检样本。所获活检组织重量约为 5 mg（A）。用心内膜心肌活检样本用无菌剪刀剪成 0.5 - 1 mm³ 的组织碎片（B），并加入胶原酶溶液。将样本置于37 °C旋转平台摇床上孵育1.5小时进行消化（C）。消化后的溶液经离心后接种于塑料培养皿中的TMES培养基中（D）。利用细胞对塑料表面的黏附特性，可获得C-MSC，其可表现为单个细胞、克隆集落，或从小块未完全消化的活检组织中长出（E）。随后通过流式细胞术对C-MSC进行表型鉴定（F）。将C-MSC接种至成脂诱导培养基中，通过油红O染色检测脂滴积累情况（G）。比例尺表示50 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：C-MSC 的代表性细胞荧光分析图谱。 每个直方图显示了细胞数量与指定通道中荧光强度的关系（PE：藻红蛋白；APC：别藻蓝蛋白；FITC：异硫氰酸荧光素）。在每个图中，同型对照（白色）和与特异性细胞表面标志物抗体结合的样本（红色）均被展示。C-MSC 对间充质表面抗原 CD29、CD44、CD105 呈阳性，对 CD90 呈部分阳性，但不表达 CD31、CD34、CD14、CD45 和 HLA-DR。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：C-MSC的脂肪向分化。在脂肪诱导培养基中培养72小时和1周后的ACM和HC C-MSC代表性图像，经油红O（ORO）染色（左侧图片；n = 3）。右侧图表显示255-红色通道染色亮度的定量结果：强度以任意单位（A.U.）表示。与对照组相比，ACM C-MSC积累更多的脂滴。采用Student's T检验，*：p< 0.05。比例尺表示50 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

MSC 与 C-MSC：MSC 是存在于多种成体组织基质组分中的多能细胞，例如骨髓、脂肪组织、软骨、脑、皮肤、胎儿附属结构以及心脏¹²。已有不同研究致力于分离和表征这些细胞，以探索其在基础研究和转化研究中的潜在应用^12,13。

在健康状态下，间充质干细胞（MSC）处于静息状态，以较低速率进行自我更新¹⁴。由于它们会暴露于环境中的病理变化，因而会通过直接转分化、基质沉积或旁分泌效应来促进组织重塑，从而作出应答¹⁴。

心脏间充质干细胞（C-MSC）是心脏中数量众多的非心肌细胞群体⁴它们起源于心外膜，迁移至心肌层，并经历上皮-间质转化过程。¹⁵它们通过与心肌细胞的相互作用以及对细胞外基质稳态的调节，在生理和病理状态下均有助于维持心脏结构的机械完整性和电生理稳定性。^7,16然而，C-MSC 的广泛功能尚未被完全理解。通过深入研究其在生理和病理条件下的作用，可促进对该细胞功能的全面认识。 体外 分离后的研究。

已从人类心脏的不同区域获得C-MSC，例如心耳^2,17和右心室¹⁸。

最近，已从人右心室心内膜活检样本中成功分离出C-MSC⁸，表明所需组织来源可少至3-5 mg。

可能的应用： 本文所述方法允许从非常小的心脏标本中，通过少数几个简单步骤（如消化及基于贴壁性的筛选）获得细胞。

C-MSC 可被视为一种细胞模型，因为其易于扩增和维持 体外，并能分化为中胚层谱系的细胞（内皮细胞、成骨细胞和脂肪细胞）。此外，直接从患者体内获取细胞的可能性具有重要意义 体外 用于个性化/精准医学背景下机制研究的工具。事实上，这些细胞携带供体的遗传背景及可能存在的特异性突变，并受到患者特定特征的影响，如临床状况、年龄、性别、生活方式和用药情况。此外，通过不同标记物对它们进行分选的可能性，可实现对特定C-MSC亚群的研究¹⁹.

C-MSC 被认为在多种心血管疾病中发挥重要作用，这些疾病大多以心脏的不良重塑为特征。因此，C-MSC 可作为开发新型治疗策略的潜在靶点，以对抗心脏疾病^8,20。

C-MSC 的干细胞样特性及其免疫原性较低的特点，提示其在心脏再生医学的细胞治疗中具有潜在应用价值。事实上，与骨髓或其他来源的 MSC 相似，C-MSC 在自体和异体应用中均可能使用，且无需供体与受体之间的配型²¹。

此外，C-MSC直接从心脏组织中分离获得，具有经心脏微环境和表观遗传特征预处理的优势。在心脏再生医学领域，这一特性对于获得成功的治疗效果可能尤为重要。

迄今为止，再生医学的临床前研究已发现C-MSC及其旁分泌活性具有重要的治疗潜力^18,22,23。重要的是，目前已有以心脏组织为细胞来源的临床试验正在进行，所用细胞包括心脏球来源细胞或C-MSC的亚群^13,24,25。然而，与骨髓来源的MSC类似，获得临床级C-MSC可能需要采用不同的制备方案²⁶。

ACM中的C-MSC：本方案主要适用于需要进行心内膜活检的病理学研究。致心律失常性心肌病（ACM）患者会因诊断目的接受活检操作²⁷。其心肌组织逐渐被瘢痕组织替代，这种电生理上无活性的组织由脂肪细胞和纤维化成分构成。为了引导活检取样至病变瘢痕区域（此处诊断阳性率最高），需采用心内膜心肌标测技术^10,28,29。本方案所使用的样本取自病变心肌的交界区域。

Sommariva 等人最近定义了C-MSC在ACM发病机制中的关键作用⁸，证明C-MSC是ACM心脏脂肪生成的积极参与者，因为这些心脏中的前脂肪细胞具有间充质来源。此外，通过本方案从ACM患者活检组织中分离的C-MSC表现出比对照组更强的脂质积累和脂肪生成倾向。因此，这些细胞可用于验证ACM的一些分子机制，证明其作为机制研究细胞模型的适用性⁹。

局限性与关键步骤：尽管直接从患者获取C-MSC具有诸多优势（参见“"可能的应用"”段落），但本方案仍存在多种局限性。

首先，心脏活检是一种侵入性操作，若非绝对必要，通常会避免实施。事实上，获取心脏组织样本在伦理和技术上均存在难题。进行心脏活检的指征可能包括在心肌病的鉴别诊断中明确诊断、监测心脏移植后的状态，或确认心脏肿瘤的存在³⁰。因此，只有符合共识声明³¹所建议需进行心内膜心肌活检的患者，方可纳入C-MSC相关研究。此外，心脏活检操作可能引发临床并发症，尤其在心肌病患者的心脏中风险更高。因此，电生理医师在取样时始终持谨慎态度，所得活检样本可能非常微小，从而影响细胞的分离。未来的实验可通过优化胶原酶浓度或消化时间来克服这一问题。

与其他所有原代人类细胞一样，C-MSC在不同个体间的各种表型中均表现出高度变异性。实际上，来自不同个体的细胞不仅在遗传上存在差异，还受到不同环境因素的影响。具体而言，在本实验中，细胞的分离、生长以及成脂分化均观察到较高的变异性。

必须注意本方案中的关键步骤。如果活检样本中含有毛细血管，则必须将其去除，以避免内皮细胞的平行分离，否则可能污染C-MSC培养物，并可通过FACS分析（CD31阳性）加以证实。为了实现有效的脂肪向分化，细胞必须处于活跃的生长期。细胞汇合程度也可能影响脂质的积累。

方法的意义： 与以往间充质基质细胞的分离方法相比，这是首次详细提出直接从人心室活检样本中获取C-MSC的方案。尽管该方法建议用于心肌炎患者样本的处理，但原则上可适用于所有需要进行心内膜心肌活检的患者。

本方案是对先前方法的有效改进，先前方法在获取所需细胞时需要更大的心脏样本³²，而这类样本通常难以收集。

此外，样本来源本身也是一项引人注目的创新。虽然心室活检通常取自室间隔³³，但本方案考虑了从右心室游离壁获取的样本。源自病变右心室区域的细胞可能更能代表涉及右心室疾病的病理状态。

此外，本方案中使用的某些试剂与其他C-MSC分离和分化方法所用的试剂有所不同³²。例如，本文建议使用的胶原酶为I型和II型胶原酶的混合物，其蛋白水解活性比例均衡。此外，消化液由该胶原酶混合物溶解于制备C-MSC培养基所用的相同基础培养基（IMDM）中而成，从而使分离得到的C-MSC能够适应后续的生长条件。

此外，尽管分选步骤可使细胞批次标准化，但仅通过这些细胞的贴壁特性分离得到的完整C-MSC群体，仍是一种简化方法，且不改变C-MSC的免疫表型特征。本论文提出的T. ADIPO组分能够诱导成脂分化，同时避免胰岛素等其他成分所引起的代谢失调。

此外，本文提出的基于油红O比色强度评估的脂质积累定量方法，相较于仅依据油红O染色阳性细胞百分比的方法，能够提供关于脂质积累量的更多信息。通常可通过异丙醇提取细胞中掺入的油红O并测定其吸光度来量化脂质积累。然而，该方法需要更多的操作步骤，且由于异丙醇易挥发，结果易受实验变异影响。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
IMDM	Gibco by Life Technologies	12440053
胎牛血清（FBS）	Sigma-Aldrich	F2442
青霉素-链霉素	Life Technologies Italia	15140122
胶原酶 NB4	Serva	17454.02
碱性成纤维细胞生长因子	Peprotech	100-18B
L-谷氨酰胺	Sigma-Aldrich	G7513
PBS	Lonza	17-516F
Tryple select 1X（细胞解离试剂）	Gibco	12563029
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
胰蛋白酶-EDTA 溶液	Sigma-Aldrich	T6689
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A2058
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤	Sigma-Aldrich	I5879
氢化可的松	Sigma-Aldrich	H4001
吲哚美辛	Sigma-Aldrich	I7378
油红 O	Sigma-Aldrich	O0625
异丙醇	Sigma-Aldrich	I9516
4% 多聚甲醛（PFA）PBS 溶液	D.b.a. Italia S.r.l.	sc-281692
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma-Aldrich	276855
抗体 CD14-FITC（MφP9）	Becton Dickinson	345784
抗体 整合素 β1（CD29）-PE（克隆 MAR4）	Becton Dickinson	561795
抗体 PECAM-1（CD31）-APC （克隆 9G11）	R&D Systems	FAB3567A
抗体 造血祖细胞抗原（CD34）-APC（克隆 581）	Thermo Fisher Scientific	CD34-581-05
抗体 H-CAM（CD44）-PE （克隆 G44-26）	Becton Dickinson	561858
抗体 L-CA（CD45）-APC（克隆 HI30）	Thermo Fisher Scientific	MHCD4505-4
抗体 THY1（CD90）-FITC（克隆 5E10）	Becton Dickinson	561969
抗体 内皮糖蛋白（CD105）-APC（克隆 266）	Becton Dickinson	562408
抗体 HLA-DR-FITC（克隆 L243）	Becton Dickinson	347400
Gima Quick Plus 消毒器	Gima	35642
台式离心机 Sigma 3-16K	Sigma Centrifuges	10330
Mr. Frosty 冷冻容器	Thermo Fisher Scientific	5100-0001
AxioVert 200M 显微镜	Zeiss	B 40-080 e 03/01
FACS Gallios	Beckman Coulter	773231AF
ImageJ（图像处理程序）	NIH
Stericup 滤器单元	Merck S.P.A.	SCGPU05RE
50 mL 锥形管	Eppendorf	30122178
15 mL 锥形管	Eppendorf	30122151
2 mL 安全锁扣管	Eppendorf	30120094
100 mm 细胞培养处理培养皿	Corning	430167
60 mm 细胞培养处理培养皿	Corning	430166
6 孔细胞培养多孔板	Corning	3516
5 mL 聚苯乙烯圆底管	BD Falcon	352058
BRAND 计数板 BLAUBRAND Bürker-Tük	Sigma-Aldrich	BR719520