一种基于流式细胞术的检测方法，用于鉴定可破坏荧光标记的CXC趋化因子配体12与CXC趋化因子受体4结合的化合物

摘要

本文描述了一种基于流式细胞术的细胞结合实验，主要用作筛选工具，用于鉴定能够抑制荧光标记的CXC趋化因子配体12（CXCL12）与CXC趋化因子受体4（CXCR4）结合的化合物。

摘要

G蛋白偶联受体（GPCR）的药物靶向在人类健康中具有重要意义，因为GPCR介导的信号传导功能障碍与多种疾病的进展相关。配体/受体对CXC趋化因子配体12（CXCL12）/CXC趋化因子受体4（CXCR4）已引起显著的临床关注，例如作为治疗癌症和炎症性疾病的潜在靶点。因此，能够特异性靶向CXCR4并抑制其功能的小分子以及治疗性抗体被视为重要的药理学工具。本文描述了一种基于流式细胞术的细胞检测方法，可用于鉴定阻断CXCL12与CXCR4结合的化合物（例如，小分子）。该方法的核心原理是：固定量的荧光标记CXCL12（CXCR4的天然趋化因子激动剂）与未标记化合物之间竞争受体结合位点。因此，该检测避免了放射性标记探针的使用。此外，检测使用活细胞作为受体（CXCR4）来源，而非细胞膜制备物，从而便于将该方法轻松适配于微孔板格式，提高通量。该检测已被证明是一种有效的通用药物发现方法，可用于筛选靶向CXCR4的化合物。该实验方案可能适用于其他GPCR，至少在存在或可制备荧光标记配体的情况下可行。实施本方法无需预先了解这些GPCR激活后所诱导的细胞内信号通路。

引言

G蛋白偶联受体（GPCRs）是一类细胞表面蛋白，可被细胞外配体（例如肽类、蛋白质激素、胺类）激活，从而调控多种生理和发育过程¹。当激动剂占据GPCR的结合口袋时，受体蛋白发生构象改变，促进与细胞内受体相关的异源三聚体G蛋白（由G_α-GDP和G_βγ亚基组成）的结合。随后G_α亚基上的GDP被GTP取代，导致G蛋白亚基解离为G_α-GTP和G_βγ，进而启动下游信号通路^2,3。当G_α-GTP被水解后，G_α-GDP与G_βγ亚基重新结合，使G蛋白恢复至静息状态^3,4。根据G_α亚基的序列相似性，可将G蛋白分为不同类型（G_s、G_i/o、G_q、G_12/13）⁵。这些G蛋白各自诱导特定的细胞内信号通路，介导受体激活后的生物学反应。受体激活后，GPCR激酶（GRKs）会磷酸化GPCR的胞内尾部，促进其与β-阻遏蛋白（β-arrestins）的相互作用。该过程导致G蛋白信号终止、受体脱敏和内化⁶。β-阻遏蛋白还可参与形成多分子复合物，触发独立于G蛋白信号的级联反应⁷。

G蛋白偶联受体（GPCR）是治疗干预中最受认可的分子靶点之一，因为由受体基因功能获得性突变或受体过表达等原因导致的GPCR介导信号通路失调，参与了多种人类疾病的发病机制⁸。因此，GPCR是制药行业研究的最重要的一类药物靶点之一^8,9,10。一个具有重要临床意义的GPCR典型例子是CXC趋化因子受体4（CXCR4），它仅由一种天然配体CXC趋化因子配体12（CXCL12）激活¹¹。由于CXCR4在人免疫缺陷病毒1型（HIV-1）进入并感染分化簇4（CD4）阳性T淋巴细胞过程中作为主要共受体的明确作用¹²，最初被作为抗病毒药物靶点进行研究。CXCL12与CXCR4在骨髓中的相互作用进一步调控干细胞和祖细胞的滞留与归巢¹³。此外，鉴于其在癌症生物学多个方面（例如，肿瘤细胞存活、转移、肿瘤相关血管生成）¹⁴ 以及多种其他人类疾病（例如，炎症性疾病）¹⁵ 中的参与，CXCR4作为有前景的药物发现靶点引起了广泛关注。AMD3100是一种特异性靶向CXCR4的小分子，最初被发现为抗HIV候选药物¹⁶，至今仍是已报道的最有效的CXCR4拮抗剂之一¹⁷。然而，其作为抗病毒药物的开发已被终止¹⁸。目前，该分子被用于多发性骨髓瘤和淋巴瘤患者治疗过程中的干细胞动员剂¹⁸。此外，已有多种化学结构不同且效力各异的小分子和生物制剂被报道可抑制CXCR4功能¹⁹。

受体结合方法是药理学中有价值的工具，可用于鉴定直接与目标G蛋白偶联受体（GPCR）相互作用的化合物（例如小分子）。进行结合研究时，无需事先了解特定GPCR的细胞内信号传导特性或功能状态。尽管这可被视为一种优势，但也意味着能够证明其受体结合能力的化合物仍需进一步表征，以评估其潜在的激动或拮抗活性。该活性可通过与所研究GPCR相关的药理学或生物学检测方法进行评估。根据其活性特征，这些受体结合分子有可能进一步发展为可用于临床前和临床研究的新型先导化合物。能够以高亲和力特异性结合受体的分子还可作为构建治疗或诊断工具的骨架，例如通过放射性标记用于肿瘤细胞的无创体内成像²⁰，或作为靶向递送治疗药物的潜在载体²¹。对于CXCR4而言，已有研究在小鼠模型中利用标记的靶向CXCR4分子实现了人源肿瘤异种移植灶的可视化，从而证实了其在体内成像肿瘤细胞中的应用^20,22,23。

在本报告中，我们描述了一种竞争性结合实验的详细方案，该方案可用于鉴定能够直接干扰激动剂（CXCL12）与CXCR4结合的小分子和生物制剂。该实验的基本原理是：固定量的荧光标记配体（CXCL12）与待测化合物在CXCR4受体上发生竞争性结合。通过检测荧光信号的变化，可评估待测分子对CXCL12结合的抑制能力，从而筛选出靶向CXCR4配体结合位点的潜在拮抗剂。该方法具有高灵敏度和可重复性，适用于药物发现早期阶段的高通量筛选。 关键词：竞争性结合实验，CXCR4，CXCL12，荧光配体，小分子抑制剂，生物制剂，受体-配体相互作用，高通量筛选^AF647，参见 材料与试剂表）以及未标记化合物与受体蛋白的结合^17,24通过流式细胞术分析标记配体与表达CXCR4的单个细胞结合后产生的特异性荧光信号。当未标记的小分子干扰CXCL12与CXCR4之间的相互作用时，该荧光信号将减弱。^AF647 和CXCR4。该检测使用未经修饰且内源性表达CXCR4的活细胞（即， Jurkat细胞），因此无需进行细胞膜制备，使得该检测方法简便、快速，并适用于高通量分析。由于使用了荧光标记的配体，避免了放射性物质的使用。

由于CXCL12是CXCR4的天然激动剂，因此在本实验中干扰CXCL12^AF647结合的小分子化合物很可能作用于正构受体结合位点（即天然激动剂所占据的结合位点）。若分子作用于与正构结合位点在拓扑结构上不同的受体结合位点，则在不影响CXCL12结合的情况下，这些分子将无法被检测到 。例如，正向和负向变构调节剂是一类作用于变构结合位点的重要且新兴的GPCR靶向分子²⁵，但本实验可能无法检出此类分子。此外，无法通过本结合实验判断所鉴定出的化合物是受体拮抗剂还是激动剂。因此，需要进一步在其他药理学或功能性受体相关实验中对所鉴定的化合物进行研究。这些实验可能包括基于细胞的荧光或发光检测第二信使（例如，Ca²⁺、环磷酸腺苷（cAMP））的实验、表型或生物学功能实验以及β-阻遏蛋白募集实验，具体选择取决于所研究GPCR的特定信号传导特性。因此，本文所述的竞争性结合实验主要作为初步筛选实验，需结合其他基于细胞的实验，以实现对具有受体结合活性的化合物进行深入表征。

方案

1. 细胞培养的维持

注意：在1和2中所述的所有步骤均须在层流柜内的无菌条件下进行。

1. 在37 °C、5% CO₂条件下，于T75培养瓶中培养细胞₂ 在湿润的培养箱中。
   注意：在此实验中，Jurkat 细胞（即， 内源性表达CXCR4的人白血病T淋巴细胞¹⁷应使用流式细胞术在整个细胞培养过程中评估细胞表面CXCR4的表达水平。然而，本方案不涵盖用于测定细胞表面受体表达水平的流式细胞术操作步骤及相关试剂的详细说明，相关内容已有先前文献报道。¹⁷.
2. 让Jurkat细胞在悬浮状态下生长至80 - 85%汇合度。传代至新培养瓶前，将所有试剂平衡至室温（RT）。
3. 向一个新的T75培养瓶中加入20 mL新鲜的完全生长培养基（RPMI-1640培养基，10%胎牛血清（FBS），2 mM谷氨酰胺）。
4. 从原始的T75培养瓶（含25 mL细胞悬液）中取出5 mL Jurkat细胞悬液，加入新的T75培养瓶中。于37 °C、5% CO₂条件下培养。₂ 在湿润的培养箱中。

2. 竞争结合实验用CXCL12、检测缓冲液和Jurkat细胞的制备。

1. 通过将冻干试剂（储存于 -80 °C，避光）溶解于含有 0.01%（体积/体积）聚山梨酯 20 的超纯水中，制备 CXCL12^AF647 储存液（20 µg/mL；参见材料与试剂表）。将该储存液分装成单次使用量，于 -80 °C 避光保存。
2. 通过向 200 mL Hank's 平衡盐溶液（HBSS，10x，不含酚红且不含碳酸氢钠，终浓度为 1x）中加入 40 mL HEPES（1 M，终浓度为 20 mM），制备测定缓冲液。加入超纯水至终体积为 2 L。加入 4 g（0.2% 质量/体积）牛血清白蛋白（BSA），并通过磁力搅拌溶解 BSA。最后，用 NaOH 调节 pH 至 7.4，并使用真空过滤装置经 0.2 µm 滤膜过滤溶液（参见材料与试剂表）。
   注：此测定缓冲液将在本方案的所有后续步骤中使用。
3. 计数细胞数量并检测细胞活力。取细胞悬液样品，用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释。
   注：我们常规使用一种自动细胞活力分析仪（参见材料与试剂表），可对不同浓度的细胞悬液进行计数。进行细胞计数时，将 0.5 mL 细胞悬液稀释于 1.5 mL PBS 中（其他稀释比例，例如，0.1 mL 细胞悬液加 1.9 mL PBS，也可使用）。该方法基于台盼蓝染料排斥法，其使用方法已有文献报道²⁶。目前市场上还有多种其他可用于细胞数量和活力计数的设备，效果应同样良好。
4. 通过离心（参见材料与试剂表中所用离心机类型），在室温下以 400 × g 离心 5 分钟，将所需数量的细胞（即，进行一个完整的 96 孔板实验约需 24 × 10⁶ 个细胞）收集至无菌 50 mL 离心管中。
5. 小心倾去上清液，避免扰动细胞沉淀。加入新鲜测定缓冲液（例如，20 mL），并通过轻柔吹打重悬细胞。
6. 再次在室温下以 400 × g 离心 5 分钟。
7. 再次倾去上清液，并将细胞沉淀重悬于新鲜测定缓冲液中，调整细胞密度至 5 × 10⁶ 个细胞/mL。

3. 竞争性结合实验

注意：实际的竞争结合实验在室温下进行，可在非无菌条件下操作。

1. 将待研究的化合物用检测缓冲液（见2.2）稀释至所需浓度。可选择为初筛配制固定浓度的化合物溶液例如， 10 µM 最终浓度），或者 alternatively，采用一系列浓度梯度稀释以对化合物进行更详细的表征（例如， 1 µM 起始浓度的 1/3、1/4 或 1/5 稀释系列（终浓度）。需注意，化合物溶液在检测中最终会被稀释 2 倍；因此，应配制 2 倍浓度的溶液。
2. 将100 µL化合物溶液（2倍浓缩）加入透明96孔圆底板中（参见 材料与试剂表）按照预定义的实验布局（例如， 图1C).
   注意：在此阶段，检测中包含阴性对照和阳性对照样本。在 阴性对照样品，向96孔板的孔中加入100 µL检测缓冲液，代替化合物。对于 阳性对照样本，此步骤中也需加入检测缓冲液。另见 图1C 用于测试多种化合物稀释系列的典型实验设计。
3. 加入50 µL细胞悬液（参见2.7；0.25 x 10⁶ 使用多通道移液器将试剂储液槽中的细胞加入96孔板中。室温避光孵育15分钟。
4. 加入50 µL荧光标记的CXCL12（即， 100 ng/mL CXCL12^AF647 在测定缓冲液中（4倍浓缩，终浓度为25 ng/mL），从类似的试剂储液槽加入至96孔板的各孔中。室温避光孵育30分钟。
   注意：对于 阴性对照样品，改为加入检测缓冲液。因此，阴性对照样本中检测到的荧光信号将对应于自发荧光背景信号（图1A）。对于 阳性对照样本，每孔加入 50 µL CXCL12^AF647阳性对照样品将产生可检测到的最大荧光信号，因为未包含与化合物预孵育可能引起的抑制作用（图1A).
5. 将96孔板在室温下以400 × g离心5分钟。通过翻转平板去除沉淀细胞的上清液。将平板在纸巾上干燥。
6. 使用多通道移液器从试剂储液槽中向各孔加入 200 µL 新鲜测定缓冲液。立即进行下一步操作。
7. 再次于室温下以400 × g离心板5分钟。通过翻转平板去除上清液，并在纸巾上再次干燥。
8. 轻轻将细胞沉淀重悬于200 µL含1%多聚甲醛的PBS溶液中。此步骤用于固定细胞。
9. 立即继续进行流式细胞术荧光定量分析。

4. 通过流式细胞术分析样品

CXCL12^AF647 染色和固定的细胞现在可用于流式细胞术分析。可使用多种类型的流式细胞仪，但仪器必须配备正确的激光器（即， 红色激光（激发波长范围约630 nm）进行激发，并配备适用于荧光染料检测的滤光片（发射滤光片约660 nm）。这些设备需能够处理96孔板格式的样品。适用于本实验的流式细胞仪示例见下文 材料与试剂表.

1. 启动设备并打开相应的软件（参见材料与试剂表）。
2. 选择以下细胞参数，以点图形式显示：前向散射光（FSC）、侧向散射光（SSC）以及荧光染料（CXCL12^AF647）检测通道。
   注意：通过FSC参数可根据细胞大小区分细胞，因为检测到的光吸收强度与细胞直径成正比。SSC参数测量的是90°角方向的光散射，可提供有关细胞颗粒度的信息。
3. 选择一个样本（例如，阴性对照样本），根据FSC和SSC参数对定义的均一细胞群体进行设门。
   1. 选择从此阴性对照样本中自动进样约100 µL固定后的细胞进入流式细胞仪。进样前选择“混匀”选项，并使用1.5 µL/s的样本流速。
   2. 点击“采集数据”运行该样本。该样本的FSC和SSC参数将显示在屏幕上。
   3. 选择软件中的设门工具。根据FSC和SSC点图显示，通过设门预定义一个均一且具有活性的细胞群体。具体操作为：使用软件设门工具绘制一个多边形区域，包含在这两个参数维度上分布均一的单个细胞（“事件”）。
      注意：设门的目的是确定一个均一且具有活性的细胞群体，用于后续分析。该步骤基于一个假设，即大多数活细胞在FSC和SSC参数上会形成一个均一的细胞群。通过此步骤可基本排除细胞碎片、死细胞和细胞聚集体对后续分析的干扰。图1B展示了设门过程的示意图。
4. 选择每样本分析20,000个“事件”（即单个细胞）。
   注意：这意味着每个样本中，最终将分析20,000个位于预设门控区域内的细胞。每个样本的数据采集将持续进行，直至达到该事件数量。
5. 开始运行（选择“记录数据”）。流式细胞仪将逐个分析所有样本，并记录每个样本的平均荧光强度（MFI）。该MFI值对应于位于预设门控区域内20,000个细胞的平均荧光信号。

5. 数据分析

使用每个样本获得的平均荧光强度（MFI）进行后续所有计算。流式细胞术数据的分析可通过多种市售软件包完成（参见材料与试剂表）。

1. 为确定化合物预孵育对荧光结合信号的抑制百分比，应用以下公式：
   
   其中：
   平均荧光强度_实验 实验组（化合物处理样本）的平均荧光强度
   平均荧光强度_PC 阳性对照的MFI
   平均荧光强度_NC = 阴性对照的MFI
2. 为了确定IC₅₀ 化合物的值（即， 化合物使荧光结合信号降低50%时的浓度），应用以下公式：
   
   其中：
   日志_浓.2 = 化合物浓度的对数值，该浓度导致阳性对照与阴性对照MFI值之差的抑制率低于50%
   日志_浓.1 = 导致阳性对照与阴性对照MFI值差异被抑制超过50%的化合物浓度的对数值
   注意：或者，对于活性较高的化合物，可根据每种测试浓度对应的 MFI 生成覆盖多个数量级的剂量-反应曲线。通过使用适当的软件进行非线性回归曲线拟合（参见 材料与试剂表），IC₅₀ 然后可以从生成的曲线中推导出相应数值。此分析方法的一个示例见于 图3.

结果

结合实验的总体工作流程如图1A所示。在标准实验中，针对不同类型样本（即阴性对照、阳性对照和实验样本）所获得的流式细胞术数据示例见图1B，而进行该实验时在96孔板中的可能板式布局见图1C。将内源性表达趋化因子受体CXCR4（即本实验中关注的G蛋白偶联受体）的Jurkat细胞与浓度递增的荧光标记CXCL12（即CXCL12^AF647）共同孵育后，观察到荧光水平升高（图2），反映了CXCR4上配体结合水平的增加。为证明CXCL12^AF647结合的受体特异性，使用了一种已被广泛验证且具有受体特异性的CXCR4拮抗剂（小分子AMD3100）。首先将Jurkat细胞与一系列1/5梯度稀释的AMD3100（浓度范围为0.064 ng/mL至1,000 n...

讨论

与其他类型的结合实验相比（即， 饱和结合与动力学结合实验），竞争 结合实验最适合用于筛选目的。此类实验可通过检测大量未标记化合物（例如小分子）干扰固定量标记受体配体结合的能力，从而评估其活性。然而，若化合物结合于标记配体以外的受体位点，则可能在实验中无法被检测到。尽管本文所述的竞争性结合实验特别针对趋化因子受体CXCR4，但其亦可作为其他G蛋白偶联受体（GPCR）竞争性结合实验设计的参考模板。例如，CXC趋化因子受体7（CXCR7）已被报道为CXCL12的另一种受体，能够以高亲和力结合CXCL12。^29,30因此，同一种标记的趋化因子（CXCL12）^AF647) 可用于建立CXCR7结合实验。由于CXCR4和CXCR7共享CXCL12作为共同配体，因此有必要使用仅在细胞表面表达其中一种受体的细胞模型，以评估特异性受体结合。我们先前的研究已证明，Jurkat细胞不表达内源性CXCR7¹⁷因此，在本实验所述的CXCR4检测中，排...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BD FACSCanto II	Becton Dickinson	不适用	流式细胞仪设备
BD FACSDIVA 软件
BD FACSArray	Becton Dickinson	不适用	流式细胞仪设备
BD FACSArray 系统软件
Graphpad Prism	Graphpad		用于图2和图3中非线性回归分析的软件包
FlowJo	FlowJo 现为 BD 全资子公司。
Vi-CELL	Beckman Coulter	不适用	细胞活力分析仪
Sigma 3-18 KS	Sigma	不适用	离心机
AMD3100	Sigma	A5602-5mg	特异性 CXCR4 拮抗剂
马拉维若	Pfizer		抗逆转录病毒药物，CCR5 拮抗剂，可于 Selleckchem（货号 S2003）和 Sigma（货号 PZ0002）用于研究
h-SDF1a (AF647)	ALMAC	CAF-11-B-01	荧光标记的 CXCL12，CXCL12AF647
胎牛血清 (FBS)	Gibco (Life Technologies)	10270-106
牛血清白蛋白 (BSA)	Sigma	A1933-25G
HBSS (10x)，含钙、镁，不含酚红	Gibco (Life Technologies)	14065-049
HEPES (1M)	Gibco (Life Technologies)	15630-056
杜氏磷酸盐缓冲液 (DPBS)	Gibco (Life Technologies)	14190-094
Jurkat 细胞	ATCC
PP 材质试剂储液槽	Sigma	BR703411
快速流过滤器：0.2 µm aPES	Thermo Scientific	566-0020
Sterilin 微孔板，96 孔，U 型底，透明	Thermo Scientific	611U96
Falcon 管，50 ml	Greiner Bio-One	227 261
组织培养瓶 (T75)	Corning	353024