方法文章

一种基于流式细胞术的检测方法，用于鉴定可破坏荧光标记的CXC趋化因子配体12与CXC趋化因子受体4结合的化合物

DOI：

10.3791/57271

⸱

2018年3月10日

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1Laboratory of Virology and Chemotherapy, Department of Microbiology and Immunology, Rega Institute for Medical Research, KU Leuven

本文内容

摘要

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本文描述了一种基于流式细胞术的细胞结合实验，主要用作筛选工具，用于鉴定能够抑制荧光标记的CXC趋化因子配体12（CXCL12）与CXC趋化因子受体4（CXCR4）结合的化合物。

摘要

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G蛋白偶联受体（GPCR）的药物靶向在人类健康中具有重要意义，因为GPCR介导的信号传导功能障碍与多种疾病的进展相关。配体/受体对CXC趋化因子配体12（CXCL12）/CXC趋化因子受体4（CXCR4）已引起显著的临床关注，例如作为治疗癌症和炎症性疾病的潜在靶点。因此，能够特异性靶向CXCR4并抑制其功能的小分子以及治疗性抗体被视为重要的药理学工具。本文描述了一种基于流式细胞术的细胞检测方法，可用于鉴定阻断CXCL12与CXCR4结合的化合物（例如，小分子）。该方法的核心原理是：固定量的荧光标记CXCL12（CXCR4的天然趋化因子激动剂）与未标记化合物之间竞争受体结合位点。因此，该检测避免了放射性标记探针的使用。此外，检测使用活细胞作为受体（CXCR4）来源，而非细胞膜制备物，从而便于将该方法轻松适配于微孔板格式，提高通量。该检测已被证明是一种有效的通用药物发现方法，可用于筛选靶向CXCR4的化合物。该实验方案可能适用于其他GPCR，至少在存在或可制备荧光标记配体的情况下可行。实施本方法无需预先了解这些GPCR激活后所诱导的细胞内信号通路。

引言

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G蛋白偶联受体（GPCRs）是一类细胞表面蛋白，可被细胞外配体（例如肽类、蛋白质激素、胺类）激活，从而调控多种生理和发育过程1。当激动剂占据GPCR的结合口袋时，受体蛋白发生构象改变，促进与细胞内受体相关的异源三聚体G蛋白（由Gα-GDP和Gβγ亚基组成）的结合。随后Gα亚基上的GDP被GTP取代，导致G蛋白亚基解离为Gα-GTP和Gβγ，进而启动下游信号通路2,3。当Gα-GTP被水解后，Gα-GDP与Gβγ亚基重新结合，使G蛋白恢复至静息状态3,4。根据Gα亚基的序列相似性，可将G蛋白分为不同类型（Gs、Gi/o、Gq、G12/13）5。这些G蛋白各自诱导特定的细胞内信号通路，介导受体激活后的生物学反应。受体激活后，GPCR激酶（GRKs）会磷酸化GPCR的胞内尾部，促进其与β-阻遏蛋白（β-arres....

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方案

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1. 细胞培养的维持

注意：在1和2中所述的所有步骤均须在层流柜内的无菌条件下进行。

  1. 在37 °C、5% CO₂条件下，于T75培养瓶中培养细胞2 在湿润的培养箱中。
    注意：在此实验中，Jurkat 细胞（即， 内源性表达CXCR4的人白血病T淋巴细胞17应使用流式细胞术在整个细胞培养过程中评估细胞表面CXCR4的表达水平。然而，本方案不涵盖用于测定细胞表面受体表达水平的流式细胞术操作步骤及相关试剂的详细说明，相关内容已有先前文献报道。17.
  2. 让Jurkat细胞在悬浮状态下生长至80 - 85%汇合度。传代至新培养瓶前，将所有试剂平衡至室温（RT）。
  3. 向一个新的T75培养瓶中加入20 mL新鲜的完全生长培养基（RPMI-1640培养基，10%胎牛血清（FBS），2 mM谷氨酰胺）。
  4. 从原始的T75培养瓶（含25 mL细胞悬液）中取出5 mL Jurkat细胞悬液，加入新的T75培养瓶中。于37 °C、5% CO₂条件下培养。2 在湿润的培养箱中。

2. 竞争结合实验用CXCL12、检测缓冲液和Jurkat细胞的制备。

  1. 通过将冻干试剂（储....

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结果

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结合实验的总体工作流程如图1A所示。在标准实验中，针对不同类型样本（即阴性对照、阳性对照和实验样本）所获得的流式细胞术数据示例见图1B，而进行该实验时在96孔板中的可能板式布局见图1C。将内源性表达趋化因子受体CXCR4（即本实验中关注的G蛋白偶联受体）的Jurkat细胞与浓度递增的荧光标记CXCL12（即CXCL12AF647）共同孵育后，观察到荧光水平升高（图2），反映了CXCR4上配体结合水平的增加。为证明CXCL12AF647结合的受体特异性，使用了一种已被广泛验证且具有受体特异性的CXCR4拮抗剂（小分子AMD3100）。首先将Jurkat细胞与一系列1/5梯度稀释的AMD3100（浓度范围为0.064 ng/mL至1,000 n.......

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讨论

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与其他类型的结合实验相比（即， 饱和结合与动力学结合实验），竞争 结合实验最适合用于筛选目的。此类实验可通过检测大量未标记化合物（例如小分子）干扰固定量标记受体配体结合的能力，从而评估其活性。然而，若化合物结合于标记配体以外的受体位点，则可能在实验中无法被检测到。尽管本文所述的竞争性结合实验特别针对趋化因子受体CXCR4，但其亦可作为其他G蛋白偶联受体（GPCR）竞争性结合实验设计的参考模板。例如，CXC趋化因子受体7（CXCR7）已被报道为CXCL12的另一种受体，能够以高亲和力结合CXCL12。29,30因此，同一种标记的趋化因子（CXCL12）AF647) 可用于建立CXCR7结合实验。由于CXCR4和CXCR7共享CXCL12作为共同配体，因此有必要使用仅在细胞表面表达其中一种受体的细胞模型，以评估特异性受体结合。我们先前的研究已证明，Jurkat细胞不表达内源性CXCR717因此，在本实验所述的CXCR4检测中，排.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者谨此感谢Eric Fonteyn提供的出色技术支持。本工作得到了鲁汶大学（KU Leuven，资助号：PF/10/018）、比利时弗拉芒科学基金会（Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek，FWO，资助号：G.485.08）以及瓦杜兹Dormeur基金会（Fondation Dormeur Vaduz）的资助。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BD FACSCanto IIBecton Dickinson不适用流式细胞仪设备
BD FACSDIVA 软件
BD FACSArrayBecton Dickinson不适用流式细胞仪设备
BD FACSArray 系统软件
Graphpad PrismGraphpad用于图2和图3中非线性回归分析的软件包
FlowJoFlowJo 现为 BD 全资子公司。
Vi-CELLBeckman Coulter不适用细胞活力分析仪
Sigma 3-18 KSSigma不适用离心机
AMD3100SigmaA5602-5mg特异性 CXCR4 拮抗剂
马拉维若Pfizer抗逆转录病毒药物，CCR5 拮抗剂，可于 Selleckchem（货号 S2003）和 Sigma（货号 PZ0002）用于研究
h-SDF1a (AF647)ALMACCAF-11-B-01荧光标记的 CXCL12，CXCL12AF647
胎牛血清 (FBS)Gibco (Life Technologies)10270-106
牛血清白蛋白 (BSA)SigmaA1933-25G
HBSS (10x)，含钙、镁，不含酚红Gibco (Life Technologies)14065-049
HEPES (1M)Gibco (Life Technologies)15630-056
杜氏磷酸盐缓冲液 (DPBS)Gibco (Life Technologies)14190-094
Jurkat 细胞ATCC
PP 材质试剂储液槽SigmaBR703411
快速流过滤器：0.2 µm aPESThermo Scientific566-0020
Sterilin 微孔板，96 孔，U 型底，透明Thermo Scientific611U96
Falcon 管，50 mlGreiner Bio-One227 261
组织培养瓶 (T75)Corning353024

参考文献

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  1. Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints. Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).
  2. Milligan, G., Kostenis, E.

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重印与许可

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标签

CXCR4 CXCL12 GPCR Jurkat AMD3100

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