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构建具有定制多样性的合成噬菌体展示Fab文库

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DOI：

10.3791/57357

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2018年5月1日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Antibody Engineering, Shanghai Institute for Advanced Immunochemical Studies, ShanghaiTech University, 2Banting and Best Department of Medical Research, Terrence Donnelly Center for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto, 3Department of Molecular Genetics, Terrence Donnelly Center for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案详细描述了构建具有定制多样性的噬菌体展示合成抗体文库的步骤。合成抗体在基础研究、疾病诊断和治疗中具有广泛的应用。

摘要

单克隆抗体（mAbs）在基础研究和医学领域的应用需求逐年增长。自1975年首次报道以来，杂交瘤技术一直是单克隆抗体开发的主要方法。作为一种替代技术，噬菌体展示技术在单克隆抗体开发中的吸引力日益增强，自2002年首个噬菌体来源的抗体——修美乐（Humira）获批用于类风湿关节炎的临床治疗以来尤其如此。作为一种非动物源性的单克隆抗体开发技术，噬菌体展示规避了传统杂交瘤技术所必需的抗原免疫原性、人源化以及动物饲养等环节。在本实验方案中，我们描述了一种构建合成型噬菌体展示Fab文库的方法，通过单次电穿孔即可获得多样性达109-1010的文库。该方案包括以下步骤：1）高效电转化感受态细胞的制备；2）含尿嘧啶的单链DNA（dU-ssDNA）的提取；3）基于Kunkel方法的寡核苷酸定向诱变；4）电穿孔及文库规模计算；5）基于蛋白A/L的酶联免疫吸附测定（ELISA）评估蛋白折叠与功能多样性；以及6）多样性DNA序列分析。

引言

单克隆抗体（mAbs）在基础研究、疾病诊断与治疗中具有广泛的应用。截至2016年，美国食品药品监督管理局（USFDA）已批准超过60种单克隆抗体用于自身免疫性疾病、癌症和传染病的临床治疗1,2。

1975年，Kohler 和 Milstein 报道了一种从称为“杂交瘤”的细胞来源持续产生具有单一克隆特异性抗体的技术，该技术随后成为医学和工业领域的基石3,4通过该方法生成单克隆抗体需要多个步骤，包括抗原制备、小鼠免疫、B淋巴细胞提取、B细胞与骨髓瘤细胞融合以形成永生化杂交瘤细胞、克隆筛选，以及在治疗应用中，为避免人抗小鼠抗体（HAMA）反应，还需进行人源化处理。4,5然而，对于该技术而言，包括毒素、病原体和高度保守蛋白在内的抗原在诱导免疫应答方面相对较弱 在体内 用于单克隆抗体生产的免疫应答5.

1978年，Hutchison 等 报道了使用寡核苷酸定向突变单链噬菌体病毒中某一残基的方法6。1985年，Smith报道了外源基因片段可与编码噬菌体外壳蛋白III的基因进行同框融合，从而在不损害其感染性的前提下展示于噬菌体表面7。这些开创性工作为后续构建免疫型、天然型和合成型的噬菌体展示抗体文库奠定了基础，这些文库以单链可变区片段（scFv）和抗原结合片段（Fab）等形式被用于治疗性单克隆抗体的开发8,9。从技术角度来看，基于噬菌体展示的抗体开发为基于杂交瘤的单克隆抗体开发提供了一种互补方法，有助于克服某些抗原可能带来的限制以及杂交瘤来源抗体通常所需的人源化过程5。截至2016年，已有6种噬菌体展示技术衍生的单克隆抗体获批上市，包括用于治疗类风湿性关节炎最成功的单抗之一Humira，此外还有多种噬菌体展示来源的抗体候选药物正处于临床研究的不同阶段10。

对于免疫型和天然型噬菌体抗体文库，轻链和重链的互补决定区（CDRs）多样性来源于天然免疫组库（即，来自B细胞）。相比之下，合成型噬菌体抗体文库中CDRs的多样性完全是人工设计的。通过合成方法构建文库可精确控制序列多样性的设计，并为抗体结构与功能的机制研究提供机会11,12。此外，合成文库的框架可在文库构建前进行优化，以促进后续大规模的工业开发11,12。

1985年，Kunkel 报道了一种基于单链DNA（ssDNA）模板的诱变方法，可高效地将定点突变引入M13噬菌体13。该方法随后被广泛用于构建噬菌体展示文库。设计用于在Fab互补决定区（CDR）中引入多样性的化学合成DNA寡核苷酸被整合到含有抗体骨架模板的噬粒中。在此过程中，噬粒表达为含尿嘧啶的单链DNA（dU-ssDNA），寡核苷酸退火至CDR区域，并在T7 DNA聚合酶和T4 DNA连接酶存在下延伸，合成双链DNA（dsDNA）。最后，生成的dsDNA可通过电穿孔导入Escherichia coli中。

为了获得高多样性，构建噬菌体展示文库时，应谨慎制备电转感受态细胞与共价闭合环状双链DNA（CCC-dsDNA）的双组分混合物的高压电穿孔。Sidhu et al. 对电转感受态细胞和DNA的制备方法进行了改进，相较于传统方法显著提高了文库的多样性14。

本方案描述了一种构建合成噬菌体展示Fab文库的方法，通过单次电穿孔即可获得多样性达109-1010的文库。图1展示了文库构建的整体流程，包括：1）高效电转化感受态细胞的制备；2）含尿嘧啶的单链DNA（dU-ssDNA）的提取；3）基于Kunkel法的寡核苷酸定向诱变；4）电穿孔及文库大小的计算；5）基于蛋白A/L的酶联免疫吸附试验（ELISA）对折叠能力与功能多样性的评估；以及6）多样性的DNA序列分析。所有试剂、菌株和设备均列于材料表中。表1展示了试剂的配置情况。

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方案

注意：在处理噬菌体时，必须全程使用带滤膜的无菌吸头，以避免对移液器及周围区域造成污染。进行细菌和噬菌体实验时，必须在无菌区域或生物安全柜中操作。噬菌体实验区域使用后须先用2%十二烷基硫酸钠（SDS）清洁，再用70%乙醇擦拭，以防止噬菌体污染。本实验方案中进行系列稀释时，每次稀释均应使用新的吸头。

1. E. Coli SS320 感受态细胞的制备

  1. 将预先制备并储存在 4 °C 且使用期限不超过 1 周的 LB/tet 琼脂平板在 37 °C 培养箱中预热 1 小时。使用无菌接种环或无菌枪头，沿平板表面以锯齿形方向轻轻划线接种 E. coli SS320 菌种甘油保存液。将平板置于 37 °C 培养箱中过夜培养约 12–15 小时。
  2. 次日，使用无菌接种环或无菌枪头，从锯齿形划线区域选取一个分离良好的单菌落，将接种环浸入培养基中并短暂搅动，接种至装有 10 mL 2YT/tet 培养基的 50 mL 圆底管中。
  3. 在 37 °C、200 rpm 振荡条件下培养约 3–4 小时，直至 OD600 达到约 0.4–0.8（对数生长期）。在 2 小时时监测 OD600。在此期间，将 5 块预先制备并储存在 4 °C 且使用期限不超过 1 周的 LB/tet 琼脂平板置于 37 °C 培养箱中预热至少 1 小时。
  4. 从实验室库存中取 20 μL M13KO7 辅助噬菌体（滴度约为 1 × 1013 菌落形成单位 (cfu)/mL），加入含 180 μL 无菌 1× PBS 的灭菌 1.5 mL 离心管中，制备 10 个十倍系列稀释液。
  5. 将 4 mL 灭菌液态 2YT 上层琼脂分装至 5 个 14 mL 圆底管中，每管分别标记为十倍稀释系列中的第五至第九个稀释度，并置于 65 °C 培养箱中保温，以维持 2YT 上层琼脂处于液态。
  6. 将 500 μL 对数生长期的 E. coli SS320 细胞加入 M13KO7 稀释管中（选择十倍稀释系列中第五至第九个稀释度之一），在 37 °C 培养箱中孵育 5–10 分钟。
  7. 在步骤 1.6 孵育期间，将步骤 1.5 中的 2YT 上层琼脂转移至室温（RT）冷却约 5 分钟至约 42 °C。用手腕内侧测试 2YT 上层琼脂温度，应保持液态。将步骤 1.5 中各稀释混合物分别转移至对应的 2YT 上层琼脂管中。拧紧每管管盖，轻轻并短暂地反复倒置数次以混匀，避免产生气泡。
  8. 小心地将每种混合物沿预热的 LB/tet 琼脂平板（来自步骤 1.3）边缘倾倒，并略微倾斜平板，使混合物完全且均匀地覆盖平板表面，同时避免引入气泡。将平板在室温下静置约 5–10 分钟，使上层琼脂凝固，随后在 37 °C 培养箱中过夜培养约 15–18 小时。
  9. 在步骤 1.8 过夜培养后，选择含有约 100–200 个大小适中、分离良好的单个噬菌斑的稀释平板进行噬菌斑接种。一手持琼脂平板置于光源前，另一手持装有长型无菌枪头的移液器，垂直刺入上层琼脂，挑取单个且分离良好的噬菌斑。
    1. 略微倾斜移液枪头以分离含噬菌斑的上层琼脂。反复吹吸数次，使含噬菌斑的琼脂块脱离，并转移至预先加入 1 mL 2YT/kan/tet 培养基（见 表 1）的 14 mL 圆底培养管中。
    2. 重复此操作，共挑取 3–5 个噬菌斑。挑取多个噬菌斑的目的是确保接种成功，因为噬菌斑相较于细菌菌落可能较淡且较小。在 37 °C、200 rpm 振荡条件下培养 8 小时。
  10. 将一管培养物转移至装有 50 mL 2YT/kan/tet 培养基的 250 mL 有挡板锥形瓶中。在 37 °C、200 rpm 振荡条件下过夜培养约 12 小时。
  11. 向三个各装有 900 mL superbroth/tet/kan 培养基的 2-L 有挡板锥形瓶中，每瓶接种 5 mL 过夜培养物。在 37 °C、200 rpm 振荡条件下培养 6–7 小时，至 OD600 达到约 0.6–0.8。
  12. 将三瓶细菌培养物置于冰浴中，用手轻轻持续旋转 5 分钟。后续步骤应在低温室、冰上操作，并使用预冷的溶液和设备。
  13. 用吸水纸擦干每只锥形瓶外壁；一手将 1-L 灭菌离心瓶倾斜置于实验台上，另一手将每只锥形瓶中的培养基轻轻倒入对应的离心瓶中。
  14. 在 5,000 × g、4 °C 条件下离心 10 分钟，沉淀细菌。
  15. 离心后，小心倾去上清液至 5-L 灭菌废液桶中。
  16. 向每瓶中加入 100 mL 经无菌过滤的 1.0 mM HEPES（pH 7.4），并向每瓶中加入一根灭菌磁力搅拌子，以辅助在 200 rpm 条件下重悬沉淀。磁力搅拌过程中每隔数分钟摇动并刮下瓶壁上的全部沉淀。沉淀完全溶解后，向每瓶中再加入 400 mL 经无菌过滤的 1.0 mM HEPES（pH 7.4）。
  17. 在 5,000 × g、4 °C 条件下离心 10 分钟。倾去上清液，保留搅拌子于瓶中。
  18. 重复步骤 1.16 至 1.17 一次。
  19. 在搅拌子辅助下，将每瓶沉淀重悬于 500 mL 经无菌过滤的 10% 超纯甘油中。磁力搅拌过程中每隔数分钟摇动并刮下瓶壁上的全部沉淀。
  20. 按步骤 1.17 进行离心和倾倒。重复步骤 1.19 一次。使用长臂灭菌镊子取出搅拌子。
  21. 在 5,000 × g、4 °C 条件下离心 15 分钟。倾去上清液，并用移液器吸除每只离心瓶中残留的微量上清液。
  22. 向其中一瓶中加入 3.0 mL 10% 超纯甘油，轻轻吹吸重悬沉淀。将悬液转移至下一瓶并重复操作，直至所有沉淀均被重悬并合并于同一瓶中。最终可获得约 6 mL 高浓度细胞悬液，滴度约为 3 × 1011 cfu/mL。
  23. 在操作前至少 1 小时，将 1.5 mL 灭菌微量离心管和一个无分隔的 96 孔管储存盒预冷至 -80 °C。在分装细胞沉淀悬液前，将预冷的微量离心管转移至低温室冰上。使用移液器将 350 μL 细胞悬液分装至每支 1.5 mL 微量离心管中。
  24. 将分装好的样品转移至充满液氮的泡沫盒中进行速冻（3–5 分钟）。
    1. 将装有液氮的泡沫盒转移至 -80 °C 冰箱（见步骤 1.23）。
    2. 从 -80 °C 冰箱（见步骤 1.23）中取出 1.5 mL 微量离心管储存盒并置于冰上。
    3. 迅速使用金属筛网将样品从液氮中筛出，并放入管储存盒中。于 -80 °C 保存。
      注意：液氮可造成冻伤，操作时需注意安全防护。使用 Fab 骨架噬粒检测所制备电转感受态细胞的效率（Fab 骨架噬粒储备液应为超纯水（MilliQ）配制，浓度为 400 ng/µL）。在冰上解冻 10 µL 超纯水中含 1 μg 的 Fab 骨架噬粒及 350 μL 电转感受态 SS320 细胞，并将 0.2 cm 间隙的电转杯预冷于冰上。
  25. 将解冻后的 350 μL 电转感受态 SS320 细胞加入 10 µL DNA 中，在冰上反复吹吸数次混匀。避免引入气泡。
  26. 在电转前至少 30 分钟，将 15 mL SOC 培养基置于 50 mL 管中，在 37 °C 水浴中预热。将 360 μL 混合液转移至电转杯中，按照制造商说明进行电转。
  27. 电转后立即加入 1 mL 预热的 SOC 培养基（来自步骤 1.27）进行细胞复苏，并用移液器吹吸混匀。将液体从电转杯转移至预先加入 5 mL 预热 SOC 培养基的 125 mL 锥形瓶中。
  28. 用 1 mL 预热的 SOC 培养基冲洗电转杯两次，每次冲洗液均转移至 125-mL 锥形瓶（见步骤 1.27）。向 125 mL 锥形瓶中补加预热 SOC 培养基至终体积 10 mL。
  29. 将 10 mL 细胞培养物在 37 °C、200 rpm 振荡条件下培养 30 分钟。
  30. 进行系列稀释以测定转染效率和 M13KO7 预感染率。
    1. 使用多通道移液器向 96 孔板单列各孔中加入 180 μL 2YT 培养基。
    2. 进行 8 个十倍系列稀释：从步骤 1.29 的培养物中取 20 μL 加入第一孔，吹吸混匀后取 20 μL 转移至下一孔。重复此步骤完成系列稀释。
    3. 将每个稀释度的 10 μL 培养物分别涂布于 LB/carb、LB/kan 和 LB/tet 平板上，每个平板做两个重复。
    4. 在 37 °C 过夜培养。
    5. 效率计算公式：假设 M 为在稀释倍数 10N（N 为 1–8）平板上计数得到的平均菌落数。则来自 LB/carb 平板的 E. coli SS320 电转感受态细胞对 Fab 骨架噬粒的转染效率为 M × 10N+3 cfu/µg。M13KO7 预感染率通过 LB/kan 与 LB/tet 平板上的菌落数之比估算。E. coli SS320 感受态细胞中成功转染 Fab 骨架噬粒的比例通过 LB/carb 与 LB/kan 平板上的菌落数之比估算。

2. 从噬粒模板制备含尿嘧啶的单链DNA（dU-ssDNA）

注意：使用先前报道的 Fab 骨架噬菌粒作为 dU-ssDNA 制备的模板15。Fab 骨架噬菌粒的结构如图2所示。采用质粒旋转柱试剂盒（QIAprep Spin M13）提取 dU-ssDNA，略有修改。

  1. 预热一个LB/cmp平板（4℃保存的预制平板） °C，适用于不到一周的样本）于37 °C 培养箱中孵育 1 小时。划线接种一支甘油菌种 E. coli 将 CJ236 细胞（或其他 dut−/ung− 菌株）用无菌接种环或枪头转移至预热的 LB/cmp 平板上。37 ℃ 培养平板 °在4 °C下孵育约12–15小时。
  2. 用无菌枪头挑取单菌落，接种于14 mL聚丙烯圆底管中的2 mL 2YT/cmp培养基中。
  3. 在37℃下孵育培养基 °C，200 rpm 振荡培养 3–4 小时，直至 OD600 在对数期生长阶段，OD值达到约0.4–0.8时。
  4. 加入5-10 μ将含有Fab骨架模板的L噬菌体加入培养物中，37℃孵育 °200 rpm 振荡培养 30 分钟，以使噬菌体感染。
  5. 孵育后，使用无菌枪头取10 μL进行划线接种 μ37℃下将培养物涂布于预热的LB/羧苄青霉素平板上 °C. 37℃孵育 °4 °C 过夜约 12–15 小时。
  6. 挑取单个菌落 大肠杆菌 将含有 Fab 骨架噬菌粒的 CJ236 接种于 14 mL 聚丙烯圆底管中的 3 mL 2YT/carb/cmp 培养基中，于 37 ℃ 培养 °在200 rpm条件下振荡培养约12小时。
  7. 将0.3 mL的起始培养物接种到250 mL有挡板的瓶子中的30 mL 2YT/carb/cmp培养基中。
  8. 在37℃下孵育细胞培养物 °C，200 rpm 振荡培养 3–4 小时，直至 OD600 在对数期生长阶段，OD值达到约0.4–0.8时。
  9. 加入 M13KO7（实验室库存，滴度约为 1 x 1013 cfu/mL）加入到步骤2.8的培养物中，感染复数（MOI）约为10，M13KO7的最终滴度为 约 1 × 1010 cfu/mL
  10. 在 200 rpm 和 37 ℃ 条件下振荡培养 °37°C 下孵育 1 小时。
  11. 在50 mL圆底管中，通过离心沉淀菌液，转速为5,000 × g × 克和25 °20 分钟，4 °C
  12. 弃去上清液，用30 mL新鲜的2YT/carb/kan/uridine重悬沉淀，将重悬液转移至一个新的250 mL带挡板的瓶中。
  13. 在 200 rpm 和 25 ℃ 条件下振荡培养 °C，22-24 小时。
  14. 将步骤 2.13 中的培养物转移至一个 50 mL 圆底管中，于 12,000 ×g 离心培养物 × g 离心 20 分钟，以分离噬菌体上清液与细菌细胞沉淀。将噬菌体上清液转移至新的 50 mL 圆底管中，并加入终体积 1/5 的 PEG/NaCl 溶液以沉淀噬菌体。充分混匀后冰上孵育 30 分钟，使噬菌体颗粒沉淀。
  15. 12,000 离心 × 克和4 °C 下孵育 30 分钟。倾去上清液，并在 4,000 × 克和4 °C 下孵育 2 分钟。吸除残留的上清液。
  16. 将噬菌体沉淀重悬于 2 mL 经无菌过滤的 1X PBS 中，并转移至 1.5 mL 微离心管中。在 12,000 × 在台式微量离心机中以 ×g 离心 5 分钟，以去除残留的细菌碎片，然后将噬菌体上清液转移至新的 1.5 mL 微量离心管中，于 4 ℃ 保存 °C.
  17. 检测尿嘧啶掺入效率 E. coli CJ236 通过并列比较 E. coli SS320
    1. 加入180 μ向96孔板的单行每孔中加入2YT培养基各1 L。
    2. 进行10次10倍梯度稀释：转移20 μ将20 μL噬菌体上清液加入到板的第一孔中，用移液器吹打混匀，然后转移20 μL至下一孔 μ将混合液的 L 加入下一孔。重复此步骤直至完成系列稀释。
    3. 加入10 μL噬菌体进行最后八次连续稀释，以感染90 μL of E. coli CJ236 和 E. coli 对数期的 SS320（OD600 = 0.4–0.8）。在37℃下孵育 °30分钟内轻轻振荡。
    4. 10 号培养皿 μ每次感染后系列稀释的 L E. coli CJ236 和 E. coli SS320 在 2YT/Carb 平板上重复培养。
    5. 37℃过夜孵育 °C.
    6. 滴度计算公式：假设 M 为从 10 倍稀释梯度中计数得到的平均菌落数N （N 为 1–10）。滴度来自 E. coli CJ236 或 E. coli SS320 等于 M X 10N+2 cfu/mL。根据噬菌体滴度比值估算尿嘧啶掺入效率 E. coli CJ236 和 E. coli SS320
  18. 向1.5 mL微量离心管中的噬菌体上清液中加入1/100体积的噬菌体沉淀缓冲液MP，轻轻颠倒管身数次以混匀。室温孵育至少2 min。噬菌体颗粒将从培养基中沉淀析出，此时溶液应呈现浑浊状态。
  19. 将步骤 2.18 的样品加入质粒旋转柱中（例如，QIAprep）置于1.5 mL微量离心管中。一个离心柱对单链DNA（ssDNA）的结合容量至少可达10 µg. 在 6,000 离心 × 克和25 °在台式微量离心机中于 C 离心 30 秒。弃去流穿液（位于 1.5 mL 微量离心管中）。此时噬菌体颗粒仍结合在层析柱基质上。
  20. 加入0.7 mL UT-MLB噬菌体裂解与结合缓冲液（参见 讨论) 加样至柱中，并在室温下孵育至少1分钟。  在 6,000 × g 条件下，25 ℃ 离心 °30 秒内离心并弃去穿滤液。
  21. 加入另外0.7 mL UT-MLB缓冲液，在室温下孵育至少1分钟。
  22. 6,000 × g 离心 × 30 秒内离心 g。弃去穿流液。在此阶段，噬菌体衣壳蛋白与仍结合在柱基质上的含尿嘧啶单链 DNA（dU-ssDNA）分离。
  23. 加入 0.7 mL 含乙醇的洗涤缓冲液 PE，具体操作按照制造商说明书进行。在 6,000 × 30 秒内离心并弃去滤液。
  24. 重复步骤 2.23，然后再次于 6,000 离心 × 30 秒 12,000 × g 离心以去除残留的 PE 缓冲液。
  25. 将柱子转移至新的1.5 mL微量离心管中，加入100 μL 洗脱缓冲液 EB（10 mM Tris）·CL，pH 8.5）至柱膜中心。
  26. 室温孵育 10 分钟，然后在 6,000 × g 离心 1 分钟以洗脱 dU-ssDNA。大约 1.5–2.5 μ每毫升培养液可获得 g 含尿嘧啶的单链 DNA（dU-ssDNA）。
  27. 通过电泳分析洗脱的DNA μ在1%琼脂糖TAE凝胶上进行L。DNA应呈现为一条主要的单一条带，无拖尾现象。
  28. 通过纳米分光光度计在260 nm处测量吸光度（A260）来确定DNA浓度260 = 1.0 对应 33 ng/μL 的 ssDNA）。典型的含尿嘧啶单链 DNA（dU-ssDNA）浓度为 200–500 ng/μL.

3. 基于Kunkel法的寡核苷酸定向诱变

注意事项：建议在进行全规模反应前先开展小规模反应，以确保诱变寡核苷酸及反应组分的质量。基于Kunkel方法的寡核苷酸定向诱变示意图见图3。采用IMGT编号命名法，在CDRH1、CDRH2、CDRH3和CDRL3区域引入了多种氨基酸多样性16（表2）。各互补决定区（CDR）的理论氨基酸多样性、总理论氨基酸多样性以及寡核苷酸序列均列于表2中。

  1. 使用T4多核苷酸激酶进行寡核苷酸磷酸化
    1. 将设计用于突变单个CDR的0.6 μg诱变寡核苷酸与2 μL 10X TM缓冲液、2 μL 10 mM ATP和1 μL 100 mM DTT混合，用超纯H2O补至总体积18 μL，置于1.5-mL离心管中。在文库构建过程中，需分别针对CDRH1、CDRH2、CDRH3和CDRL3设置4个独立且平行的磷酸化反应。
    2. 向每根离心管中加入20 U（2 μL）T4多核苷酸激酶，在37 °C孵育1小时（见表3中的反应1）。磷酸化产物应立即用于退火步骤。
  2. 寡核苷酸与模板的退火
    1. 向20 μg含尿嘧啶的单链DNA（dU-ssDNA）模板中加入25 μL 10X TM缓冲液、每种磷酸化寡核苷酸溶液各20 μL，并用超纯H2O补至终体积250 μL，置于0.5-mL离心管中。充分混匀后，分装至0.20 mL PCR管中（每管50 μL），作为表3中的反应2。假设寡核苷酸与模板的长度比为1:100，则上述DNA用量可使寡核苷酸与模板的摩尔比达到3:1。
    2. 将反应体系置于PCR仪中，90 °C孵育3分钟，50 °C孵育3分钟，20 °C孵育5分钟。
  3. CCC-dsDNA的酶促合成
    1. 向250 μL已退火的寡核苷酸/模板混合物中加入10 μL 10 mM ATP、10 μL 25 mM dNTP混合液、15 μL 100 mM DTT、30 Weiss单位T4 DNA连接酶和30 U T7 DNA聚合酶，作为表3中的反应3。
    2. 将反应体系置于1.5-mL离心管中，在20 °C过夜孵育。
    3. 在室温下，使用带有30 kDa孔径膜的0.5-mL离心过滤装置对合成的CCC-dsDNA进行洗涤和浓缩。
      1. 将过夜反应混合物转移至过滤装置中，并用超纯H2O补至终体积400 µL，于14,000 × g离心10分钟，所得体积通常小于50 μL。
      2. 弃去滤过液，在滤膜上加入400 μL超纯H2O，再次于14,000 × g离心10分钟。
      3. 重复步骤3.3.3.2一次。
      4. 将滤膜倒置放入洁净的微量离心管中以回收CCC-dsDNA，于1,000 × g离心2分钟，回收体积通常约为20–40 μL。回收的CCC-dsDNA可立即用于大肠杆菌（E. coli）电转化，或于-20 °C冷冻保存以备后续使用。通常可获得20–40 μg CCC-DNA。
    4. 取1.0 µL洗脱后的反应产物与dU-ssDNA模板一同进行电泳，以观察反应结果。

4. 电穿孔及文库大小的计算

  1. 将纯化的CCC-dsDNA（20 μg，最大体积50 μL）置于冰上，在1.5 mL微量离心管和0.2 cm间隙的电穿孔杯中冷却。
  2. 在37 °C水浴中预热50 mL聚丙烯锥形离心管中的20 mL SOC培养基，至少30分钟。
  3. 在冰上解冻350 μL电转化感受态E. coli SS320。将细胞加入DNA中，并通过反复吹打充分混匀。避免产生气泡。
  4. 将混合物转移至电穿孔杯中，并按照制造商说明进行电穿孔。例如，使用BTX ECM-630电穿孔系统时，相关参数设置为2.5 kV电场强度、125 Ω电阻和50 µF电容。
  5. 立即加入1 mL预热的SOC培养基以复苏电穿孔后的细胞，并将混合液转移至含有17 mL SOC培养基的125-mL 锥形瓶中。用1 mL SOC培养基冲洗电穿孔杯两次，并将冲洗液也转移至同一锥形瓶（最终体积为20 mL）。
  6. 在37 °C、200 rpm振荡条件下孵育30分钟。
  7. 测定电穿孔效率。
    1. 向96孔微孔板单列的每个孔中加入180 μL 2YT培养基。
    2. 进行8次十倍系列稀释：将20 μL的20 mL培养液转移至第一孔，吹打混匀后取20 μL转移至下一孔。重复此步骤直至完成系列稀释。
    3. 将每种稀释液各取10 μL，重复点样于一张LB/羧苄青霉素平板上。将每种稀释液剩余的100 µL分别点样于独立的LB/羧苄青霉素平板，用于菌落计数交叉验证。这些平板还可用于后续ELISA和序列分析（见第5节）。
    4. 在37 °C过夜孵育。
    5. 计数LB/羧苄青霉素平板上10 μL点样重复孔的菌落数。假设M为10N倍稀释的LB/羧苄青霉素平板上的平均菌落数（N为1–8）。总文库大小等于2M × 10N+3个菌落。
  8. 将第4.6步所得培养物等分为两份，分别加入两个2 L带挡板的锥形瓶中，每个锥形瓶含500 mL 2YT/羧苄青霉素/卡那霉素培养基，用于噬菌体文库的扩增。
  9. 在37 °C、200 rpm振荡条件下过夜孵育约16小时。
  10. 将培养物转移至两个1 L已灭菌的离心瓶中，在4 °C、12,000 × g条件下离心30分钟。
  11. 将上清液转移至两个新的1 L已灭菌离心瓶中，并加入终体积1/5的PEG/NaCl溶液以沉淀噬菌体。冰上孵育30分钟。
  12. 在4 °C、12,000 × g条件下离心30分钟。小心弃去上清液，避免扰动噬菌体沉淀。再在4,000 × g条件下离心1分钟，用移液器吸除残留上清液。
  13. 用20 mL经无菌过滤的1×PBS缓冲液重悬噬菌体沉淀，并转移至新的50 mL离心管中。
  14. 在4 °C、12,000 × g条件下离心5分钟，沉淀不溶性物质。将上清液转移至新的50 mL离心管中。
  15. 使用分光光度计测定噬菌体浓度（OD268 = 1.0对应于5 × 1012 噬菌体/mL的溶液）。
  16. 用含10%超纯甘油的1×PBS将噬菌体浓度调整至5 × 1012 噬菌体/mL。
  17. 将噬菌体溶液按每管1 mL分装至1.5 mL微量离心管中。可立即用于筛选实验，或于-80 °C保存。

5. 通过蛋白A/L直接结合ELISA检测和测序进行质量评估

  1. 从步骤 4.7.3 的 LB/carb 平板上随机挑取 96 个单菌落，转入含有 800 μL 液体培养基的 96 深孔培养板中 μ每孔加入 2YT/carb 液体培养基 1 L，于 37 ℃ 培养 3–4 小时 °C，1,000 rpm 振荡至 OD600 = 0.4-0.8.
  2. 加入100 μL of M13KO7（1 × 10）11 菌落形成单位/毫升）加入至96深孔培养板的每个孔中，使用多通道移液器操作。在37℃下孵育 °37°C、1,000 rpm 振荡培养 1 小时。
  3. 加入100 μ含卡那霉素（500，10倍浓度）的2YT培养基 L μg/mL）加入到各孔中，使用多通道移液器混匀。在37℃下孵育过夜 °37 °C，1,000 rpm 振荡培养。
  4. 将蛋白L溶解至1 µg/mL，用30 μL将384孔高蛋白结合聚苯乙烯板的3/4孔包被 µ每孔加入蛋白L溶液，4℃孵育过夜 °C.
  5. 弃去第5.4步的过夜蛋白L包被液，加入50 µ用多通道移液器向384孔高蛋白结合聚苯乙烯板的所有孔中加入M-PBST（封闭液）。将板在室温下置于微孔板摇床上孵育1小时。
  6. 在4 °C下，以3,000 × g离心步骤5.3中获得的过夜培养物，于深孔96孔培养板中离心10分钟 °C. 噬菌体存在于上清液中。
  7. 弃去第 5.5 步的封闭液。加入 15 μL 的 M-PBST 和 15 μ使用多通道移液器，将每种噬菌体上清液（步骤5.6）各100 μL加入3个蛋白L包被的孔中（设为三复孔），另取1个未包被的孔作为阴性对照。室温下振荡孵育1小时，转速为200 rpm。
  8. 弃去噬菌体溶液。用80 μ使用自动洗板机用 PBST 溶液洗涤。
  9. 加入15 μL 的 M-PBST 和 15 μL 蛋白A-HRP（用1×PBS按1:1,500稀释）加入各孔，使用多通道移液器操作，于室温振荡孵育1小时，振荡速度约为200 rpm 转/分钟
  10. 弃去 Protein A-HRP/M-PBST 溶液，用 80 μPBST 溶液
  11. 加入TMB底物（30 μ每孔加入 L，使用多通道移液器混匀，室温孵育 2–3 分钟，直至显色。加入 1.0 M H 终止反应3PO4 (30 μL/孔
  12. 在 450 nm 处用分光光度法读取酶标板。阳性克隆定义为平均 OD 比值满足特定标准的克隆450 蛋白L孔的吸光度与M-PBST孔相比大于3.0。
  13. 在96深孔板中，加入50 μL SS320 菌株在 2YT/tet 培养基中对数期培养，含 5 μL 的相同噬菌体（用于 ELISA，步骤 5.6）在室温下孵育 30 分钟。
  14. 加入950 μ将 2YT/羧苄青霉素液体加入步骤 5.13 的 96 深孔板中，于 37 ℃过夜培养 °37 °C，1,000 rpm 振荡培养。
  15. 使用质粒小提试剂盒提取噬粒DNA。采用VL（5'-TCGCTTTGTTTTTATTTTTTAATGTA-3'）和VH（5'-GACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCG-3'）的上游引物进行序列分析，以评估文库的序列多样性。

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结果

根据Fab文库构建的流程图（见图1），我们制备了预先感染M13KO7辅助噬菌体的E. coli SS320电转化感受态细胞。当使用用于文库构建的Fab噬菌粒骨架时，这些电转化感受态细胞的转化效率估计为2 × 109 cfu/µg（图4）。

通过比较在 E. coli CJ236 和 E. coli SS320 细胞中的滴度，检测了尿嘧啶掺入效率。将含有dU-ssDNA的噬菌体感染 E. coli CJ236 和 E. coli SS320 细胞。E. coli SS320 含有可降解含尿嘧啶DNA的酶（dUTPase和尿嘧啶糖基化酶），而 E. coli CJ236 缺乏这些酶，无法降解含...

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讨论

为构建高多样性噬菌体展示Fab文库，需要设置质量控制检查点，以监控文库构建过程中的各个阶段，包括电转感受态细胞的转化能力、dU-ssDNA模板的质量、CCC-dsDNA合成效率、电转化后的滴度、Fab的正确折叠，以及通过Fab噬菌体克隆序列分析评估互补决定区（CDR）的氨基酸多样性。

高产量和高纯度的含尿嘧啶单链DNA（dU-ssDNA）对于实现高突变率至关重要。根据我们的经验，25 °C过夜诱导噬菌体产生的dU-ssDNA量高于37 °C过夜诱导的结果，这与先前的一项报道一致19。关于单链DNA的提取，最初的质粒Spin试剂盒（QIAprep）含有用于噬菌体裂解和结合的MLB缓冲液。此后，MLB因未知原因停产，并被PB缓冲液取代。我们发现，使用PB处理所获得的dU-ssDNA产量显著低于使用MLB处理的结果。在本方案中，我们采用一种名为UT-MLB20的试剂替代MLB，发现其dU-ssDNA产量与最初Spin试剂盒中的MLB相当。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢Sidhu实验室的Frederic Fellouse博士对基于Kunkel法的合成Fab噬菌体文库构建提出的宝贵意见。作者感谢Sidhu实验室的Alevtina Pavlenco女士及其他成员在制备高效电转化感受态E. coli细胞和高质量含尿嘧啶单链DNA（dU-ssDNA）过程中提供的帮助。本研究工作得到国家自然科学基金（项目编号：81572698，31771006）对DW的资助，以及上海科技大学（项目编号：F-0301-13-005）对抗体工程实验室的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
1.0 M H3PO4FisherAC29570
1.0 M Tris，pH 8.0Invitrogen15568-025
10 mM ATPInvitrogen18330-019
100 mM 二硫苏糖醇FisherBP172
100 mM dNTP 混合液GE Healthcare28-4065-60含有 dATP、dCTP、dGTP 和 dTTP 各 25 mM 的溶液。
3,3’,5,5’四甲基联苯胺（TMB）Kirkegaard & Perry Laboratories Inc50-76-02
50X TAEInvitrogen24710030
琼脂糖FisherBP160
羧苄西林，carbSigmaC1389100 mg/mL，溶于水  0.22 μm 滤器除菌，工作浓度：100 μg/mL
氯霉素，cmpSigmaC0378100 mg/mL，乙醇中，0.22 μm 滤器除菌，工作浓度：10 μg/mL
EDTA 0.5 M，pH 8.0InvitrogenAM9620G
颗粒状琼脂VWRJ637-500G
H2O2 过氧化物酶底物Kirkegaard & Perry Laboratories Inc50-65-02
K2HPO4Sigma795488
卡那霉素，kanFisherAC6112950 mg/mL，溶于水  0.22 μm 滤器除菌，工作浓度：50 μg/mL
KH2PO4SigmaP2222
Na2HPO4Sigma94046
NaClAlfa AesarU19C015
NanodropFisherND2000C
NaOHFisherSS256! 警告：NaOH 会引起灼伤。
非脂肪奶粉Sangon BiotechA600669
PEG-8000FisherBP233
辣根过氧化物酶标记的蛋白AInvitrogen101123
QIAprep Spin M13 试剂盒Qiagen22704
QIAquick 琼脂糖凝胶回收试剂盒Qiagen28706
QIAquick PCR 纯化试剂盒Qiagen28104
重组蛋白LFisher77679
T4 DNA 聚合酶New England BiolabsM0203S
T4 多核苷酸激酶New England BiolabsM0201S
T7 DNA聚合酶New England BiolabsM0274S
四环素，tetSigmaT766050 mg/mL 水溶液，0.22 μm 滤器除菌，工作浓度：10 μg/mL
胰蛋白胨Fisher0123-07-5
Tween-20SigmaP2287
超纯甘油Invitrogen15514-011
尿苷SigmaU375025 mg/mL（乙醇中），工作浓度：0.25 μg/mL
酵母提取物VWRDF0127-08
名称公司 目录编号评论
菌株
E.coli CJ236New England BiolabsE4141基因型： dut-  ung-  thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F' camr用于制备含尿嘧啶的单链DNA（dU-ssDNA）。
E.coli SS320Lucigen60512基因型：[F'proAB+lacIq lacZΔM15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 Δ(araABC-leu)7679 ΔlacX74 galU galK rpsL thi适用于高效电穿孔和丝状噬菌体生产的优化条件。
M13KO7New England BiolabsN0315S
名称公司 目录编号评论
设备
0.2 cm 间隙电穿孔比色皿BTX
96孔2 mL深孔板Fisher278743
96 孔 Maxisorp 免疫板Nunc151759
带挡板的锥形瓶康宁
台式离心机Eppendorf5811000096
离心瓶Nalgene
ECM-630 电穿孔仪BTX
磁力搅拌子Nalgene
Thermo Fisher 离心机Fisher
高速摇床TAITEKMBR-034P
微孔板振荡器QILINBEIERQB-9002
96孔和384孔液体处理仪RAININ
多通道移液器RAININE4XLS
Amicon 浓缩器默克UFC803096

参考文献

  1. Singh, S., et al. Monoclonal Antibodies: A Review. Curr Clin Pharmacol. , (2017).
  2. Reichert, J. M. Antibodies to watch in 2017. MAbs. 9 (2), 167-181 (2017).
  3. Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
  4. Milstein, C. The hybridoma revolution: an offshoot of basic research. Bioessays. 21 (11), 966-973 (1999).
  5. Gray, A. C., Sidhu, S. S., Chandrasekera, P. C., Hendriksen, C. F., Borrebaeck, C. A. Animal-Friendly Affinity Reagents: Replacing the Needless in the Haystack. Trends Biotechnol. 34 (12), 960-969 (2016).
  6. Hutchison, C. A. 3rd, et al. Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence. J Biol Chem. 253 (18), 6551-6560 (1978).
  7. Smith, G. P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).
  8. Sidhu, S. S. Phage Display in Biotechnology and Drug Discovery. , CRC Press. (2005).
  9. Weiss, G. A., Watanabe, C. K., Zhong, A., Goddard, A., Sidhu, S. S. Rapid mapping of protein functional epitopes by combinatorial alanine scanning. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (16), 8950-8954 (2000).
  10. Frenzel, A., Schirrmann, T., Hust, M. Phage display-derived human antibodies in clinical development and therapy. MAbs. 8 (7), 1177-1194 (2016).
  11. Sidhu, S. S., Fellouse, F. A. Synthetic therapeutic antibodies. Nat Chem Biol. 2 (12), 682-688 (2006).
  12. Adams, J. J., Sidhu, S. S. Synthetic antibody technologies. Curr Opin Struct Biol. 24, 1-9 (2014).
  13. Kunkel, T. A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (2), 488-492 (1985).
  14. Sidhu, S. S., Lowman, H. B., Cunningham, B. C., Wells, J. A. Phage display for selection of novel binding peptides. Methods Enzymol. 328, 333-363 (2000).
  15. Persson, H., et al. CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies. J Mol Biol. 425 (4), 803-811 (2013).
  16. Lefranc, M. P., et al. IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains. Dev Comp Immunol. 27 (1), 55-77 (2003).
  17. Graille, M., et al. Complex between Peptostreptococcus magnus protein L and a human antibody reveals structural convergence in the interaction modes of Fab binding proteins. Structure. 9 (8), 679-687 (2001).
  18. Graille, M., et al. Crystal structure of a Staphylococcus aureus protein A domain complexed with the Fab fragment of a human IgM antibody: structural basis for recognition of B-cell receptors and superantigen activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5399-5404 (2000).
  19. Huang, R., Fang, P., Kay, B. K. Improvements to the Kunkel mutagenesis protocol for constructing primary and secondary phage-display libraries. Methods. 58 (1), 10-17 (2012).
  20. Chen, G., Sidhu, S. S. Design and generation of synthetic antibody libraries for phage display. Methods Mol Biol. 1131, 113-131 (2014).
  21. Padlan, E. A. Anatomy of the antibody molecule. Mol Immunol. 31 (3), 169-217 (1994).
  22. Virnekas, B., et al. Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucleic Acids Res. 22 (25), 5600-5607 (1994).
  23. Fellouse, F. A., Sidhu, S. S. Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. , Second Edition, CRC Press. 157-180 (2006).
  24. Fantini, M., et al. Assessment of antibody library diversity through next generation sequencing and technical error compensation. PLoS One. 12 (5), e0177574(2017).
  25. Glanville, J., et al. Deep sequencing in library selection projects: what insight does it bring? Curr Opin Struct Biol. 33, 146-160 (2015).
  26. Perelson, A. S., Oster, G. F. Theoretical studies of clonal selection: minimal antibody repertoire size and reliability of self-non-self discrimination. J Theor Biol. 81 (4), 645-670 (1979).
  27. Miersch, S., et al. Scalable high throughput selection from phage-displayed synthetic antibody libraries. J Vis Exp. (95), e51492(2015).
  28. Ponsel, D., Neugebauer, J., Ladetzki-Baehs, K., Tissot, K. High affinity, developability and functional size: the holy grail of combinatorial antibody library generation. Molecules. 16 (5), 3675-3700 (2011).
  29. Petering, J., McManamny, P., Honeyman, J. Antibody therapeutics - the evolving patent landscape. N Biotechnol. 28 (5), 538-544 (2011).

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Fab A L ELISA DNA Kunkel

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