用于细胞扩增的重组胶原蛋白I肽微载体及其在生物反应器模型中作为细胞递送系统的潜在应用

摘要

我们提出了一种在大孔微载体上进行细胞扩增的方案，并将其作为递送系统用于灌注式生物反应器中，以接种脱细胞组织基质。我们还介绍了多种用于测定在微载体上培养的细胞增殖和活力的技术。此外，我们验证了细胞在生物反应器培养后的功能活性。

摘要

组织工程是一个前景广阔的领域，致力于应对因移植需求日益增长而带来的组织和器官短缺问题。生成此类组织的过程十分复杂，需要将特定类型的细胞、支架材料以及物理或生化刺激进行恰当组合，以引导细胞的生长与分化。微载体作为一种颇具吸引力的工具，可在三维（3D）微环境中扩增细胞，因其具有更高的比表面积，并且相较于传统的二维培养方法，更接近体内（in vivo）的生理环境。血管系统为细胞提供氧气和营养物质，并确保代谢废物的清除，在构建工程化组织时是一个关键组成部分。事实上，大多数组织构建物在植入后因缺乏有效的血管支持而失败。本研究中，我们介绍了一种在动态条件下（使用旋转烧瓶和生物反应器）于重组胶原蛋白基微载体上扩增内皮细胞的实验方案，并阐述了在此体系中如何评估细胞的存活率与功能特性。此外，我们提出了一种无需额外解离步骤即可实现细胞递送以促进血管化的方法。同时，我们还提供了一种在去细胞化 生物基质上，利用灌注式生物反应器评估细胞血管化潜能的策略。我们认为，采用本研究所展示的方法，有望推动一系列基于细胞的新型疗法在临床组织工程应用中的发展。

引言

组织工程应用中的一个普遍问题是，在需要的部位获得具有正确分化表型的高细胞量。自1967年以来，微载体的应用逐渐发展，并在骨科组织工程领域日益重要，用于大规模生成皮肤、骨骼、软骨和肌腱¹。通过在微尺度三维（3D）基质上扩增细胞，微载体使得贴壁细胞的培养操作方式类似于悬浮培养²。由此，细胞可获得均匀的营养供应以及细胞-基质相互作用，从而更好地维持in vivo^3,4的分化状态，而这种状态在二维（2D）培养中常随时间推移而丧失⁵。更高的比表面积——最终可实现更高的细胞产量^6,7，相较于静态系统更高效的气体和营养物质交换速率⁸，可调控并施加物理刺激于培养环境的可能性⁹，以及扩增过程易于放大的潜力⁷，是其进一步的优势。多种特性，如直径、密度、孔隙率、表面电荷及黏附性能^10,11，决定了市面上不....

方案

骨关节炎患者在接受股骨头置换手术时，从其股骨头中分离出人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）。该操作经维尔茨堡大学当地伦理委员会批准，并获得患者的知情同意。原代微血管内皮细胞从青少年供体的包皮活检组织中分离获得，其法定监护人已书面签署完全知情同意书。本研究已获得维尔茨堡大学当地伦理委员会批准（投票编号182/10）。

1. hBMSCs 和 HDMECs 的分离

1. 人骨髓来源的间充质基质细胞（hBMSCs）
   1. 使用无菌勺子从股骨头中去除松质骨。
      注意：松质骨位于坚硬致密的皮质骨内部，呈疏松颗粒状物质。必要时可使用手术刀从皮质骨上刮取部分松质骨。
   2. 将取出的松质骨放入两个50 mL离心管中。松质骨体积根据髋关节置换手术中取出的股骨头大小而定，通常为5至10 mL。
   3. 用DMEM-F12（DMEM与Ham F12培养基1:1混合）洗涤，每管加入约30 mL培养基。
   4. 手动沿纵向轻轻振荡离心管5秒，使脂肪细胞从松质骨中释放。在300 × g、22 °C条件下离心5分钟。
   5. 使用带刻度的塑料移液管吸除上层脂肪细胞层及约20 mL剩余上清液，保留足够液体以覆盖松质骨。
   6. 向离心管中加入10 mL DMEM-F12培养基，用手剧烈沿纵向振荡10–15秒，使细胞释放。
   7. 使用带刻度的塑料移液管将10–15 mL细胞悬....

结果

如图1A所示，通过活/死细胞染色检测，在培养7天后，我们获得了大量在RCP微载体上存活的细胞。扫描电镜（SEM）分析结果进一步证实了该结论，观察到微载体孔隙周围已被细胞完全定植，并部分覆盖了孔隙（图1B）。另一方面，若细胞接种不均匀，则会导致多个微载体未被占据。实验失败的特征是死细胞数量异常增多，死细胞比例不应超过总细胞数的10%（图1C）。此外，对HDMECs的DNA含量进行定量分析显示，双链DNA（dsDNA）含量随时间逐渐增加（图1D）。

此外，RFP-HDMEC 在 RCP 微载体上培养后仍能保持其功能，如图 2所示，这些细胞在胶原凝胶中培养时呈现出.......

讨论

微载体的一个主要目标是在维持细胞分化能力的同时实现细胞扩增，以便将细胞输送至所需部位。本文介绍了一种RCP微载体，细胞能够在该载体上贴附、增殖，并以高密度定植于微载体表面。通过活/死细胞染色观察发现，在动态培养7天后，存活细胞比例超过90%，仅有少量死细胞。同样，扫描电镜（SEM）图像证实，培养7天后细胞已覆盖微载体的整个表面。

为确保三维模型中细胞的存活，必须维持对细胞的氧气和营养供应，并允许代谢废物的排出。血管是负责这一交换过程的结构，其中内皮细胞发挥关键作用，因为它们是血管内壁的衬里细胞。²³它们具有增殖、迁移、黏附、出芽并形成类似血管结构的能力。²⁴这些特性在RFP-HDMECs细胞于RCP微载体上培养后仍得以保持，因为观察到细胞能够呈现出出芽表型（见 图2）。我们在此证实，定植于RCP微载体上的原代内皮细胞可有效递送至BioVaSc生物基质原有血管管腔内并实现再内皮化。这表明本系统适用于改善组织工程植入物的血管化，具有.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基氯化四氮唑（MTT）	Serva Electrophoresis GmbH	20395.01
4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）	Sigma-Aldrich	D9542
乙酸 100%	Sigma-Aldrich	533,001
分析天平 Kern EG 2200-2NM	Kern & Sohn GmbH
抗坏血酸-2-磷酸盐	Sigma-Aldrich	A8960
生物反应器	德国维尔茨堡组织工程与再生医学教研室
明场显微镜 Axiovert 40C	Carl Zeiss AG
Cellnest	Fujifilm
离心管（15 mL，50 mL）	Greiner Bio-One
胶原蛋白 R 溶液 0.4%	Serva Electrophoresis GmbH	47254.01
DMEM-F12	Gibco	11320-033
杜氏磷酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich	D8537	改良型，不含氯化钙和氯化镁
伊红 1%	Morphisto	10177.01000
乙醇 96%	Carl Roth GmbH	T171.4	变性
胎牛血清（FCS）	Bio&SELL	FCS.ADD.0500	未经热灭活
荧光显微镜 BZ-9000	Keyence
苏木精	Morphisto	10231.01000
六甲基二硅氮烷	Sigma-Aldrich	440191	试剂级，≥99%
生物反应器培养箱	德国维尔茨堡组织工程与再生医学教研室
活/死细胞双染试剂盒	Fluka	04511KT-F
磁力搅拌器	2Mag	80002
Medium 199	Sigma-Aldrich	M0650	10X
酶标仪 Tecan Infinite M200	Tecan
21G 16 mm 针头	VWR	613-5389
木瓜蛋白酶（来自木瓜乳胶）	Sigma-Aldrich	P4762	冻干粉，≥ 10 单位/mg 蛋白质
石蜡	Carl Roth GmbH	6642.6
青霉素/链霉素	Sigma-Aldrich	P4333
蠕动泵	Ismatec
Quanti-iT PicoGreen dsDNA 检测试剂盒	Thermo Fischer Scientific	P7589
Histofix 4%	Carl Roth GmbH	P087
扫描电子显微镜 Supra 25	Carl Zeiss AG
氢氧化钠溶液 1.0 N	Sigma-Aldrich	S2770
旋转烧瓶（25 mL）	Wheaton	356879
1 mL 注射器	VWR	720-2561
细胞培养瓶（25 cm2，75 cm2，150 cm2）	TPP Techno Plastik Products AG
台盼蓝 0.4%	Sigma-Aldrich	T8154
VascuLife VEGF-Mv	Lifeline Cell Technology	LL-0005