这种 rna 下拉法允许识别长的非编码 rna (lncRNA) 的 rna 目标。根据自制的、设计的抗感 DNA 寡核苷酸探针的杂交, 在适当的固定组织或细胞系 lncRNA, 它有效地允许捕获 lncRNA 的所有 RNA 目标。
长的非编码 rna (lncRNA), 这是200多个核苷酸序列没有一个定义的阅读框架, 属于监管非编码 rna 的家庭。虽然它们的生物学功能仍然很不为人知, 但这些 lncRNAs 的数量稳步增加, 现在估计人类可能有超过1万份这样的成绩单。其中一些已知参与了基因表达的重要调控途径在转录水平发生, 但也在不同的步骤 RNA 合作和转录后成熟。在后一种情况下, lncRNA 所针对的 rna 必须确定。这就是为什么它是有用的, 开发一种方法, 使识别的 rna 直接或间接相关 lncRNA 的利益。
本议定书的灵感来自于以前发布的协议, 允许隔离 lncRNA 及其相关的染色质序列, 以允许隔离相关 rna。我们确定, 两个步骤对本议定书的效率至关重要。首先是设计特定的抗感 DNA 寡核苷酸探针, 能够杂交到 lncRNA 的兴趣。为此, 利用生物信息学预测了 lncRNA 二次结构, 反感寡核苷酸探针的设计具有很强的亲和性, 对显示内部基配对概率低的区域具有强烈的亲和力。该程序的第二个关键步骤依赖于组织或培养细胞的固定条件, 必须在所有分子伙伴之间保持网络。加上高通量 rna 测序, 这个 rna 下拉协议可以提供整个 rna interactome 的 lncRNA 的兴趣。
这里描述的方法的总体目标是识别长非编码 rna (lncRNA) 的 rna 分子伙伴。LncRNA 对应于200多个核苷酸序列, 没有定义的阅读框架。其中一些已被证明参与基因表达调控, 不仅在转录水平, 而且在不同的步骤 RNA 合作和转录后成熟。在后一种情况下, lncRNA 的分子伙伴是要鉴定的 rna。因此, 建立一种能够直接或间接与 lncRNA 相关的 rna 的识别方法是必不可少的。
以前发布的方法, 例如由 rna 纯化 (啁啾)1,2和捕获杂交分析 rna 目标 (图表)3,4的染色质分离, 允许高通量发现特定 lncRNA 的 RNA 束缚蛋白和基因组结合点。在这两种方法中, lncRNA 首先与生物素化互补寡核苷酸杂交, 然后用链亲和素珠分离复合物。这两种技术的主要区别与目标 lncRNAs 的探头设计有关。啁啾, 由 RNA 鱼启发的策略, 包括设计一池短互补 DNA 寡核苷酸探针, 以平铺整个 lncRNA 的长度。相比之下, 在图表中, 作者对 lncRNAs 的 RNase H 映射法进行了修改, 以探测可用于杂交的地点。
在这里提出的设计抗感 DNA 生物素化寡核苷酸探针的程序使用 lncRNA 二级结构的生物信息学建模5 选择具有强烈亲和力的探测器, 该区域显示内部的低概率基配对。此过程的优点是比基于 RNAse-H 灵敏度4的平铺寡核苷酸探针2和更少的时间消耗的池更便宜。
由于 lncRNAs6对转录后基因调控有越来越多的证据, 因此开发一种能够捕获作为 lncRNA 目标的 rna 的方法非常有用。此外, 对于大多数应用来说, 这种方法在培养细胞和组织提取物中都得到了优化。
长非编码 rna (lncRNAs) 由他们的数量和多样性代表一个大领域研究和他们的大部分作用仍然被发现。其中许多 lncRNAs 有核定位, 其中一些通过转录或转录后水平机制与基因表达调控途径有关。目前这一领域的一个挑战是了解这些 lncRNAs 在 rna 转录后处理中的相关性。为此目的, 必须确定以 lncRNAs 为目标的 rna。在前人研究的启发下, lncRNAs 与染色质的关联, 我们制定了一个程序, 允许识别与 lncRNA 相关的 rna。该协议的成功, 称为 RNA 下拉, 主要依赖于两个关键步骤, 即设计反感 DNA 寡核苷酸探针, 必须专门和专门杂交与 lncRNA 的利益, 和组织的条件或细胞固定, 必须保持网络的完整性在所有分子伙伴之间。
以前发布的协议提供了将 lncRNA 与其关联的染色质序列 (啁啾1、2、图表3、4) 隔离在一起的过程。在这些协议中, 采用了不同的策略来设计抗感 DNA 生物素化寡核苷酸探针。在啁啾过程中, 作者在排除所有冗余和非特定探头1、2之后, 使用了一组 DNA 生物素化寡核苷酸探针, 涵盖了整个 lncRNA 的长度。在图表协议中, 作者确定了 lncRNA 的区域, 它们可用于杂交和设计的捕获寡核苷酸以这些区域为目标。这些区域根据他们的 RNase 敏感性被选择了。事实上, 利用 RNAse 的特性, 在 rna dna 结合的部位水解 rna, 杂交到 lncRNA 中的可接触部位的寡核苷酸产生 rna-dna 混合体, 导致 lncRNA 的酶解分裂。作者选择了其中三个候选捕获寡核苷酸, 并在鸡尾酒3,4中使用它们。
我们用来设计抗感 DNA 生物素化寡核苷酸探针的过程接近于图表协议中使用的程序, 但根据它们的 RNAse 灵敏度, 没有选择所需 lncRNA 的杂交可用区域, 但根据 lncRNA 二次结构的生物信息学模型确定了其内部基配对的低概率。必须注意的是, 不同的次级结构将被预测使用不同的算法, 并选择的探针应该是那些杂交到可用序列的 lncRNA 在最大数量的二级结构预测。同样的结果也得到了使用三设计的鸡尾酒, 特定探头或单个探针单独。这就促使使用了两个独立的、特定的探头, 并考虑到了这两种探头共有的正面结果。最后, 建议在开发的方法开始时, 为了获得最佳的结果, 并能够评估下拉效果的特殊性, 设计出3种不同的反感寡核苷酸探针, 然后比较实验了它们的效率, 特别是因为探针的效率可以通过细胞裂解制剂来改变。然而, 基于 lncRNA 二次结构生物信息学建模的探针设计程序我们使用的成本仍然低于基于平铺寡核苷酸探针2的池, 这比基于方法的时间消耗更少。在 RNAse 灵敏度4上。
消极的控制也应该使用作为阴性捕获寡核苷酸或者感觉脱氧核糖核酸生物素化寡核苷酸探针或被炒的寡核苷酸探针或寡核苷酸指向不相关的 RNA。由于存在的自然反义转录 lncRNAs, 使用感觉寡核苷酸探针有时可能是不够的。无论为负控制选择的寡核苷酸探针, 都有必要通过爆炸来检查它不与已知的 RNA 杂交, 并记住这种寡核苷酸可以杂交到一个静止不带注释的 lncRNA。
这些 RNA 下拉实验中使用的细胞裂解物是从 10 6 到 10 7 细胞, 当与培养细胞工作时, 在使用组织时从1到10毫克. 细胞裂解物的制备需要根据组织或细胞类型进行调整, 这两个主要步骤必须优化: 即, 交联的步骤, 允许在 lncRNA 和它的分子伙伴之间形成共价键, 和超声波通过粉碎染色质降低粘度的步骤。
交联步骤的目的是确保所有的 RNA 目标保持关闭的 lncRNA 通过诱导形成一个网络的所有分子合作伙伴。将在 lncRNA 及其合作伙伴之间形成共价键的多聚甲醛处理步骤允许网络网格。在图表协议中, 建议如果使用核 lncRNA, 对整个细胞裂解进行第一次治疗, 并在分离的核酸分数34上进行第二次治疗。我们观察到, 这一补充步骤降低了探针的效率, 可能是通过减少细胞中的 lncRNA 可达性。因此, 多聚甲醛的网状程度必须考虑到所使用的细胞或组织类型、兴趣 lncRNA 的定位以及设计探针的效率。
在株溶藻细胞时, 染色质释放在裂解液中, 增加其粘度;然后, 有必要通过超声波来清除染色质, 以增加样品的流动性, 从而促进寡核苷酸探针的可获得性 lncRNA 的兴趣。然而, 超声波也将粉碎的 rna 提取与 lncRNA 的利益。因此, 重要的是要尽量减少超声波时间, 在这样的方式, 虽然它有效地降低了裂解液的黏度, 它也允许获取 RNA 片段的长度由 200-800 bp. 注意, 超声波时间将是高度取决于所使用的组织或培养细胞的数量和类型。
总之, 这里描述的过程在2-3 天之内允许捕获一个期望的 lncRNA 的 RNA 目标。再加上 RT qPCR, 这些方法将允许寻找一个特定的关联和调节的 mRNA 由期望的 lncRNA 作为候选的方法。对于全基因组的方法, rna 拉下实验可以通过高通量 RNA 序列分析, 允许检索与所需 lncRNA 相关的所有 rna。无论选择何种分析策略, rna 下拉程序都应为 lncRNAs 的 rna 调控提供新的重要知识。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了 Aix-马赛大学和 CNRS 的支持, 并得到辉瑞实验室的资助。
Bioruptor Plus | Diagenode | B01020001 | Sonicator |
Dynabeads My One | Thermo-Fisher | 65001 | Magnetic streptavidin beads |
Formamide | Thermo-Fisher | 15515-026 | |
Gel electrophoresis apparatus | Advance | Mupid-One | Gel electrophoresis apparatus |
Proteinase K | Sigma | P2308 | |
RNA XS purification kit | Macherey-Nagel | 740902 | RNA purificationkit |
RNAseOUT | Thermo-Fisher | 10777-019 | RNAse inhibitor |
Trizol | Thermo-Fisher | 15596018 | RNA purification |
Tube Rotator | Stuart | SB2 | Eppendorf tube rotator |
RNA to DNA | Thermo-Fisher | 4387405 | Reverse transcription kit |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 1725124 | qPCR reagent |
Applied 7500 Fast | Thermo-Fisher | 4351107 | qPCR apparatus |
Illumina TruSeq Stranded mRNA Sample Preparation kit | Illumina | 20020594 | DNA library construction kit |
Illumina NextSeq 500 | Illumina | SY-415-1002 | NGS system |