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长链非编码RNA靶标RNA的RNA下拉实验操作流程

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DOI：

10.3791/57379

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2018年4月10日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CNRS, CRN2M-UMR7286, Faculté de Médecine Nord, Aix-Marseille Université, 2Plate-forme d'imagerie MRI, UMS3426, CNRS 141, Institut de Génétique Humaine

本文内容

摘要

该RNA下拉法可用于鉴定长链非编码RNA（lncRNA）的RNA靶标。该方法基于在适当固定的组织或细胞系中，使用自制的、针对该lncRNA的特异性反义DNA寡核苷酸探针进行杂交，从而高效捕获该lncRNA的所有RNA靶标。

摘要

长链非编码RNA（lncRNA）是一类长度超过200个核苷酸且无明确读码框的调控性非编码RNA。尽管其生物学功能在很大程度上仍不清楚，但这类lncRNA的数量持续增加，目前估计人类可能拥有超过10,000种此类转录本。其中一些lncRNA已被证实参与基因表达的重要调控通路，这些通路不仅发生在转录水平，也涉及RNA共转录和转录后成熟过程中的多个步骤。在后一类情况下，必须鉴定出被lncRNA靶向作用的RNA分子。因此，开发一种能够鉴定与特定lncRNA直接或间接相关的RNA分子的方法具有重要意义。

本方案借鉴了先前已发表的可分离长链非编码RNA（lncRNA）及其相关染色质序列的实验方法，并加以改进以实现对与lncRNA相互作用的RNA分子的分离。我们确定该方案的效率依赖于两个关键步骤。第一步是设计特异性的反义DNA寡核苷酸探针，使其能够与目标lncRNA发生杂交。为此，我们通过生物信息学方法预测了lncRNA的二级结构，并针对内部碱基配对概率较低的区域设计了具有高亲和力的反义寡核苷酸探针。第二个关键步骤依赖于组织或培养细胞的固定条件，必须确保所有分子互作网络得以完整保存。结合高通量RNA测序技术，该RNA下拉（pull-down）方案可全面鉴定目标lncRNA所关联的整个RNA相互作用组。

引言

本方法的总体目标是鉴定长链非编码RNA（lncRNA）的RNA分子互作伙伴。lncRNA是指长度超过200个核苷酸且无明确阅读框的RNA序列。已有研究表明，部分lncRNA参与基因表达调控，不仅在转录水平发挥作用，还参与RNA共转录及转录后成熟过程中的多个步骤。在后一种情况下，lncRNA的分子互作伙伴即为有待鉴定的RNA分子。因此，建立一种能够鉴定与特定lncRNA直接或间接关联的RNA分子的方法至关重要。

既往已发表的方法，如通过RNA纯化进行染色质分离（Chromatin Isolation by RNA Purification, ChIRP）1,2 和RNA靶标捕获杂交分析（Capture Hybridization Analysis of RNA Targets, CHART）3,4，可实现高通量鉴定与特定长链非编码RNA（lncRNA）结合的蛋白质及其在基因组上的结合位点。在这两种方法中，首先使目标lncRNA与生物素标记的互补寡核苷酸杂交，然后利用链霉亲和素磁珠分离该复合物。这两种技术之间的主要区别在于靶向lncRNA的探针设计。ChIRP方法借鉴了RNA荧光原位杂交（RNA FISH）的策略，通过设计一组短的互补DNA寡核苷酸探针，覆盖目标lncRNA的全长序列。相比之下，CHART方法则基于RNase H作图分析，用于探测lncRNA上可进行杂交的可及位点。

本文提出的用于设计反义DNA生物素化寡核苷酸探针的方法，利用长链非编码RNA（lncRNA）二级结构的生物信息学建模5，筛选出对内部碱基配对概率较低区域具有高亲和力的探针。该方法相较于基于覆盖式寡核苷酸探针池的方法2成本更低，且比基于RNA酶H敏感性的方法4更节省时间。

随着越来越多的证据表明长链非编码RNA（lncRNA）参与转录后基因调控6，开发一种能够捕获特定lncRNA靶向RNA的方法具有重要意义。此外，为了适用于大多数应用场景，该方法已在培养细胞和组织提取物中均进行了优化。

方案

所有操作均严格遵循欧洲经济共同体关于实验动物护理和使用的指令（86/609/EEC 和 2010/63/UE），并在授予 D. Becquet 的许可证下进行（罗讷河口省省长办公室，授权编号：13-002）。

1. 探针设计

  1. 利用目标lncRNA的初级序列，在 "RNAstructure 网络服务器"5.
    注意：在本平台上可使用不同的算法。在探针设计方面效果最佳的三种预测工具是： "折叠" （自由能最低的结构）， "最大期望值" （高度可能的碱基对），以及 "Probnot" （包含假结的可能碱基对）。可对这三项分析进行执行与比较。其他网络服务器，例如 Vienna RNA 网络套件7，也可使用。
    1. 选择内部碱基配对概率较低的区域，并针对这些区域设计长度为25个碱基、具有强结合亲和力的反义寡核苷酸探针。
      注意：这些探针的GC含量应介于40%至60%之间。使用序列比对搜索工具（Blast）确认所选的反义寡核苷酸探针不会识别在选定细胞系统中表达的其他RNA的核苷酸序列。
  2. 设计一条25个碱基的非特异性DNA寡核苷酸探针，该探针对目标长链非编码RNA及其他目标基因组中的RNA序列均无亲和性。
  3. 订购在3'端带有生物素的探针。
    注意：为了减少空间位阻，必须使用三乙二醇间隔基增加寡核苷酸与生物素之间的距离。为获得最佳结果，并能够评估下拉实验结果的特异性，建议设计3种不同的反义寡核苷酸探针，并通过实验比较它们的效率。

2. 交联

  1. 培养细胞交联
    1. 将GH4C1垂体生长催乳激素细胞培养于添加15%马血清和2%胎牛血清的Ham's F10培养基中。在78.5 cm2培养皿中培养至细胞融合，约为1 × 107个细胞。
    2. 从融合的GH4C1 78.5 cm2培养皿中移除细胞培养基，用相当于1倍培养基体积的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗一次。
    3. 用PBS中配制的1%多聚甲醛溶液（每78.5 cm2培养皿使用10 mL）固定细胞；该溶液必须使用4%多聚甲醛储备液新鲜配制。在室温（RT）下振荡交联10分钟。
      注意：多聚甲醛（PFA）具有毒性，操作时需格外小心。
    4. 加入1.25 M甘氨酸溶液（每10 mL多聚甲醛溶液加入1 mL，即总体积的1/10）以淬灭多聚甲醛反应；在室温下振荡5分钟。
    5. 通过抽吸弃去液体，并用相当于1倍培养基体积的PBS冲洗两次，每次5分钟。
    6. 加入相当于培养基体积1/10的PBS，用细胞刮刀收集细胞，然后转移至离心管中。
    7. 在4 °C下以510 g离心5分钟。
    8. 尽可能彻底移除上清液。
    9. 如需长期保存，可将细胞沉淀在-80 °C下无限期储存。
  2. 组织交联
    1. 将5 mg新鲜获取的小鼠垂体组织置于用PBS稀释的1%多聚甲醛溶液中（溶液体积约为组织体积的10倍），在室温下振荡10分钟。
    2. 加入1.25 M甘氨酸溶液（每10 mL多聚甲醛溶液加入1 mL）以淬灭多聚甲醛反应，在室温下振荡5分钟。
    3. 通过抽吸弃去液体，并用PBS冲洗两次（每次体积约为组织体积的10倍）。尽可能彻底移除上清液。
    4. 将交联后的组织在-80 °C下无限期保存。

3. 细胞或组织裂解

  1. 配制裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.0，10 mM EDTA，1% SDS，并添加200 U/mL RNA酶抑制剂溶液和蛋白酶抑制剂混合物5 µL/mL）。
  2. 为在不预先解冻的情况下获得裂解样品，用此缓冲液重悬细胞沉淀或交联组织（每100 mg细胞沉淀或组织约使用1 mL缓冲液）。由1 × 107个细胞获得的细胞沉淀可产生约含20 mg蛋白质的裂解样品。
    注意：根据所用组织类型，可能需要增加机械破碎步骤。在此情况下，必须注意避免样品在该附加步骤中发生过热。

4. 超声处理

  1. 超声条件的优化
    1. 将超声仪设置为2至5个循环，每个循环包括30秒开启和30秒关闭。
    2. 在稀释的裂解样品（稀释倍数为½或¼，相当于约10或5 mg蛋白）上进行测试，以优化超声条件。将稀释后的裂解样品置于4 °C水浴中，并开始超声循环。
    3. 使用RNA纯化试剂盒或RNA提取试剂（例如，Trizol）纯化RNA。
    4. 将全部纯化的RNA上样至含TBE缓冲液的1%琼脂糖凝胶中进行电泳，检测RNA片段长度。片段长度应在200至800 bp之间。
      注意：反义寡核苷酸探针的效率可能随RNA片段大小而变化。因此建议在不同超声条件下检测探针的效率。
  2. 裂解样品的超声处理
    1. 将相当于20 mg蛋白的裂解样品（来自步骤3.2）置于4 °C水浴中，并按照步骤4.1中优化的条件开始超声处理。
    2. 超声结束后立即在4 °C下以12,000 g离心5分钟，将上清液转移至新的离心管中。
      注意：为确保均一性，可在该步骤将多个上清液重复样本合并后再重新分配。

5. RNA 拉下实验

  1. 第1天 – 杂交步骤
    1. 向超声处理后收集的上清液中加入2倍体积的杂交缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.0，750 mM NaCl，1 mM EDTA，1% SDS，临时加入15%甲酰胺）。涡旋混匀。
    2. 将每份样品中的20 µL转移至离心管中（输入样品），于-20 °C保存。
    3. 向每份样品中加入100 pmol的生物素标记寡核苷酸探针（特异性或非特异性；见表1）。在室温下于旋转混合仪上中等振荡孵育4至6小时。
    4. 加入50 µL磁性链霉亲和素珠，同时添加RNA酶抑制剂溶液（200 U/mL）和蛋白酶抑制剂混合液（5 µL/mL）。
    5. 在室温下于旋转混合仪上中等振荡过夜孵育。
  2. 第2天 – RNA分离步骤
    1. 使用磁力架将磁珠与细胞裂解液分离，弃去上清液，并用900 µL洗涤缓冲液（0.5% SDS，2× SSC）洗涤磁珠。在室温下于旋转混合仪上振荡5分钟，重复洗涤5次。
    2. 最后一次洗涤后，再次倾去液体，向样品中加入95 µL蛋白酶K缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 7.0，100 mM NaCl，1 mM EDTA，0.5% SDS）和5 µL蛋白酶K（20 mg/mL）。
    3. 将输入样品（20 μL）在冰上解冻，加入75 µL蛋白酶K缓冲液和5 µL蛋白酶K（20 mg/mL）。
    4. 所有样品在50 °C下孵育45分钟，随后在95 °C下孵育10分钟。
    5. 将样品在冰上冷却3分钟后，使用磁力架将磁珠与RNA分离。保留上清液，弃去磁珠。
    6. 使用RNA纯化试剂盒对RNA进行纯化，该试剂盒应包含DNA消化步骤。将纯化后的RNA于-80 °C保存。
    7. 使用逆转录试剂盒进行逆转录定量PCR（RT-qPCR），随后使用特异性引物进行qPCR（表1）。
    8. 构建两个DNA文库，分别对应于使用两种特异性Neat1探针获得的两组RNA池（表1）。在下一代测序系统上进行测序。

结果

最近多项研究表明，长链非编码RNA（lncRNA）在几乎所有重要的生物学过程中均发挥关键作用，这种作用是通过调控基因表达实现的，包括转录水平和转录后水平的调控；在后一种情况下，RNA本身可能成为lncRNA的作用靶点6。

长链非编码RNA核富集丰富转录本1（Neat1）与多种神经病理学疾病相关，如额颞叶痴呆、肌萎缩侧索硬化症或癫痫8,9,10，并且在不同癌症中也存在调控异常11,12.

该lncRNA还被证实是特定核结构——副斑点（paraspeckles）的结构组分，并参与基因表达的转录后昼夜节律调控13。副斑点存在于所有细胞核中，其形成不仅围绕Neat1（Neat1对其形成至关重要），还围绕多种RNA结合蛋白（RBP）14，已知其能够将RNA靶标滞留在细胞核内15。副斑点的形成依赖于不同组分之间的相互作用，且该过程表现出昼夜节律性，从而驱动RNA靶标的节律性核滞留13。副斑点对RNA靶标的核滞留可能通过与RBP结合或直接通过RNA/RNA相互作用实现，但副斑点所靶向的RNA范围仍有待确定。为了鉴定被Neat1直接或间接靶向的RNA，研究人员设计了一种RNA下拉（pull-down）实验方案，可在培养细胞及组织样本中分离并鉴定所有Neat1的RNA靶标（技术流程的图示见图1）。

该方案还成功应用于鉴定另一种长链非编码RNA——转移相关肺腺癌转录本1（Malat1）的RNA靶标。Malat1是一种高度保守且表达丰富的长链非编码RNA，存在于核小斑点中，与多种RNA剪接因子共定位。已知Malat1参与调控多种新生pre-mRNA的剪接过程16,17。

使用此处描述的探针设计策略生成了特异性（SO）和非特异性寡核苷酸（NSO）探针。该策略基于选择在长链非编码RNA（lncRNA）二级结构预测中内部碱基配对概率较低的区域，并针对这些区域设计具有强结合亲和力的特异性探针。作为这些生物信息学预测的代表性结果，图2展示了Neat1序列（第1,480至2,000个核苷酸）预测的二级结构示意图，以及两个设计的SO探针的位置。

设计的探针分别靶向大鼠 GH4C1 培养细胞中的 Neat1 或 Malat1，以及小鼠垂体组织提取物中的 Neat1（表 1）。相对于输入样本，计算了非特异性探针和特异性探针在 Neat1 或 Malat1 上的相对富集程度。图 3 展示了特异性探针在大鼠 GH4C1 垂体细胞系中（图 3A）以及小鼠垂体组织提取物中（图 3B）富集 Neat1 的效率。当采用探针设计流程生成靶向 Malat1 的特异性寡核苷酸（SO）探针时，获得了一个高效的探针，而另一个探针效率不足，已被弃用（图 4A）。

在进行RNA下拉实验并随后进行RT-qPCR实验后，使用特异性引物检测到的部分RNA（表1) 在GH4C1提取物中被证实与Neat1或Malat1相关。在GH4C1细胞提取物中与Neat1相关的RNAs也在垂体组织提取物中被证实与Neat1相关。事实上，在Neat1 RNA pull-down实验后，Malat1在GH4C1细胞系以及小鼠垂体组织提取物中均被发现是Neat1的靶标。图 5A）。相反，在GH4C1细胞中，使用特异性探针进行Malat1 RNA下拉后，Neat1显著富集图 4B）。通过强调这两种lncRNA之间的密切关系，这些结果与Malat1基因敲除小鼠中观察到的Neat1 RNA表达变化所提示的Neat1与Malat1潜在共调控作用相一致18,19. 两种主要垂体激素的转录本，生长激素（Gh）（图 5B）和催乳素（Prl）（图5C在GH4C1细胞和垂体提取物中，使用特异性探针进行Neat1 RNA下拉后，两种激素均显著富集，提示Neat1可能对这两种激素具有调控作用。比较所用的两种特异性探针发现，其效率可能因所针对的RNA靶标不同而有所差异。图 5B 和 图5C这些结果强调了设计多个特异性探针的必要性，以便筛选出不仅在富集目标lncRNA方面效率最高，而且在其RNA靶标富集方面效率也最佳的探针。

RNA 沉淀法还可结合 RNA 高通量测序，以获得目的长链非编码 RNA（lncRNA）的全面 RNA 靶标列表13。已对上述两种特异性探针进行 Neat1 RNA 沉淀后的 GH4C1 垂体细胞进行了 RNA-seq 分析。需要注意的是，若使用阴性对照探针（NSO）进行 RNA 沉淀后回收的 RNA 量足以构建文库，则该阴性对照也可进行 RNA-seq 分析。但在先前的实验中并未达到此条件13。使用特异性探针构建的文库通过 Tophat/cufflinks 分析流程进行分析20，仅纳入每百万映射读段每千碱基片段数（FPKM）大于 1 的转录本。将两种靶向 Neat1 的特异性探针所得结果列表进行交叉比对，以评估结果的特异性（表 1）。共发现 4,268 个基因与旁斑（paraspeckles）相关，占 GH4C1 细胞中表达转录本的 28%13。与 qPCR 分析结果一致（图 5A-C），Gh、Prl 和 Malat1 的转录本均被发现与 Neat1 相互作用。因此，RNA 沉淀法已被证实为研究 lncRNA 与其 RNA 靶标之间相互作用的有效工具。

figure-results-1
图1：RNA 拉下实验流程的图示。 第一天，细胞或组织经甲醛交联后裂解并进行超声处理，随后加入生物素标记的特异性探针进行杂交。然后加入磁性链霉亲和素珠，以分离出特异性结合的物质，使其与其余细胞裂解液分离。第二天，使用磁铁分离磁珠，并多次洗涤。通过去交联步骤回收RNA，纯化后用于RT-qPCR或RNA-seq分析。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-2
图2：生物信息学资源预测的 Neat1 序列（核苷酸1,480至2,000）的二级结构（RNAstructure 网络服务器；最低自由能结构）。 结构根据碱基配对的概率程度进行着色。两个寡核苷酸探针（SO1 和 SO2）以红色标示，位于 Neat1 RNA 结构上。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图3：Neat1 富集相对于输入样本的 qPCR 验证。 使用两种不同的特异性探针（GH4C1 细胞使用 SO1-rn 和 SO2-rn，垂体组织使用 SO1-mm 和 SO2-mm）对 GH4C1 大鼠细胞（A）和小鼠垂体组织提取物（B）进行 Neat1 RNA 拉下实验后，通过 qPCR 验证 Neat1 富集情况，并与非特异性探针（GH4C1 细胞使用 NSO-rn，垂体组织使用 NSO-mm）进行比较。结果为 3 至 10 次实验的均值 ± 标准误。 请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-4

图4：通过Malat1 RNA下拉实验后，Malat1和Neat1相对于输入样本富集的qPCR验证。 在GH4C1大鼠细胞中，使用两种不同的特异性探针（SO3-rn和SO4-rn）与一种非特异性探针（NSO-rn）进行Malat1 RNA下拉实验后，对Malat1（A）和Neat1（B）相对于输入样本的富集情况进行qPCR验证。结果来自3次实验，以均值±标准误表示。 请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-5
图5：Neat1 RNA 拉取后 Malat1、Gh、Prl 富集程度相对于输入样本的 qPCR 验证。 使用不同特异性探针在 GH4C1 大鼠细胞和小鼠垂体组织提取物中进行 Neat1 RNA 拉取后，通过 qPCR 验证 Malat1（A）、Gh（B）、Prl（C）相对于输入样本的富集情况，以非特异性探针作为对照。结果为 3 至 8 次实验的平均值 ± 标准误。 请点击此处查看该图的放大版本。

探针名称序列
NSO-RnTAAAATACCATTTGATGTTTGAAATTAT
SO1-RnCTCCACCATCATCAATCCTCTGGAC
SO2-RnGCCTTCCCACATTTAAAAACACAAC
SO3-RnAACTCGTGGCTCAAGTGAGGTGACA
SO4-RnAAGACTCTCAGGCTCCTGCTCATTC
NSO-mmGTTTGTGGTTTAACAGTGGGAAGGC
SO1-mmGCCTTCCCACTGTTAAACCACAAAC
SO2-mmCTCACCCGCACCCCGACTCCTTCAA
qPCR 引物 ：
Rattus norvegicus
Neat1AAGGCACGAGTTAGCCGCAAAT
TGTGCACAGTCAGACCTGTCATTC
Malat1GAAGGCGTGTACTGCTATGCTGTT
TCTCCTGAGGTGACTGTGAACCAA
Gh1CCGCGTCTATGAGAAACTGAAGGA
GGTTTGCTTGAGGATCTGCCCAAT
PrlTGAACCTGATCCTCAGTTTGGT
AGCTGCTTGTTTTGTTCCTCAA
Mus musculus
Neat1TGGGCCCTGGGTCATCTTACTAGATA
CACAGCTGTTCCAATGAGCGATCT
Gh1CTCGGACCGTGTCTATGAGAAACTGA
TTTGCTTGAGGATCTGCCCAACAC
PrlTGAACCTGATCCTCAGTTTGGT
AGCTGCTTGTTTTGTTCCTCAA

表1：DNA寡核苷酸探针和qPCR引物序列

讨论

长链非编码RNA（lncRNA）因其数量众多且具有高度多样性，构成了一个广阔的研究领域，而它们的大多数功能仍有待揭示。这些lncRNA中有许多定位于细胞核内，其中部分通过转录或转录后调控机制参与基因表达的调控通路。当前该领域的一个重要挑战是阐明lncRNA在RNA转录后加工过程中的作用。为此，必须鉴定出被lncRNA靶向的RNA分子。受先前关于lncRNA与染色质相互关联研究的启发，我们开发了一种可用于鉴定与特定lncRNA结合的RNA分子的实验方法。该方法称为RNA下拉实验（RNA pull-down），其成功主要依赖于两个关键步骤：一是反义DNA寡核苷酸探针的设计，这些探针必须能够特异性且唯一地与目标lncRNA杂交；二是组织或细胞固定的条件，必须保持所有分子伴侣之间相互作用网络的完整性。

既往发表的实验方案提供了分离长链非编码RNA（lncRNA）及其相关染色质序列的方法（ChIRP1,2、CHART3,4）。在这些方案中，采用了不同的策略来设计针对目标lncRNA的反义DNA生物素化寡核苷酸探针。在ChIRP实验流程中，作者使用一组覆盖目标lncRNA全长的DNA生物素化寡核苷酸探针池，但排除了所有冗余和非特异性的探针1,2。而在CHART方案中，作者首先鉴定出lncRNA上更易于发生杂交的区域，并据此设计靶向这些区域的捕获寡核苷酸。这些区域的选择依据是其对RNase-H的敏感性。实际上，利用RNase-H能够在RNA-DNA杂交位点水解RNA的特性，与lncRNA中可及位点杂交的寡核苷酸会形成RNA-DNA杂合体，从而导致lncRNA被酶切。作者从中筛选出三个候选捕获寡核苷酸，并将其混合使用3,4。

我们设计反义DNA生物素化寡核苷酸探针所采用的方法与CHART方案中的方法相近，但并非根据RNase H敏感性来选择目标lncRNA的可杂交区域，而是依据生物信息学模拟预测的lncRNA二级结构中内部碱基配对概率较低的区域进行选择。需要注意的是，不同的算法会预测出不同的二级结构，因此应选择那些在多种预测的二级结构中均能与lncRNA可及序列发生杂交的探针。使用三种设计的特异性探针混合物或单独使用单一探针均可获得相同的结果。因此，建议使用两个独立的特异性探针，并将两种探针均呈现的阳性结果视为可靠结果。综上所述，在方法开发初期，为了获得最佳结果并能够评估下拉实验结果的特异性，建议设计3种不同的反义寡核苷酸探针，并通过实验比较它们的效率，尤其是因为探针效率可能受到细胞裂解液制备过程的影响。然而，我们所采用的基于lncRNA二级结构生物信息学建模的探针设计方法，相比基于覆盖式寡核苷酸探针池的方法2成本更低，且比基于RNase H敏感性的方法4更节省时间。

还应使用以下任一种阴性捕获寡核苷酸进行阴性对照实验：正义链DNA生物素化寡核苷酸探针、随机序列寡核苷酸探针，或靶向无关RNA的寡核苷酸。由于天然反义转录本长链非编码RNA（lncRNA）的存在，使用正义链寡核苷酸探针有时可能不恰当。无论选择哪种寡核苷酸探针作为阴性对照，都必须通过BLAST分析确认其不会与已知RNA发生杂交，并需注意该寡核苷酸仍可能与尚未注释的lncRNA发生杂交。

在进行RNA下拉实验时，所用的细胞裂解物来源于培养细胞的为106至107个细胞，来源于组织的则为1至10 mg。细胞裂解物的制备需根据所使用的组织或细胞类型进行调整，其中两个关键步骤需要优化：一是交联步骤，该步骤可使lncRNA与其分子伴侣之间形成共价键；二是超声处理步骤，通过剪切染色质以降低裂解物黏度。

交联步骤的目的是通过在所有分子伴侣之间形成网络，确保所有RNA靶标始终与长链非编码RNA（lncRNA）紧密结合。使用甲醛处理可使lncRNA与其结合伴侣之间形成共价键，从而实现网络的交联。 在CHART实验方案中，曾建议在研究核内lncRNA时，先对全细胞裂解液进行第一次甲醛处理，再对分离出的核酸组分进行第二次处理3,4。我们发现，这一额外步骤会降低探针的效率，可能是由于减少了细胞内lncRNA的可及性。因此，甲醛交联的程度需根据所使用的细胞或组织类型、目标lncRNA的定位以及所设计探针的效率进行适当调整。

在裂解细胞时，染色质会释放到裂解液中，从而增加其黏度；因此需要通过超声处理将染色质剪切，以提高样品的流动性，进而促进寡核苷酸探针对目标长链非编码RNA（lncRNA）的可及性。然而，超声处理也会同时剪切与目标lncRNA一同提取的其他RNA。因此，必须尽量缩短超声时间，使其在有效降低裂解液黏度的同时，获得长度在200–800 bp之间的RNA片段。需要注意的是，超声时间将高度依赖于所使用的组织或培养细胞的类型及其数量。

综上所述，本文所述方法可在2至3天内捕获特定长链非编码RNA（lncRNA）所结合的RNA靶标。结合逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR），这些方法可作为一种候选策略，用于检测特定mRNA是否受到目标lncRNA的特异性结合与调控。若采用全基因组范围的研究策略，可通过高通量RNA测序分析RNA下拉实验结果，从而系统性地鉴定出与目标lncRNA相互作用的所有RNA分子。无论选择何种分析策略，RNA下拉实验均有望为lncRNA介导的RNA调控机制提供新的重要见解。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由艾克斯-马赛大学和法国国家科学研究中心（CNRS）支持，并获得辉瑞实验室资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Bioruptor PlusDiagenodeB01020001超声波破碎仪
Dynabeads My OneThermo-Fisher65001磁性链霉亲和素珠
甲酰胺赛默飞世尔科技15515-026
凝胶电泳装置推进Mupid-One凝胶电泳装置
蛋白酶KSigmaP2308
RNA XS 纯化试剂盒Macherey-Nagel740902RNA纯化试剂盒
RNAseOUTThermo-Fisher10777-019RNase抑制剂
Trizol赛默飞世尔科技15596018RNA纯化
试管旋转仪StuartSB2Eppendorf管旋转仪
RNA 到 DNAThermo-Fisher4387405逆转录试剂盒
iTaq Universal SYBR Green Supermix伯乐（BioRad）1725124qPCR 试剂
Applied 7500 Fast赛默飞世尔科技4351107qPCR 仪器
Illumina TruSeq Stranded mRNA 样本制备试剂盒Illumina20020594DNA文库构建试剂盒
Illumina NextSeq 500IlluminaSY-415-1002NGS 系统

参考文献

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