通过口服递送双链RNA在韧皮部及刺吸式口器昆虫中诱导RNA干扰的方法

摘要

本文展示了通过植物维管组织口服递送双链RNA（dsRNA）以实现韧皮部汁液取食昆虫RNA干扰（RNAi）的新型技术。

摘要

韧皮部及植物汁液取食性昆虫通过侵入农作物和果实以获取营养，在此过程中对粮食作物造成损害。半翅目昆虫是一类重要的农业害虫，通过取食韧皮部汁液对作物造成破坏。其中，褐臭蝽（BMSB）， Halyomorpha halys （异翅亚目：蝽科）和亚洲柑橘木虱（ACP）， Diaphorina citri Kuwayama（半翅目：Liviidae）是一类被引入北美的半翅目昆虫害虫，在当地已成为多种高价值经济作物、大田作物、主粮作物以及柑橘类水果的重要入侵性农业害虫；当其在室内聚集时，亦成为令人困扰的滋扰性害虫。由于多种害虫已对杀虫剂产生抗性，促使人们开发替代性的害虫管理策略。双链RNA（dsRNA）介导的RNA干扰（RNAi）是一种用于功能基因组学研究的基因沉默机制，同时具备作为害虫管理工具的应用潜力。外源合成的双链RNA或小干扰RNA（siRNA）可通过降解与之序列同源的内源RNA，引发高效特异的基因沉默。要将RNAi有效且环境友好地应用于半翅目昆虫的生物防治，作为分子生物杀虫剂使用，需要 体内 通过饲喂方式递送dsRNA。本文展示了将dsRNA递送至昆虫的方法：通过浸渍法将dsRNA载入青豆，以及通过口服摄入吸收基因特异性dsRNA。我们还概述了非转基因植物递送策略，包括叶面喷施、根部浇灌、树干注射以及黏土颗粒载体，这些方法均有助于dsRNA的持续释放。经口服摄入递送dsRNA被证实可有效达到剂量要求，显著降低靶基因的表达水平，例如保幼激素酸O-甲基转移酶（JHAMT）和卵黄原蛋白（Vg）。这些创新性方法为利用dsRNA进行作物保护及应对害虫治理中的环境挑战提供了可行策略。 关键词：dsRNA递送，饲喂法，青豆浸渍，口服摄入，叶面喷施，根部浇灌，树干注射，黏土颗粒，非转基因植物，RNA干扰，作物保护，害虫管理

引言

半翅目昆虫因其能够迅速大量繁殖并在植物间传播病害，已成为对农业具有重大经济影响的害虫。褐臭虫（H. halys Stål）是一种入侵性害虫，于1996年首次被报道在宾夕法尼亚州阿伦敦发现，其原产于亚洲（中国、中国台湾、韩国和日本），是意外引入西半球的¹。自引入以来，褐臭虫已在43个州被发现，其中以中大西洋地区（特拉华州、马里兰州、宾夕法尼亚州、新泽西州、弗吉尼亚州和西弗吉尼亚州）种群密度最高，同时也在加拿大和欧洲出现，对农业生产构成潜在威胁²。作为一种多食性害虫，褐臭虫可危害约300种已知的寄主植物，包括苹果、葡萄、观赏植物、种子作物、大豆和玉米等高价值作物。其危害主要源于一种称为“刺破并冲洗”的取食方式，即利用针状口器刺入寄主作物，获取维管组织中的营养物质^2,3。此外，褐臭虫也是一种室内害虫，在秋季至冬季期间可能进入学校和住宅等生活区域栖息²。研究表明，褐臭虫释放的化学物质和空气传播的过敏原可引发果树作物作业人员的过敏反应，还可能导致敏感个体出现接触性皮炎、结膜炎和鼻炎等过敏性疾病^4,5。另一种半翅目昆虫——柑橘木虱（D. cit....

方案

1. 棒蝽饲养

1. 按照标准实验室操作和先前所述方法饲养BMSB昆虫⁶³。
2. 在温室（22 °C）和自然光照条件下，以Citrus macrophylla饲养ACP（D. citri）昆虫。使用羽化后约5–7天的成虫ACP。

2. 基因区域的选择与 体外 dsRNA的合成

1. 从先前发表的转录组谱中筛选出BMSB特异性基因³².
2. 确保所选目标区域在200至500个碱基对之间。
3. 使用下述条件对基因组DNA进行聚合酶链式反应（PCR），以扩增目标基因的相关片段。参见 表1 用于基因特异性寡核苷酸。
   1. PCR反应：在0.25 mL的PCR管中，加入5 µL 10X PCR缓冲液、4 µL dNTP混合液（各2.5 mM）、2 µL DNA模板（50 ng/µL）、引物1和引物2各2.5 µL（10 µM）、0.25 µL DNA聚合酶（5 U/µL），并用无DNase/RNase的水补足至50 µL。
   2. PCR条件：将PCR反应在95 °C下预变性3 min，随后进行30个循环，每个循环包括98 °C变性10 s、55 °C退火30 s、72 °C延....

结果

通过喂食在BMSB中实现植物介导的dsRNA递送 4^th 用于测试分子生物农药（基于RNAi技术）对入侵性害虫防治效果的若虫龄期被测对象。褐臭虫（BMSB）利用其针状口器通过一种称为“刺破-冲洗”的机制取食，对农作物造成严重损害。细长的有机青豆， P. vulgaris L. 用于测试是否可递送营养物质或dsRNA 体内 通过取食对BMSB³将绿豆段浸入无DNase/RNase的水或含绿色食用色素的水溶液中，以检测在BMSB中的递送效果图1A）。绿色食用色素被用作可视化指示剂以模拟dsRNA。由于绿色染色溶液通过韧皮部的毛细作用流动，芸豆的维管组织被绿色食用色素充分浸润。⁶². 观察到BMSB若虫通过将口针插入青豆的维管组织，取食青豆的各个部分（图1B）。在饲喂了浸泡过绿色食用色素的豆子的昆虫中，第2天.......

讨论

RNAi 已被证明是研究基因生物学功能和调控的重要工具，在害虫管理方面具有巨大应用潜力^{19,68,69,70,71}。针对特定昆虫物种，选择合适的靶基因进行沉默，以及确定相应的dsRNA递送方法，均至关重要。将dsRNA递送至昆虫体内的最佳方法必须通过实验确定，同时需优化递送剂量，因为不同方法可能各自具有优势和局限性。为了开发出最终可用于环境释放的分子生物杀虫剂，必须具备一种可行、高效且具有优势的递送方式。例如，外敷施用dsRNA已被证明在柑橘和葡萄上的昆虫防控中具有良好的递送效果^42,44。一些创新策略，如利用饵剂、蔗糖溶液、酵母或细菌生产dsRNA供昆虫直接摄食，将dsRNA外敷喷洒于植物表面，或.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
褐臭虫（H. halys）昆虫	USDA
柑橘木虱（D. citri）昆虫	USDA
有机青豆	不适用
柑橘植株	USDA
次氯酸钠溶液	J.T. Baker
绿色食用色素	McCormick & Co., Inc
Thermo Forma 培养箱	Thermo Fisher Scientific
Magenta 培养容器（培养用）	Sigma
引物	IDT DNA
SensiMix SYBR	Bioline
qPCR ABI 7500	Applied Biosystems
喷雾瓶	不适用
封口膜（Parafilm）	American Can Company
TaKaRa Ex Taq	Clontech
QIAquick	Qiagen