本文介绍了一种标准免疫学技术（CFSE标记的OT-I增殖）的应用，旨在快速监测佐剂介导的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）在体内的生成。in vivo条件下对CTL功能的快速评估，对于针对胞内病原体的预防性疫苗以及治疗性癌症疫苗的研发具有重要意义。
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摘要
摘要
现代亚单位疫苗的评估表明，中和抗体的产生虽重要，但不足以作为佐剂筛选的唯一标准。因此，迫切需要兼具体液免疫和细胞免疫刺激能力、并能促进细胞毒性T淋巴细胞（CTL）应答的佐剂。因而，准确监测可诱导交叉提呈并进而增强CTL生成的佐剂候选物，是疫苗研发中的关键步骤。本文介绍一种利用SIINFEKL特异性（OT-I）T细胞监测模型抗原卵清蛋白（OVA）交叉提呈的方法应用。 体内 在不同佐剂候选物存在的情况下。该方法可用于快速筛选具有最佳交叉启动能力的佐剂。CD8⁺ T细胞的增殖+ T细胞是交叉提呈最具有价值的指标，也被视为佐剂诱导交叉提呈的相关标志。该特性可在不同免疫器官（如淋巴结和脾脏）中进行评估。通过监测细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的生成程度，可进一步了解局部（主要是引流淋巴结）或全身性（远端淋巴结和/或脾脏）免疫应答的性质。该技术还可进行多种改良，用于测试可抑制特定交叉提呈通路的药物，并可在不同品系的普通小鼠及基因修饰小鼠中应用。总之，本文所介绍的应用方法将对工业界或学术界的疫苗实验室在疫苗研发过程中开发或优化化学佐剂具有重要帮助。
引言
能够诱导细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的疫苗是已开发用于对抗某些类型癌症的关键治疗手段1。CTL在针对胞内病原体的预防性疫苗中也具有重要作用2。此外，CTL是少数在新生儿等高危人群中仍具有功能活性的免疫防御机制之一3,4，这些人群也依赖CTL来抵抗生命早期的感染5。在此方面，曾开发出针对呼吸道合胞病毒（RSV）的疫苗，其所使用的佐剂（氢氧化铝）无法诱导CTL应答，结果导致疫苗完全失败，并在婴儿感染后引发严重并发症6。这些不良疫苗效应可通过CD8+ T细胞应答得以逆转7。我们先前已证明，某些干扰素基因刺激因子（STING）激动剂所诱导的主要细胞因子（I型干扰素）对于这些佐剂引发的CTL应答至关重要8，部分研究通过检测疫苗接种后OT-I T细胞的增殖情况，并将该结果作为评估长期免疫程序中CTL诱导能力的指标9。通过羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）染料稀释法检测野生型（WT）C57BL/6受体小鼠体内OT-I CD8+ T细胞的增殖情况，可有效评估疫苗佐剂诱导SIINFEKL交叉呈递的能力（SIINFEKL为卵清蛋白OVA的优势免疫肽）。该技术的多种变体被广泛用于评估OT-I CD8+和OT-II CD4+ T细胞的增殖情况。例如，该方法可用于缺失特定细胞因子的基因敲除（KO）小鼠，或用于检测野生型动物在抗原再次刺激后的疫苗效力。我们设计了一项短期实验方案（为期4天），即在将CFSE标记的OT-I CD8+ T细胞被动转移后，进行一次皮下（s.c.）免疫，注射剂量为50 µg无内毒素OVA，并联合待测佐剂（图1）。接种后48小时进行结果监测，可可靠地验证该佐剂诱导CTL应答的能力。通过该策略，可在免疫后评估引流淋巴结中局部免疫应答的强度，同时通过检测脾脏（或远端淋巴结）中的CTL活性来评估应答的广度。
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方案
本研究使用的所有小鼠均来自 C57BL/6 背景。所有动物均饲养于无病原体环境中。所有实验均依照德国动物保护法（TierSchG BGBl. I S 1105；1998年5月25日）的规定进行，并获得下萨克森州动物实验伦理委员会及州级主管部门（下萨克森州消费者保护与食品安全局）的批准，许可编号为 33.4-42502-04-13/1281 和 162280。
1. OT-I T 细胞的 CFSE 染色与过继转移
注意：OT-I 小鼠是通过转基因技术获得的动物，其表达一种具有固定 α 和 β 链的 T 细胞受体（TCR），该受体可识别卵清蛋白（OVA）的免疫显性肽 SIINFEKL10,11。因此，与正常小鼠或 OVA 疫苗免疫小鼠（≤ 1%）13 相比，这些小鼠体内含有极高比例的 SIINFEKL 特异性 CD8+ T 细胞（97%）12。
- 从表达T淋巴细胞特异性Thy1a（Thy1.1）等位基因的OT-I小鼠中分离可示踪的CD8+ T细胞：
- 通过吸入CO2并辅以颈椎脱位法处死6-9周龄的OT-I小鼠14。使用手术剪剪开皮肤，借助手术钳和镊子将皮肤从身体上剥离，取出脾脏和主要淋巴结（仅包括腹股沟、腋窝和颈部成对淋巴结），并将其置于各含一个100 µm孔径筛网杯的培养皿（60 × 15 mm）中，用于组织研磨和细胞释放。
- 将每个含筛网杯的培养皿置于3-5 mL预冷的完全RPMI培养基（RPMI 1640，含10% v/v胎牛血清、100 U/mL青霉素、50 µg/mL链霉素）中，并保持在冰上。
- 使用注射器活塞或类似的无菌工具研磨器官（无需预先切割），并将所得的单细胞悬液收集至15 mL离心管中。
- 在4 °C条件下，以300 × g离心10分钟，弃去上清液。用10 mL冷PBS洗涤细胞一次，随后通过将沉淀重悬于1 mL/脾脏体积的氯化铵裂解缓冲液（ACK缓冲液， commercially available）中裂解脾脏来源的红细胞。冰上孵育1.5分钟后，再次以相同方式用10 mL冷PBS离心洗涤细胞一次。
- 将细胞沉淀重悬于同一离心管中，加入含5%胎牛血清的1 mL PBS（pH 7.2），用于磁珠分选。
- 进行磁珠分选时，按照试剂盒制造商说明书或已发表的实验方案15，采用磁珠分选试剂盒对CD8+ T细胞进行阴性筛选。
- 进行CFSE染色前，首先使用自动细胞计数仪（颗粒计数器）计数从OT-I小鼠获得的CD8+ T细胞数量。在1-5 mL体积中，以1 - 5 × 107 个细胞/mL的密度，用5 µM CFSE溶于PBS中，在37 °C避光孵育7分钟（使用15 mL Falcon管）。
- 向细胞中加入等体积（1:1）的胎牛血清以终止CFSE染色反应，并在37 °C避光继续孵育7分钟。随后用10 mL PBS洗涤细胞两次。
- 使用自动细胞计数仪重新计数细胞。将细胞浓度调整为3-5 × 107 个细胞/mL PBS，以便通过尾静脉注射方式每只小鼠静脉注射（i.v.）100 µL，即3-5 × 106 个细胞。
- 进行尾静脉注射时，将小鼠固定于合适的固定器中。使用红光灯照射小鼠背部及尾部区域，灯与小鼠距离保持在20至25 cm之间，持续1-3分钟，以促进尾静脉扩张。
注：此步骤有助于更清晰地观察静脉并顺利注射细胞悬液。 - 用手置于小鼠与光源之间确认温度适宜，避免过热。当尾静脉清晰可见时，使用1 mL注射器配合25号针头向侧尾静脉或背侧尾静脉注射细胞悬液16。
2. 免疫接种（无内毒素OVA ± 佐剂）
- 将移植了 OT-I 细胞的小鼠（步骤 1.7，图 1）放入麻醉室中，并通过麻醉机向其输送氧气中的异氟烷14。
- 当小鼠完全进入麻醉状态后，将其从麻醉室中取出，并使用电动修毛机剃除覆盖gluteus superficialis（侧下背部）区域的毛发，以便在视野清晰的条件下进行干净的注射。
- 使用 25 号针头在剃毛区域皮下注射 50 µL 疫苗。
3. 淋巴细胞的分离及流式细胞术分析染色
- 淋巴细胞和脾细胞的分离
- 通过吸入 CO2 并随后进行颈椎脱位，处死已接种疫苗的小鼠。
- 取出引流和远端淋巴结以及脾脏，并分别置于含有 100 µm 孔径滤网杯的培养皿中，用于组织研磨和细胞释放。按步骤 1.1.2 至 1.1.3 操作。
- 离心后弃去上清液，将细胞沉淀重悬于相同体积的残留 PBS 中（约 100 µL）。
- 流式细胞术分析染色
- 在 15 mL 离心管中配制染色抗体主混合液，抗体浓度如表 1所示，配制成 2 倍浓缩的染色混合液。主混合液的总体积应足以每份样品提供 100 µL。将细胞与主混合液按 1:1 混合，在 4°C 下孵育 30 分钟。
注意：每份样品的最终染色体积应为 200 µL（100 µL 细胞沉淀 + 100 µL 抗体主混合液）。 - 按照步骤 1.1.3 所述方法，加入 10 mL PBS 洗涤细胞两次，每次均进行离心。
- 将染色后的细胞重悬于 0.5–1 mL PBS 中用于上机检测，并将悬液转移至流式细胞仪检测管中。样品始终需置于冰上并避光保存。
- 在 15 mL 离心管中配制染色抗体主混合液，抗体浓度如表 1所示，配制成 2 倍浓缩的染色混合液。主混合液的总体积应足以每份样品提供 100 µL。将细胞与主混合液按 1:1 混合，在 4°C 下孵育 30 分钟。
4. 流式细胞术
- 始终使用 70–100 µm 滤器对细胞样品进行预过滤。
- 为表 1 中列出的荧光染料制备单染补偿对照（微球或细胞）。
注意：补偿应在流式细胞仪或分析软件中进行17,18,19，并应用于所有样品。 - 按照 图 2 所示的设门策略进行操作。简要而言，首先在前向散射光高度（FSC-H）与前向散射光面积（FSC-A）图中设门（图 2A），然后在侧向散射光宽度（SSW）与侧向散射光面积（SSA）图中再次设门（图 2B），以排除双联体（doublets）。
- 将 图 2B 中的细胞群通过 BV 650（自发荧光）与 FITC（CFSE）的散点图进行设门，以区分真正被 CFSE 染色的细胞与高自发荧光细胞。将使用 BV 650 标记抗体染色的微球或细胞纳入补偿对照。该 BV 650 与 FITC 的散点图（图 2C）用于圈定 OT-I 型 CFSE 染色细胞。
- 对 图 2C 中的细胞群，通过 Pe-Cy7（Thy1.1 -CD90.1-）与 APC（CD8）的散点图设门，以区分来自供体与受体小鼠的细胞。
注意：来自 OT-I 供体小鼠的细胞为 Thy1.1+（CD90.1），而来自野生型（C57BL/6，受体）小鼠的细胞为 Thy1.2+（CD90.2）（图 2D）。某些实验室的 OT-I 小鼠背景为 Thy1.2，而野生型（C57BL/6）小鼠为 Thy1.1。在此情况下，需使用针对 Thy1.2 的抗体对 OT-I 细胞进行设门。 - 对 Thy1.1+ 群体中的 CD8+ 细胞，通过 BV 450（CD4）与 APC（CD8）的散点图重新设门（图 2E）。
- 将 图 2E 中设门的细胞群以直方图形式显示，展示 CD8+ 细胞的 CFSE 信号（FITC，530/15 通道，蓝色激光），通过包含从 102 开始至未分裂对照群体信号强度（约 105，具体取决于 CFSE 染色效果及流式细胞仪电压设置）的信号范围，圈定已增殖的细胞群体（图 2F）。
- 另设一个门（未在图 2 中显示），绘制 FITC 与活死细胞标记物（L/D marker，450/20 通道，紫外激光）的散点图，以便在评估增殖的同时评估死细胞比例。
- 在流式细胞仪上采集补偿对照至少 5000 个事件，样品至少采集 10,000 个事件（门 E，图 2）。运行细胞仪时使用低或中等流速（流速不得超过 20,000 事件/秒）。
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结果
为了使用不同佐剂组合（ADJ1 和 ADJ2）测试治疗效果，我们通过检测过继转移的 OT-I CD8 T 细胞的增殖情况，评估了细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的生成能力。+ 通过流式细胞术分析T细胞（图2）。为此，我们此前对引流淋巴结和脾脏中分离的细胞进行了染色（表1）。通过测量CD8的增殖+ 淋巴结和脾脏中的T细胞，我们能够证实ADJ2在引流淋巴结中具有更强的CTL生成能力图3) 与 ADJ1、仅 OVA 或 PBS 对照组相比。相反，我们观察到 ADJ2 无法在全身性部位（脾脏）引发 CTL 应答，而 ADJ1 在脾脏 CD8 细胞中显示出高水平的增殖+ T细胞不仅与对照组（PBS和OVA）相比表现出更强的反应，而且优于ADJ1。通过利用这一快速方法解析ADJ2的作用机制 体内 增殖实验，我们可以证实其作为局部而非全身性CTL诱导剂的强...
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讨论
现代疫苗理想上由纯化的抗原和佐剂组成，可能还包含递送系统，如脂质体、病毒样颗粒、纳米颗粒或活体载体。在设计疫苗时，一个关键方面是根据临床需求选择合适的佐剂。这一过程可能涉及促进体液免疫应答与细胞免疫应答（或两者兼有）、局部免疫应答与全身性免疫应答（或两者兼有）之间的权衡，以及疫苗在目标人群中所需诱导的记忆类型。佐剂评价的一个关键环节是快速确定其诱导细胞毒性T淋巴细胞（CTL）应答的能力。本文介绍了一种基于已有技术的方法，用于快速评估CTL应答的特征 体内 通过测量OT-I CD8 T细胞的增殖，在小鼠模型中评估免疫应答的强度。该方法可在仅4个工作日的实验周期内预测佐剂诱导的免疫应答效力（OT-I T细胞的增殖程度）。该方法还可进一步用于比较不同佐剂在免疫应答范围（局部 vs. 全身）及其有效作用方面的差异。在此，我们展示了使用不同佐剂处理（ADJ1 vs. ADJ2）免疫后对免疫应答影响的示例。ADJ2的作用局限于给药局部区域，仅在引流淋巴结中激活免疫应答；而相同剂量的ADJ1作用范围更广泛，可在局部和全身水平均诱导CTL应答，但在引流淋巴结中的应答强度低于ADJ2。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢技术助理： U. Bröder 和 H. Shkarlet 在实验过程中给予的帮助。本工作部分由欧盟资助项目（UniVax，合同编号 601738，以及 TRANSVAC2，合同编号 730964）和亥姆霍兹协会资助项目（HAI-IDR）提供经费支持。资助方未对研究设计、论文撰写或投稿发表的决定产生影响。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BD LSR Fortessa 细胞分析仪 | BD | 特殊订单 | 流式细胞仪 |
| CFSE | 分子探针 | C34554 | 增殖染料 |
| MojoSort 小鼠 CD8 T 细胞分离试剂盒 | Biolegend | 480007 | 用于未接触 CD8 T 细胞阴性筛选的磁性分离微珠及抗体 |
| LIVE/DEAD 可固定蓝色死细胞染色试剂盒（适用于紫外激发） | 分子探针 | L23105 | 死细胞标记物 |
| CD90.1 (Thy-1.1) 单克隆抗体 (HIS51), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-0900-82 | 抗体 |
| APC 抗小鼠 CD8a 抗体 | BioLegend | 100712 | 抗体 |
| BV421 大鼠抗小鼠 CD4 | BD | 740007 | 抗体 |
| Z2 Coulter 颗粒计数与粒径分析仪 | 贝克曼库尔特 | 9914591DA | 细胞计数仪。Z2 自动化颗粒/细胞计数器 |
| 内毒素级卵清蛋白（10 mg） | Hyglos（德国） | 321000 | 经检测无内毒素的卵清蛋白 |
| 细胞筛网 100µm 尼龙 | 康宁 | 352360 | 细胞筛网（100 µm 孔径网杯） |
| 样品瓶 | 贝克曼库尔特 | 899366014 | Z2 自动计数器用样品瓶 |
| C57BL/6 小鼠（CD90.2） | Harlan（德国罗斯多夫） | 该公司现为 Envigo | |
| OT-I（C57BL/6 背景，CD90.1） | Harlan（德国罗斯多夫） | 在本单位动物设施内近交繁殖。原采购公司现为 Envigo | |
| FACS 管 | 费歇尔（康宁） | 14-959-5 | 康宁 Falcon 圆底聚苯乙烯管 |
| Falcon 15 mL 管 | 费歇尔（康宁） | 05-527-90 | Falcon 15 mL 圆锥形离心管 |
| PBS（500 mL） | 费歇尔（Gibco） | 20-012-027 | Gibco PBS（磷酸盐缓冲液），pH 7.2 |
| 红光灯（加热灯） | Dirk Rossmann GmbH（德国） | 405096 | 红外加热灯（100 瓦） |
| IsoFlo（异氟烷） | 雅培实验室（美国） | 5260.04-05. | 异氟烷麻醉剂（250 mL 瓶装） |
| 台式麻醉机/带 CO2 吸收器的移动式麻醉机 | Parkland Scientific | V3000PK | 异氟烷麻醉机 |
| RPMI 1640 培养基 | Gibco（由 ThermoFischer 分销） | 11-875-093 | 含谷氨酰胺的基础培养基（500 mL） |
| 青霉素-链霉素抗生素溶液（Gibco） | Gibco（由 ThermoFischer 分销） | 15-140-148 | Gibco 青霉素-链霉素（10,000 U/mL） |
| 胎牛血清（Gibco） | Gibco（由 ThermoFischer 分销） | 10082147 | 经认证、热灭活、源自美国的胎牛血清 |
| ACK 裂解缓冲液（100 ml） | Gibco（由 ThermoFischer 分销） | A1049201 | 氯化铵-氯化钾（ACK）全血裂解缓冲液，也适用于脾脏悬液中的红细胞裂解 |
| 塑料培养皿 | Nunc（由 ThermoFischer 分销） | 150340 | 60 x 15 mm 塑料培养皿，未处理 |
| 细胞团过滤器 | CellTrics（Sysmex） | 04-004-2317 | CellTrics® 50 μm，无菌 |
参考文献
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