利用小鼠卵母细胞评估人类基因在减数分裂Ⅰ期的功能

摘要

随着与人类疾病相关的遗传变异逐渐被揭示，开发能够快速评估这些已鉴定变异生物学意义的系统变得日益重要。本方案描述了利用小鼠卵母细胞评估人类基因在女性减数分裂Ⅰ期中功能的方法。

摘要

胚胎非整倍体是人类不孕不育的主要遗传原因。这些事件大多数起源于女性减数分裂过程，尽管与母亲年龄呈正相关，但仅凭年龄并不总能预测产生非整倍体胚胎的风险。因此，基因变异可能导致卵子发生过程中染色体分离错误。由于用于研究的人类卵母细胞获取受限，研究人员建立了一系列实验方法，利用小鼠卵母细胞来研究人类基因在减数分裂Ⅰ期的功能。首先，将目标基因及其变异体的信使RNA（mRNA）显微注射到停滞在减数分裂Ⅰ期前期的小鼠卵母细胞中。在给予足够表达时间后，同步释放卵母细胞进入减数分裂成熟过程，以完成减数分裂Ⅰ期。通过在mRNA上标记荧光报告基因序列（例如绿色荧光蛋白（Gfp）），除了观察表型变化外，还可评估人类蛋白的定位情况。例如，可通过建立挑战基因产物修复减数分裂错误能力的实验条件，来研究其功能获得或功能缺失效应。尽管该系统在研究人类蛋白于卵子发生期间的功能方面具有优势，但在解释结果时应谨慎，因为蛋白表达水平并非内源性水平，且除非进行对照处理（即敲除或敲低），系统中仍存在小鼠同源蛋白。

引言

不孕症是一种影响约10%-15%育龄人群的疾病¹，其中近一半患者会寻求医学治疗²。尽管不孕症的病因多样，且在许多情况下为多因素所致，但人类最常见的遗传异常是胚胎非整倍体³。非整倍体是指细胞中染色体数目出现增加或减少的偏离现象。人类胚胎中的非整倍体现象较为常见，且其发生率随母亲年龄增长而升高^4,5。已有四项随机对照试验表明，选择仅染色体正常（整倍体）的胚胎进行子宫移植具有显著优势，该策略可提高胚胎着床率、降低流产率，并缩短实现妊娠所需时间^6,7,8,9。因此，深入了解人类非整倍体的病因对于辅助生殖技术具有重要意义。

尽管胚胎植入前非整倍体遗传学检测在不孕症治疗中具有益处，但目前对非整倍体产生机制的全面理解仍然不足。普遍认为，减数分裂非整倍体（在配子形成过程中产生）与母亲年龄之间存在正相关关系，然而，一些女性的胚胎非整倍体发生率与其相应年龄的平均水平存在偏离

方案

1. 分子克隆

1. 获取目的基因的全长编码序列及质粒 体外 体外转录（pIVT）载体¹¹.
   注意：全长 cDNA 克隆可从多个供应商处商业购买，或通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）生成。美国国家生物技术信息中心（NCBI）在线资源提供了来自核苷酸和表达序列标签（EST）数据库的基因转录本序列。为了便于蛋白质的可视化及表达水平分析，可将其与绿色荧光蛋白（Gfp）融合Gfp）或其他合适的荧光标签可能需要在克隆策略中使用。
2. 使用经过验证的克隆策略，将目的基因的编码序列插入 pIVT 载体的多克隆位点。分子克隆的详细步骤及相关操作此前已有描述。 ¹².
   注意：若需生成基因融合产物，务必确保克隆处于正确的读码框中。
3. 使用Globin引物对构建体进行测序，以确认基因插入正确、读码框融合恰当，并确保未产生由聚合酶引入的点突变。
   注意：如果无法使用桑格DNA测序设备，许多公司提供低成本的DNA测序服务。
4. 如果要生成单核苷酸多态性（SNPs）或插入/缺失突变（INDELS），需对DNA进行诱变。DNA诱变操作详见下文步骤1.5–1.7。对于野生型构建体，可直接进行步骤1.7的线性化操作。
5. 设计定点突变引物，并根据制造商方案完成突变PCR反应以构建突变体。PCR介导的定点突变方....

结果

之后 体外 转录高质量RNA的A260/A280比值应在1.8–2.2之间，A260/A230比值应≥1.7（使用分光光度计测定）。图中 图1 显示迁移过程 体外在电泳后，通过变性琼脂糖凝胶分析所生成的RNA。若条带呈弥散状，或样品出现多个不同大小的条带，可能提示样本存在污染或降解。此外，多条带现象也可能表明mRNA未完全变性，或起始质粒未完全线性化。由于pIVT载体中含有poly-腺苷酸尾，导致mRNA的迁移速率比预期更大，从而实现mRNA的稳定表达。 体外显微注射后，建议通过荧光显微镜观察以确保注射体积和表达水平的均一性。图中 图2 显示处于减数第一次分裂前期停滞的卵母细胞已均匀注射 Gfp一致的显微注射技术对于本方案至关重要。可使用图像分析软件（如 Image J）验证表达水平，以确保实验的一致性和技术掌握程度。请注意，在进行两种检测的成像时，均可获得亚细胞定位信息。在所有评估.......

讨论

由于与疾病相关的人类基因变异体被迅速且不断发现，建立评估其生物学意义的系统变得至关重要。了解蛋白质在人类减数分裂中的功能面临特殊挑战，因为人类卵母细胞极为珍贵且稀少，而人类精子不适合进行遗传操作。小鼠卵母细胞是一种有价值的哺乳动物模型系统，可用于评估人类减数分裂相关基因的功能^10,23。该模型避免了使用人类卵子的不切实际性，同时提供了成本低、易于获取且可操作的卵母细胞来源，这些卵母细胞经历的减数分裂过程与人类生殖细胞相似，有助于理解基因变异如何影响女性生育力。

由于这些方法通过显微注射在小鼠卵母细胞中异源表达人源蛋白，因此首先确定对照用野生型RNA的浓度至关重要，该浓度不应改变减数分裂成熟过程。建议在对照组卵母细胞中监测减数分裂成熟的动力学参数（如核膜破裂、极体排出），以建立基线指标，并评估纺锤体和染色体形态。此外，确保显微注射体积的一致性对于组间比较至关重要。在目的基因上添加荧光标签可简化这一技术难题。掌握卵母细胞显微注射的技术方法已有先前报道

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.2 mL 密封式 PCR 管	USA Scientific	1602-4300
1 kb DNA 标准分子量标记	Thermo Scientific	SM0313
100 bp DNA 标准分子量标记	Thermo Scientific	SM0243
6X DNA 上样染料	Thermo Scientific	R0611
9 孔玻璃点滴板	Thomas Scientific	7812G17
琼脂糖	Sigma Aldrich	A9539
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A3294
Alexa Fluor 568 标记的抗小鼠 IgG 抗体	Thermo Scientific	A21050	1:200 稀释
Alexa Fluor 633 标记的抗人 IgG 抗体	Thermo Scientific	A21091	1:200 稀释
氨苄青霉素	VWR	AA0356
防震台	Technical Manufacturing Corp		任意标准型号
抗乙酰化微管蛋白抗体	Sigma Aldrich	T7451	1:100 稀释
抗着丝粒（CREST）抗体	Antibodies Incorporated	15-234	1:30 稀释
屏障式（滤芯）移液器吸头	Thermo Scientific	AM12635	确保与所用移液器品牌兼容。这些吸头适用于 Eppendorf 品牌移液器。
BD Difco 脱水培养基：LB 琼脂，Miller 型（Luria Bertani）	Fisher Scientific	DF0445-07-6
BD Difco 脱水培养基：LB 肉汤，Miller 型（Luria Bertani）	Fisher Scientific	DF0446-07-5
毛细玻璃管	Sutter	B100-75-10
中心井式器官培养皿	VWR	25381-141
CO₂ 气瓶			用于培养箱
共聚焦显微镜	Zeiss		任意标准型号
离心机（带制冷功能）	Thomas Scientific		任意标准型号
盖玻片 11 x 22 mm	Thomas Scientific	6663F10
盖玻片	Thomas Scientific	6663-F10	厚度因显微镜型号而异
DAPI	Sigma Aldrich	D9542
DEPC 处理水	Life Technologies	AM9922
数字干式恒温仪	Thermo Scientific	888700001
Easy A 高保真克隆酶	Agilent	600400	用于 DNA 克隆
线性化 pIVT 质粒所用酶	New England Biolabs		可使用 NdeI 或 KasI
溴化乙锭	Thermo Scientific	155585011
荧光显微镜			可使用任意荧光显微镜
甲醛（37%）	Thermo Fisher Scientific	9311
甲醛 RNA 上样染料	Ambion	8552
磨砂载玻片（不带电荷）25×75 mm	Fisher Scientific	12-544-3
全长 cDNA 克隆			可从任何提供开放阅读框克隆的供应商处获得
凝胶电泳装置	Bio-Rad		任意标准型号
玻璃巴斯德移液管	Fisher Scientific	13-678-200
pIVT 构建体用珠蛋白正向引物			5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'。  可从任何提供定制寡核苷酸合成服务的公司购买
pIVT 构建体用珠蛋白反向引物			5'- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3' 可从任何提供定制寡核苷酸合成服务的公司购买
持卵管	Eppendorf	930001015	Vacutip
湿盒			可用密封盒代替
Illustra Ready-To-Go RT-PCR 微珠	GE Life Sciences	27925901
培养箱			任意带 CO₂ 和水套控温功能的标准型号
倒置显微镜	Nikon Instruments		任意标准型号
Image J（NIH）软件	NIH		图像分析软件
96 孔板盖	Nalgene Nunc International	263339
低吸附 0.5 mL 微量离心管	USA Scientific	1405-2600
MacVector	MacVector		序列分析软件
MG132	Selleckchem	S2619
显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-544-3
Millenium RNA 标记物-甲醛	Ambion	AM7151
米力农	Sigma-Aldrich	M4659	用 DMSO 溶解至 2.5 mM
矿物油	Sigma-Aldrich	M5310	仅使用经胚胎测试且无菌过滤的矿物油
莫那司他醇	Sigma-Aldrich	M8515	用 DMSO 溶解至 100 mM
吹嘴	Biodiseno	MP-001-Y
N₂ 气瓶			用于防震台
透明指甲油			任意透明指甲油均可使用
NanoDrop 微量紫外-可见分光光度计	Thermo Scientific		任意标准型号
NorthernMax 10X 变性凝胶缓冲液	Life Technologies	AM8676
NorthernMax 10X 电泳缓冲液	Life Technologies	AM8671
NuPAGE MOPS SDS 电泳缓冲液	Thermo Scientific	NP0001
器官培养皿 60×15 mm	Life Technologies	08-772-12
多聚甲醛	Polysciences, Inc.	577773
PCR 热循环仪	Thermo Fisher Scientific	4484075
培养皿 139 mm	Thermo Fisher Scientific	501V
培养皿 35 mm	Thermo Fisher Scientific	121V
培养皿 60 mm	Falcon BD	351007
皮升注射仪	XenoWorks 数字显微注射仪		任意标准型号
拉针仪	Flaming-Brown 微电极拉针仪	Model P-1000
pIVT 质粒	AddGene	32374	适用于卵母细胞表达的空载体。
孕马血清促性腺激素	Lee BioSolutions	493-10
QIAprep Spin Miniprep 试剂盒	Qiagen	27104	用于纯化最多 20 µL 质粒 DNA
QIAquick PCR 纯化试剂盒	Qiagen	28104
QuikChange II 定点突变试剂盒	Agilent	200523	适用于插入和缺失突变的试剂盒
QuikChange Lightning 多位点定点突变试剂盒	Agilent	210512	适用于单一位点突变的试剂盒
剪刀（尖头）	Fine Science Tools	14393
剪刀（中号尖头）	Fine Science Tools	WP114225
Seal-Rite 1.5 mL 微量离心管	USA Scientific	1615-5500
载玻片加热器			任意标准型号
分光光度计（Nanodrop）	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W
体视显微镜			任意标准型号
Subcloning Efficiency DH5α 感受态细胞	Thermo Fisher Scientific	18265017
注射器	BD Biosciences	309623	1 ml，27G(1/2)
T4 DNA 连接酶	New England Biolabs	M0202L
T7 mMessage Machine 高产量加帽 RNA 转录试剂盒	Life Technologies	AM1340
吐温 X-100	Sigma-Aldrich	x-100
吐温-20	Sigma-Aldrich	274348
镊子（尖头，5 号）	Fine Science Tools	SN.743.12.1
UltraPure 无 DNase/RNase 蒸馏水	Thermo Fisher Scientific	10977015
UltraPure 溴化乙锭 10 mg/mL	Thermo Fisher Scientific	15585011
UVP 紫外/白光透射仪	Fisher Scientific	UV95041501
Vectashield 封片剂	Vector Laboratories	H-1000