培养小鼠卵巢的全组织免疫荧光及卵泡定量

摘要

本文介绍了一种无需连续切片即可定量培养后幼鼠卵巢中卵泡数量的实验方案。通过全器官免疫荧光染色结合组织透明化技术，以光学切片取代物理切片。该样品制备与成像方法可保持器官完整性，并有助于对特定细胞进行自动化定量分析。

摘要

哺乳动物生殖生物学领域的研究通常需要评估卵巢和睾丸的整体健康状况。具体而言，在雌性个体中，卵巢功能的评估常通过观察和定量卵泡及卵母细胞来实现。由于卵巢是一种不透明的三维组织，传统方法需要将组织 painstaking 地切成大量连续切片，才能实现对整个器官内细胞的可视化。此外，由于该方法的定量通常仅基于间隔约一个卵母细胞直径的少数切片进行计数，因此容易产生误差。本文介绍了一种利用完整器官组织透明化结合免疫荧光染色技术对小鼠卵巢进行卵泡和卵母细胞成像的实验方案。与传统方法相比，该方案在可视化卵巢内细胞方面具有多项优势：1）样本制备和处理过程中卵巢保持完整；2）难以切片的小型卵巢可被轻松检测；3）细胞定量更便捷且更准确；4）可对整个器官进行成像。

引言

为了研究哺乳动物卵巢的细胞组成和形态特征，科学家通常依赖于体内实验，随后对石蜡包埋的卵巢组织进行免疫组织化学染色。然而近年来，全卵巢器官培养已被证明是研究卵巢功能的一种有效替代方法^1,2,3,4，因为该技术可与更优的可视化和定量分析工具相结合。传统上，卵巢形态学分析依赖于从石蜡包埋的连续切片中重建三维卵巢结构，但这种方法不仅费时费力，而且在对石蜡包埋组织进行连续切片的过程中，无法保证器官结构的准确重建，切片常常丢失或顺序错乱。

除了连续切片技术本身存在的挑战外，在常规用于量化每侧卵巢卵泡数量的方法上也存在差异^5,6。当前方法学上的不一致性限制了不同研究之间关于卵巢储备的荟萃分析^5,7。例如，在同一品系中，不同研究报道的特定发育阶段的卵泡数量可相差10倍或更多⁶。这些在卵泡定量结果上的巨大差异可能导致误解，并阻碍了跨研究的比较。....

方案

康奈尔大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）已根据编号为 2004-0038 的方案批准了此处所述的所有方法，该方案负责人为 JCS。

1. 仪器与培养基的准备

1. 用10%次氯酸钠溶液擦拭工作区域，并让次氯酸钠溶液在工作台表面停留至少5分钟。5分钟后，用干净的纸巾和70%乙醇（EtOH）去除残留的次氯酸钠溶液。用70%乙醇彻底清洁体视显微镜。
   注意：工作区域至少应保持半无菌状态，以避免器官培养物被污染。
2. 用浸有70% EtOH的纸巾包裹干净的镊子和剪刀，直至使用时。
   注意：理想的解剖工具可能因卵巢的年龄/大小而异。建议使用一把锋利的微型解剖剪、两把尖头镊子（型号5或55）和一把微型解剖虹膜剪，以获得最佳效果。
3. 在锥形管中配制 50 mL 卵巢培养基，并于 37 °C 预热 °C 水浴
   1. 制备卵巢培养基⁴，用含10%胎牛血清（FBS）、25 mM HEPES、100单位/毫升青霉素、100 µg/mL 链霉素，0.25 µg/mL 两性霉素 B (例如， 45 mL MEM，5 mL 热灭活的 FBS，1.25 mL HEPES，以及 0.5 mL 100 倍浓度的青霉素、链霉素和两性霉素 B 储存液。
4. 在卵巢培养前准备好....

结果

本方案在卵巢解剖后包含6个主要步骤，如图1所示。图2、图3、图4 突出了本方案最具创新性的特点，包括卵巢组织透明化的优化以及利用FIJI-ImageJ进行全组织卵母细胞定量分析。图2A展示了未培养的出生后第5天固定卵巢在加入透明溶液前（左）和加入后1小时（右）的图像。卵巢浸入透明溶液后数分钟内即开始变得半透明。一旦完成透明化，像图2A中成像的小型卵巢便难以操作而不造成损伤。因此，使用体外培养的卵巢组织具有优势，因为它们会附着在培养插件膜的多孔表面。卵巢.......

讨论

哺乳动物生殖研究需要使用并量化一些通常难以进行细胞培养的特化细胞。然而，离体（ex vivo）培养系统在维持卵巢和卵泡活性方面具有良好的效果^1,15。在卵巢培养过程中，组织需要较大的表面积以通过扩散实现营养物质交换。因此，出生5天小鼠的卵巢在大小和形状上均非常适合器官培养。本实验方案已优化用于维持卵巢体外培养7天，但可根据具体科学问题调整培养时间^1,4。在培养时间为3天至10天的卵巢中也获得了可比的结果（数据未显示），但来自超过10天龄动物的卵巢体积较大，培养效果可能不佳，这表明了本方案的一项局限性。

如果 离体 无需培养卵巢，可直接采用所述方案对较老的卵巢进行固定和染色，但可能需要根据组织体积较大进行相应调整^9,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
微型解剖剪刀 4.5"，直头，尖端锋利	Roboz	RS-5912	微型解剖剪刀
珠宝匠式镊子 4-3/8"，5号型	Integra Miltex	17-305X	细尖镊子
微型虹膜剪 4"，直头，尖端锋利	Integra Miltex	18-1618	微型解剖虹膜剪或微型解剖弹簧剪
1X 最低必需培养基（MEM）	ThermoFisher Scientific	11090-081
胎牛血清	Corning	35011CV
HEPES（1M）	Gibco	15630080
抗生素-抗真菌剂（100X）	Gibco	15240062	用于步骤 1.3.1
35 mm 组织培养处理培养皿	Corning	430165
Nunc™ 24孔细胞培养插件载体板	ThermoFisher Scientific	141006	孔径：8μm
多聚甲醛（PFA）	Electron Microscopy Sciences	15710	16% 溶液
1X 磷酸盐缓冲液（PBS）	Gibco	10010023
Nutator 混匀仪 GyroTwister™	Labnet	S1000-A-B	三维摇床
正常山羊血清	VWR	103219-578
牛血清白蛋白（BSA）	VWR	97061-416
叠氮化钠（NaN3）	Sigma-Aldrich	S2002-25G
硼氢化钠溶液（NaBH4）	Sigma-Aldrich	452904-25ML	使用溶液形式，而非片剂或粉末形式
聚乙烯醇（PVA）	Sigma-Aldrich	P8136-250G	冷水可溶
Triton™ X-100	Sigma-Aldrich	93443-100ML	聚乙二醇叔辛基苯基醚
注射器滤器	ThermoFisher Scientific	725-2520	25 mm
10 mL 注射器	BD	309695
小鼠抗 p63 抗体（4A4）	Biocare Medical	CM 163A	稀释比例 1:500
兔抗 MVH 抗体	Abcam	ab13840	稀释比例 1:600
Alexa Fluor® 山羊抗小鼠 594	ThermoFisher Scientific	A-11032	稀释比例 1:1000
Alexa Fluor® 山羊抗兔 488	ThermoFisher Scientific	A-11034	稀释比例 1:1000
4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）	ThermoFisher Scientific	62248
D-(-)-山梨醇	Sigma-Aldrich	240850-100G
甘油	Sigma-Aldrich	G9012-100ML
尿素	Sigma-Aldrich	U5378-500G
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma-Aldrich	D2650-5X10ML
FIJI-ImageJ			图像处理软件
一次性塑料移液管	VWR	414044-034