本文介绍了一种无需连续切片即可定量培养后幼鼠卵巢中卵泡数量的实验方案。通过全器官免疫荧光染色结合组织透明化技术，以光学切片取代物理切片。该样品制备与成像方法可保持器官完整性，并有助于对特定细胞进行自动化定量分析。
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本文内容
摘要
摘要
哺乳动物生殖生物学领域的研究通常需要评估卵巢和睾丸的整体健康状况。具体而言，在雌性个体中，卵巢功能的评估常通过观察和定量卵泡及卵母细胞来实现。由于卵巢是一种不透明的三维组织，传统方法需要将组织 painstaking 地切成大量连续切片，才能实现对整个器官内细胞的可视化。此外，由于该方法的定量通常仅基于间隔约一个卵母细胞直径的少数切片进行计数，因此容易产生误差。本文介绍了一种利用完整器官组织透明化结合免疫荧光染色技术对小鼠卵巢进行卵泡和卵母细胞成像的实验方案。与传统方法相比，该方案在可视化卵巢内细胞方面具有多项优势：1）样本制备和处理过程中卵巢保持完整；2）难以切片的小型卵巢可被轻松检测；3）细胞定量更便捷且更准确；4）可对整个器官进行成像。
引言
为了研究哺乳动物卵巢的细胞组成和形态特征，科学家通常依赖于体内实验，随后对石蜡包埋的卵巢组织进行免疫组织化学染色。然而近年来，全卵巢器官培养已被证明是研究卵巢功能的一种有效替代方法1,2,3,4，因为该技术可与更优的可视化和定量分析工具相结合。传统上，卵巢形态学分析依赖于从石蜡包埋的连续切片中重建三维卵巢结构，但这种方法不仅费时费力，而且在对石蜡包埋组织进行连续切片的过程中，无法保证器官结构的准确重建，切片常常丢失或顺序错乱。
除了连续切片技术本身存在的挑战外，在常规用于量化每侧卵巢卵泡数量的方法上也存在差异5,6。当前方法学上的不一致性限制了不同研究之间关于卵巢储备的荟萃分析5,7。例如，在同一品系中，不同研究报道的特定发育阶段的卵泡数量可相差10倍或更多6。这些在卵泡定量结果上的巨大差异可能导致误解，并阻碍了跨研究的比较。在实验操作中，传统的基于连续切片的卵泡定量方法通常通过计数预先设定间隔的切片（例如，每第五张、第十张或其他间隔的切片）中的卵泡来完成。采用该方法所导致的计数变异不仅来源于切片计数的周期性选择，还来源于切片厚度的差异以及制备连续切片过程中的技术熟练程度5,6。除了方法本身的变异性外，传统组织切片的另一个缺点是，对幼龄动物的小型卵巢进行切片尤其困难，且高度依赖于组织的定向摆放8。
以下方案描述了一种常规使用的卵巢培养技术1，但通过使用组织透明化和共聚焦显微镜进行光学切片取代传统的物理切片，极大地改进了卵泡定量方法8,9。采用基于尿素和山梨醇的溶液（例如，ScaleS(0)10）进行组织浸渍透明化（无需经颅灌注或电泳）被证明与免疫染色兼容，并可在不影响成像深度的前提下缩短透明化时间。其他已报道的方法（例如，ScaleA28,10、SeeDB11、ClearT12 和 ClearT212）要么耗时更长，要么无法实现样本的深层光学分辨率。光学切片的优势在于操作更省力，且能保持器官的三维结构7,8。该方法的另一优点是样本制备无需昂贵的试剂来透明化组织，操作相对简便。
具体而言，本方案已针对出生后第5天的小鼠卵巢培养进行了优化，但也适用于出生后第0至第10天的卵巢。该方法采用一种卵巢培养系统，组织可自然附着于培养膜上，便于器官的操作与处理。所述培养系统可用于维持离体卵巢长达10天，并评估不同实验条件对卵母细胞存活的影响13。所描述的定量分析过程使用非商业图像处理软件FIJI-ImageJ14完成，可在大多数个人计算机上进行。此外，用于定量分析的图像可广泛提供给科学界，从而支持未来的荟萃分析。
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方案
康奈尔大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）已根据编号为 2004-0038 的方案批准了此处所述的所有方法，该方案负责人为 JCS。
1. 仪器与培养基的准备
- 用10%次氯酸钠溶液擦拭工作区域，并让次氯酸钠溶液在工作台表面停留至少5分钟。5分钟后，用干净的纸巾和70%乙醇（EtOH）去除残留的次氯酸钠溶液。用70%乙醇彻底清洁体视显微镜。
注意：工作区域至少应保持半无菌状态，以避免器官培养物被污染。 - 用浸有70% EtOH的纸巾包裹干净的镊子和剪刀，直至使用时。
注意：理想的解剖工具可能因卵巢的年龄/大小而异。建议使用一把锋利的微型解剖剪、两把尖头镊子（型号5或55）和一把微型解剖虹膜剪，以获得最佳效果。 - 在锥形管中配制 50 mL 卵巢培养基，并于 37 °C 预热 °C 水浴
- 制备卵巢培养基4，用含10%胎牛血清（FBS）、25 mM HEPES、100单位/毫升青霉素、100 µg/mL 链霉素，0.25 µg/mL 两性霉素 B (例如， 45 mL MEM，5 mL 热灭活的 FBS，1.25 mL HEPES，以及 0.5 mL 100 倍浓度的青霉素、链霉素和两性霉素 B 储存液。
- 在卵巢培养前准备好培养板和插入物。
- 在组织培养罩内，向35 mm组织培养皿中加入1 mL卵巢培养基。
- 用培养基预浸润插入式膜。向24孔细胞培养板每孔加入足量培养基，通常每孔约0.55 mL，并将细胞培养插件放入孔中，确保插件的膜与培养基接触。
- 根据实验中预期的卵巢数量，准备相应数量的35 mm培养皿和含细胞培养插件的孔板。将含有1 mL培养基的35 mm培养皿以及含有培养基和插件的24孔载体板置于37 °C，5% CO2，以及大气中的 O2 孵育箱
- 将加热板放置在解剖显微镜旁，并将温度设定为37 °C. 将37 °C，5% CO2 和大气中的 O2 孵育箱靠近解剖室。
2. 卵巢解剖与器官培养
注意：只要暴露在非理想温度下的时间最短，卵巢可在室温下解剖。
- 在出生后第5天，通过断头法逐只处死雌性小鼠。
注意：处死操作必须遵循实验所在机构的IACUC指南。 - 用70%乙醇喷洒动物。将动物置于解剖显微镜下干燥的纸巾上。在解剖显微镜附近放置一个含有卵巢培养基的35 mm组织培养皿。
- 使用镊子或显微解剖虹膜剪，在动物皮肤上做切口并进入腹腔，注意不要剪到肠道。将肠道推开，找到卵巢。取出卵巢并放入含有培养基的35 mm组织培养皿中。
- 一旦卵巢从动物体内分离，增加解剖显微镜的放大倍数，以便更清楚地观察卵巢及附着组织。使用洁净的细尖镊子去除所有非卵巢组织，如卵巢囊和脂肪组织。在去除附着的非卵巢组织时，注意保持卵巢完整。
- 卵巢分离后，将一对卵巢放入预先浸泡过的载体24孔板中的细胞培养插件内（参见步骤1.4.2和1.4.3），并调整培养基体积，确保其足以保持器官湿润（但不要完全浸没）。
注意：转移卵巢时，小心不要刺破细胞培养插件的膜。 - 将离体器官置于37 °C、5% CO2、大气O2的培养箱中。
- 重复步骤2.1–2.6，直至所有动物的卵巢均被分离并放置于含卵巢培养基的24孔板的细胞培养插件上。
- 每2天更换一次卵巢培养基，使用从37 °C水浴中取出的预温卵巢培养基，并在所需的实验时间点进入本方案的第3部分。
3. 组织固定
- 在15 mL锥形管中，用1×磷酸盐缓冲液（PBS）配制4%多聚甲醛（PFA）例如， 加入2 mL 16%电子显微镜级PFA至6 mL 1x PBS中。
注意：PFA 为有害物质，应在化学通风橱中操作。 - 将培养的卵巢固定，无需将组织从培养插件中取出，直接用新配制的4% PFA溶液覆盖组织。用塑料封口膜密封培养板边缘（防止蒸发），并将样品置于4℃ °C 过夜。
注意：为便于操作并保持组织完整性，整个实验过程中应避免将卵巢从细胞培养插件中移出。将培养的卵巢附着在插件表面，有利于操作时避免损伤或丢失组织器官。 - 用70%乙醇冲洗组织3次，然后进行步骤4.1，或将其置于装有70%乙醇的闪烁瓶中，于4℃保存。 °C，直至进一步处理。
注意：如果使用内源性表达荧光蛋白的组织，用70%乙醇（EtOH）保存样品可能会显著降低信号强度。 alternatively，组织可用含0.2%叠氮化钠（NaN₃）的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗并保存。3）。NaN3 然而，该物质具有高毒性，存在严重的吸入危害。配制储存液时应在通风橱中操作，并穿戴适当的个人防护装备，如实验服和丁腈手套。
4. 整体免疫荧光染色
- 将固定后的组织置于1x PBS中，室温下放置至少4小时，然后再进行透化步骤4.3。
- 配制通透溶液和封闭溶液。
- 按如下所述配制通透溶液：向 1x PBS 中加入 0.2% 聚乙烯醇（PVA）、0.1% 硼氢化钠（NaBH₄）4）溶液（由12 wt.%的14 M氢氧化钠（NaOH）溶液配制）和1.5%聚乙二醇 叔丁基辛基苯基醚（非离子表面活性剂洗涤剂）。在50 mL锥形管中，加入5 mL 10x PBS、0.1 g PVA、50 µL of NaBH4，以及750 µ加入非离子表面活性剂洗涤剂至 L，然后用超纯水定容至 50 mL，并在室温下充分振荡，直至混合物完全溶解。
- 按所述配制封闭液。加入1x PBS，加入 0.1% 非离子型表面活性剂、0.15% 的 2.5 M 甘氨酸（pH 7.4）、10% 正常山羊血清、3% 牛血清白蛋白（BSA）、0.2% NaN3，100 单位/毫升青霉素，100 µ微克/毫升链霉素和0.25 µg/mL 两性霉素 B。通过将 93.8 g 甘氨酸溶解于超纯水中，定容至 500 mL（pH 7.4），配制 2.5 M 甘氨酸储存液，以及配制 10% NaN3 通过将5 g溶于50 mL超纯水中配制；然后，在50 mL锥形管中加入5 mL 10x PBS和50 µ非离子型表面活性剂洗涤剂 L，750 µL 甘氨酸储存液、5 mL 山羊血清、1.5 g BSA、1 mL NaN3 储存液，以及 0.5 mL 青霉素、链霉素和两性霉素 B 的 100 倍储存液。加入超纯水至终体积为 50 mL，并用注射器滤器过滤终溶液。
- 从离心管中移除并弃去1x PBS，然后加入足量的通透液以完全浸没卵巢。将样本置于通透液中，并放置在旋转摇床上例如， 在室温下以振荡器振荡孵育 4 小时。
注意：孵育时间可能根据器官厚度而有所变化。 - 用足量的封闭液替换通透液，确保卵巢完全浸没。用塑料封口膜密封管子，并将组织置于室温下，在摇床上孵育至少12小时。
- 根据制造商的数据表，用封闭液配制一抗稀释液。
注意：并非所有抗体都与透明剂兼容。每个样本所需的平均体积约为 750 µL.- 用于卵母细胞定量时，使用 TAp63（卵母细胞核标记物）和 MVH（生殖细胞胞质标记物）。
注意：免疫荧光图像中使用的抗体为小鼠抗p63和兔抗MVH。若在4℃保存，一抗溶液可重复使用2次或更多次。 °C 在染色方案之间以及妥善处理以避免细菌生长。
- 用于卵母细胞定量时，使用 TAp63（卵母细胞核标记物）和 MVH（生殖细胞胞质标记物）。
- 将含有组织的插件放入24孔板中，并加入约750 µ加入一抗溶液，确保卵巢完全浸没。用塑料封口膜密封培养板以减少蒸发，并将组织置于室温下在摇床上孵育4天。
- 配制洗涤液。
- 按所述配制洗涤液。制备1x PBS，加入0.2% PVA和0.15%非离子表面活性剂洗涤剂。在50 mL锥形管中，加入5 mL 10x PBS、0.1 g PVA、75 µ非离子表面活性剂洗涤剂和超纯水定容至50 mL。
- 移除一抗稀释液，加入足量洗涤液。始终确保卵巢完全浸没在溶液中。将卵巢置于室温下，在摇床上浸泡过夜。
- 更换洗涤液，在摇床中孵育2小时或更长时间。
- 重复步骤 4.9 一次。
- 在封闭液中配制二抗稀释液。
注意：所使用的二抗为山羊来源的抗小鼠488荧光染料和山羊来源的抗兔594荧光染料。每个样本所需平均体积见步骤4.5。 - 从卵巢中移除洗涤液，加入二抗溶液。将样品避光（用铝箔包裹培养板）并用塑料封口膜密封培养板以减少蒸发。在室温下于摇床上孵育样品2天。
注意：在后续所有孵育步骤中，继续使用铝箔将样品避光保护。 - 从样本中移除二抗溶液，加入洗涤液，在摇床中孵育8小时。
注意：如果需要进行4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色，则在第一次洗涤步骤中加入50 ng/mL的DAPI（约8小时孵育）。 - 更换为洗涤液，进行过夜洗涤。
- 在配制透明溶液的同时（见第5节），将过夜洗涤液更换为新鲜溶液，并将样品置于室温下的旋转摇床上。
5. 卵巢透明化与成像
- 配制 ScaleS(0) 透明化溶液。
- 按以下比例配制 ScaleS(0) 透明化溶液10：40% D-(-) 山梨醇（w/v）、10% 甘油、4.3 M 尿素和 20% 二甲基亚砜（DMSO），pH 8.1（例如，在 50 mL 锥形管中加入 2.5 mL 甘油、10 g 山梨醇、5 mL DMSO 和 12 mL 9 M 尿素，定容至 25 mL。在 50 °C 下颠倒混合 30 分钟，并在使用前脱气。）
- 去除洗涤液，将样品完全浸入透明化溶液中。为获得更佳效果，建议将样品置于旋转摇床上处理。
- 每天更换透明化溶液两次，直至组织变得透明（约需 2 天）。
- 组织透明化完成后，用细尖手术刀小心取出含有培养卵巢的插入膜，并将样品置于载玻片上，以准备成像。
- 使用具备光学切片功能的显微镜进行样品成像。
6. 卵母细胞定量
注意：有许多不同的计算机程序可用于细胞定量。以下描述的是使用非商业性图像处理软件 FIJI-ImageJ14 进行卵母细胞定量的实验方案。
- 使用针对特定细胞标志物（不包含 DAPI 通道）的 Z-堆栈图像序列的扁平化最大强度投影，在 图像 下拉菜单中的 类型 选项下，将图像转换为黑白 8 位图像。
- 在 图像 下拉菜单中，选中 调整 选项卡，然后选择 阈值。
- 手动调整阈值至最佳水平，以准确识别每一个卵母细胞。确定阈值后，点击 应用 生成黑白图像。完成后，使用 椭圆 或 徒手绘制 图标对样本进行勾画以完成定量。
注意：FIJI-ImageJ 提供多种选项用于优化用于颗粒定量的图像。例如，在 处理 | 二值化 选项卡中，有多种可选操作可提高待计数目标的检测效果。在 图 4 中，为更好分离单个卵泡所采用的操作依次为 腐蚀、填充孔洞，最后使用 分水岭。 - 在 分析 下拉菜单中，选择 分析颗粒。根据所需的分辨率设置参数。
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结果
本方案在卵巢解剖后包含6个主要步骤，如图1所示。图2、图3、图4 突出了本方案最具创新性的特点，包括卵巢组织透明化的优化以及利用FIJI-ImageJ进行全组织卵母细胞定量分析。图2A展示了未培养的出生后第5天固定卵巢在加入透明溶液前（左）和加入后1小时（右）的图像。卵巢浸入透明溶液后数分钟内即开始变得半透明。一旦完成透明化，像图2A中成像的小型卵巢便难以操作而不造成损伤。因此，使用体外培养的卵巢组织具有优势，因为它们会附着在培养插件膜的多孔表面。卵巢...
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讨论
哺乳动物生殖研究需要使用并量化一些通常难以进行细胞培养的特化细胞。然而，离体（ex vivo）培养系统在维持卵巢和卵泡活性方面具有良好的效果1,15。在卵巢培养过程中，组织需要较大的表面积以通过扩散实现营养物质交换。因此，出生5天小鼠的卵巢在大小和形状上均非常适合器官培养。本实验方案已优化用于维持卵巢体外培养7天，但可根据具体科学问题调整培养时间1,4。在培养时间为3天至10天的卵巢中也获得了可比的结果（数据未显示），但来自超过10天龄动物的卵巢体积较大，培养效果可能不佳，这表明了本方案的一项局限性。
如果 离体 无需培养卵巢，可直接采用所述方案对较老的卵巢进行固定和染色，但可能需要根据组织体积较大进行相应调整9,
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢康奈尔大学BRC影像中心的Rebecca Williams和Johanna Dela Cruz，以及Andrew Recknagel提供的有益建议和技术支持。本研究由美国国立卫生研究院资助：S10-OD018516（资助康奈尔大学影像中心）、T32HD05784至J.C.B.，以及R01-GM45415至J.C.S.。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 微型解剖剪刀 4.5"，直头，尖端锋利 | Roboz | RS-5912 | 微型解剖剪刀 |
| 珠宝匠式镊子 4-3/8"，5号型 | Integra Miltex | 17-305X | 细尖镊子 |
| 微型虹膜剪 4"，直头，尖端锋利 | Integra Miltex | 18-1618 | 微型解剖虹膜剪或微型解剖弹簧剪 |
| 1X 最低必需培养基（MEM） | ThermoFisher Scientific | 11090-081 | |
| 胎牛血清 | Corning | 35011CV | |
| HEPES（1M） | Gibco | 15630080 | |
| 抗生素-抗真菌剂（100X） | Gibco | 15240062 | 用于步骤 1.3.1 |
| 35 mm 组织培养处理培养皿 | Corning | 430165 | |
| Nunc™ 24孔细胞培养插件载体板 | ThermoFisher Scientific | 141006 | 孔径：8μm |
| 多聚甲醛（PFA） | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% 溶液 |
| 1X 磷酸盐缓冲液（PBS） | Gibco | 10010023 | |
| Nutator 混匀仪 GyroTwister™ | Labnet | S1000-A-B | 三维摇床 |
| 正常山羊血清 | VWR | 103219-578 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | VWR | 97061-416 | |
| 叠氮化钠（NaN3） | Sigma-Aldrich | S2002-25G | |
| 硼氢化钠溶液（NaBH4） | Sigma-Aldrich | 452904-25ML | 使用溶液形式，而非片剂或粉末形式 |
| 聚乙烯醇（PVA） | Sigma-Aldrich | P8136-250G | 冷水可溶 |
| Triton™ X-100 | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | 聚乙二醇叔辛基苯基醚 |
| 注射器滤器 | ThermoFisher Scientific | 725-2520 | 25 mm |
| 10 mL 注射器 | BD | 309695 | |
| 小鼠抗 p63 抗体（4A4） | Biocare Medical | CM 163A | 稀释比例 1:500 |
| 兔抗 MVH 抗体 | Abcam | ab13840 | 稀释比例 1:600 |
| Alexa Fluor® 山羊抗小鼠 594 | ThermoFisher Scientific | A-11032 | 稀释比例 1:1000 |
| Alexa Fluor® 山羊抗兔 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | 稀释比例 1:1000 |
| 4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI） | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| D-(-)-山梨醇 | Sigma-Aldrich | 240850-100G | |
| 甘油 | Sigma-Aldrich | G9012-100ML | |
| 尿素 | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich | D2650-5X10ML | |
| FIJI-ImageJ | 图像处理软件 | ||
| 一次性塑料移液管 | VWR | 414044-034 |
参考文献
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