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一种用于单细胞基因组测序的超高通量微流控平台

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DOI：

10.3791/57598

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2018年5月23日

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1Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, California Institute for Quantitative Biosciences, University of California, San Francisco, 2UC Berkeley-UCSF Graduate Program in Bioengineering, University of California, San Francisco, 3Chan Zuckerberg Biohub

本文内容

摘要

单细胞测序可揭示生物系统中的基因型异质性，但现有技术缺乏对群落组成和功能进行深度分析所需的通量。本文介绍了一种微流控工作流程，可用于对来自不同细胞群体的超过>50,000个单细胞基因组进行测序。

摘要

测序技术已从群体水平转向单细胞分辨率，以应对人们对细胞异质性在生物系统中作用的不断深入理解。然而，大规模单细胞群体的测序因基因组文库制备过程中的技术限制而受到阻碍。本文描述了一种单细胞基因组测序方法（SiC-seq），该方法利用液滴微流控技术对单个细胞的基因组进行分离、扩增和条形码标记。通过将细胞包裹在微凝胶中，可实现DNA的分区纯化与标签化（tagmentation）；同时，微流控融合装置可高效地将每个基因组与唯一的单细胞寡核苷酸条形码配对，使每次运行可测序超过>50,000个单细胞。测序数据通过条形码解复用，生成来源于单个细胞的读段群组。作为一种高通量、低偏差的单细胞测序方法，SiC-seq将推动面向多样化细胞群体的更广泛基因组学研究。

引言

基因组作为细胞身份和功能的蓝图，包含了生物体全部的编码潜能。在基因组水平上理解细胞生物学，可以解释异质性细胞群体中观察到的表型多样性。这种异质性在生物系统中普遍存在，并对人类健康与疾病具有广泛影响。例如，肿瘤细胞之间的基因拷贝数变异与癌症的发生和扩散密切相关1,2。在细菌感染中，仅存在于少量基因组中的致病岛可通过水平转移导致耐药细菌的增殖3,4。在单细胞水平研究基因组的主要挑战在于可获取的DNA量极低，同时需要分析数千个细胞才能充分取样基因型的全部多样性。由于这些原因，实验通量的限制阻碍了单细胞研究的有效性，导致结果偏向于最丰富的细胞类型。单细胞分离技术，如流式分选5,6、光镊7、包埋于大块凝胶8以及微流控技术9，能够处理数百个细胞用于测序；然而，这仅占大多数样本的一小部分。若能实现通量显著更高的单细胞基因组测序方法，将有助于对细胞群体进行更深入、更全面的分析，从而阐明基因型多样性在这些群体中的作用。

液滴微流控技术能够在数百万个皮升级别的反应器中对细胞和生物试剂进行高通量操控。迄今为止，微液滴技术已被用于研究来自异质组织中细胞间的差异表达模式10,11,12，对长分子进行深度测序13,14,15，以及在单细胞水平上开展染色质免疫沉淀测序（ChiP-seq）分析16。事实上，微液滴具备高通量、区室化操作的能力，因此适用于单细胞基因组学的应用。然而，该技术的发展也面临独特的技术挑战。为了均匀地取样细胞群体，必须以最小的偏差对细胞进行裂解、纯化和扩增。此外，与哺乳动物细胞中的多聚腺苷酸化mRNA转录本不同，基因组中不存在类似的分子基序来促进目标核酸的捕获。由于这些原因，在微液滴平台上实现单细胞基因组测序一直较为困难。

在本研究中，我们提供了一种此前报道的单细胞微流控方法的详细实验方案，该方法能够在单次实验中对数万个细胞的基因组进行测序17。利用这种称为SiC-seq的技术，细菌细胞被包裹在微米级水凝胶中，随后进行单个裂解、标签化（tagmentation）处理，并与含有独特寡核苷酸条形码的微液滴融合；通过一次重叠延伸聚合酶链式反应（PCR），该条形码被连接到细胞的基因组DNA上。水凝胶作为独立的反应容器，可将高分子量的基因组DNA在空间上限制其中，同时允许去垢剂和溶菌酶等小分子进入，从而在条形码标记前实现DNA的裂解与纯化18。本方案可在数小时内处理>50,000个单细胞，最终获得可用于测序的条形码文库。测序完成后，根据各读段所携带的单细胞条形码序列进行解复用（demultiplexing），获得包含数百万条测序读段的数据集，每条读段均带有对应的细胞索引。

方案

1. 微流控装置的制备

  1. 使用计算机辅助设计（CAD）软件准备微流控掩模设计（以 .DWG 格式提供；参见 补充文件）。将这些设计交由供应商以 10 µm 分辨率打印在电路板胶片上。
    注意：对于多层微流控器件，相应的掩模包含对准标记。
  2. 针对每个器件，按以下步骤制备 SU-8 原模（图 1A）。
    1. 在直径为 3 英寸的硅片中心倒入约 1 mL 的 SU-8 3025 光刻胶。通过施加负压将硅片固定在匀胶机卡盘上。
    2. 各器件的光刻胶层厚度和匀胶转速见 表 1。所有器件均先以 500 rpm 匀胶 30 秒，随后以表中指定转速匀胶 30 秒。
    3. 将涂覆 SU-8 的硅片从匀胶机取下，在设定为 135 °C 的热板上进行软烘 30 分钟。烘烤后让硅片冷却至室温。
    4. 使用适当的微流控掩模，在平行光路下用 190 mW、365 nm 的紫外 LED 照射 SU-8 硅片 3 分钟。
    5. 曝光后，在设定为 135 °C 的热板上进行硬烘 1 分钟。此步烘烤完成后，让硅片冷却至室温。
    6. 对于单层微流控器件，跳至步骤 1.2.7。对于多层微流控器件，对第二层光刻胶重复步骤 1.2.1 至 1.2.5（图 1B）。
    7. 单层器件完成第一次硬烘后（或多层器件完成第二次硬烘后），将硅片浸入丙二醇单甲醚醋酸酯（PGMEA）溶液中显影 30 分钟。
    8. 显影完成后，使用装有 PGMEA 的冲洗瓶冲洗硅片，然后用装有异丙醇的冲洗瓶再次冲洗，再将其置于 135 °C 热板上加热 1 分钟以干燥。
    9. 将硅片（此后称为原模）放入培养皿中，用于浇铸聚二甲基硅氧烷（PDMS）。
  3. 在完成步骤 1.2 制备的原模基础上，继续进行 PDMS 浇铸以完成器件 fabrication。
    1. 按质量比 11:1 混合硅胶基体与固化剂制备 PDMS，并用搅拌棒手动混合均匀。
    2. 将 PDMS 置于脱气 chamber 中抽真空进行脱气处理，直至无可见气泡（通常需 30 分钟）。
    3. 小心地将脱气后的 PDMS 倒在原模上，使最终 PDMS 层厚度约为 5 mm。再次进行脱气，以确保去除所有气泡。
    4. 脱气完成后，将 PDMS 与原模在 80 °C 下烘烤 80 分钟。
    5. 使用剃刀片小心地从烘烤后的原模上切下固化的 PDMS 块体。确保所有切割均在硅片表面进行。
      注意：若切割位置偏离硅片，可能导致边缘凸起，影响均匀键合。
    6. 使用 0.75 mm 的活检打孔器打出入液口和出液口。在器件特征面使用包装胶带去除灰尘和散落的 PDMS 碎屑。
    7. 在进行等离子处理前，用异丙醇冲洗一块 50 mm × 75 mm 的玻璃载片并干燥，以清洁其表面。
    8. 进行等离子处理时，将 PDMS 块体和玻璃载片放入等离子键合仪中，特征面朝上。使用 1 mbar 的 O2 等离子体处理 1 分钟。通过将暴露面（即朝上的面）贴合，实现器件与玻璃载片的键合。
    9. 等离子处理后，将器件在 80 °C 下烘烤 40 分钟。
    10. 最后，向其中一个入口注入玻璃表面处理液，使微流控通道呈现疏水性。确保所有通道完全充满该溶液，并对每个液滴生成单元重复注射。将处理后的器件在 80 °C 下烘烤 10 分钟，以蒸发多余溶剂。

2. 细胞在琼脂糖微凝胶中的包封

注意：见图2A。

  1. 在1x Tris-EDTA（TE）缓冲液中配制1 mL 3% w/v低熔点琼脂糖溶液。在注射器上样前，将琼脂糖溶液置于90 °C加热块上保温。
  2. 制备细胞悬液。
    注意：本方案及其相关微流控装置已验证可用于细菌细胞，无论是来自冻存菌种还是新鲜制备的样品。哺乳动物细胞根据细胞类型不同，可能需要调整微流控通道尺寸以适应较大的细胞体积。
    1. 将细胞重悬于1 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中。
    2. 使用血细胞计数板或流式分选法对细胞进行计数。对于目标包封率为每10个微凝胶含1个细胞的25 µm微凝胶，将细胞悬液最终浓度调整为2.4 x 107 个细胞/mL，总体积为1 mL。
    3. 以3,000 x g离心3分钟，弃上清，将细胞沉淀重悬于1 mL含17% v/v密度梯度介质（见材料表）的PBS溶液中。上样前置于冰上保存。
  3. 取一支3 mL注射器，装入含2% w/w全氟聚醚-聚乙二醇（PFPE-PEG）表面活性剂的氟化油（HFE），安装27 G针头，并将其放入注射泵中。
    注意：本方案中所有微流控步骤均应使用27 G针头。为降低意外刺伤风险，在启动泵操作前请始终保持针头帽处于安装状态。
  4. 将细胞悬液和熔融琼脂糖分别装入1 mL注射器，均安装27 G针头，并置于注射泵中。
  5. 使用小型空间加热器保持琼脂糖注射器及泵体温度，防止琼脂糖在注射器和进样管路中凝固。将加热器调至高温档，并将其放置在距离注射器约10 cm处，确保注射器位置测得的温度约为80 °C。
    注意：建议用户将加热器保持在推荐距离，以避免设备损坏，包括管路熔化等风险。
  6. 使用共流式液滴生成装置制备25 µm微凝胶液滴。
    注意：液滴生成装置的结构示意图参见图3A，图中标明了试剂入口和出口位置。
    1. 使用聚乙烯（PE）管将注射器针头连接至微流控装置的入口。在将管路插入装置前，先启动泵以排除管路中的空气。
    2. 将一段管路连接至出口，并将自由端放入15 mL收集管中。
    3. 采用以下（推荐）流速进行液滴生成：HFE含2% w/w PFPE-PEG的流速为800 µL/h；PBS中的细胞悬液流速为200 µL/h；3% w/v琼脂糖流速为200 µL/h。
  7. 完成液滴生成后，将收集管置于4 °C环境中30分钟，以确保琼脂糖完全凝胶化。

3. 琼脂糖微凝胶的破碎与洗涤

  1. 使用装有20 G针头的3 mL注射器从收集管中移除下层油相，注意不要扰动上层的琼脂糖液滴。
  2. 用全氟辛醇（PFO）破乳。
    1. 向琼脂糖液滴中加入1 mL体积分数为10%的PFO/HFE溶液。用移液器上下吹打1分钟，充分包覆乳滴。
      注意：所有微凝胶洗涤步骤均使用1,000 µL吸头进行移液操作。移液后，微凝胶悬液应呈现均匀状态，无团块。
    2. 将锥形管在2,000 × g条件下离心1分钟以收集琼脂糖微凝胶。通过抽吸去除PFO/HFE上清液；此时微凝胶已去除表面活性剂层，外观变得透明。
  3. 用含表面活性剂的正己烷溶液洗涤微凝胶。
    警告：正己烷为挥发性有机溶剂，步骤3.3中的洗涤操作应在通风橱中进行。
    1. 向琼脂糖微凝胶中加入2 mL体积分数为1%的失水山梨醇单油酸酯非离子表面活性剂（见材料表）的正己烷溶液。上下移液10次以混匀，确保微凝胶沉淀完全分散。
    2. 将管子在1,000 × g条件下离心1分钟以收集微凝胶。抽吸去除表面活性剂/正己烷上清液。
    3. 重复一次表面活性剂/正己烷洗涤步骤。
  4. 用含水缓冲液洗涤微凝胶，以去除残留的有机溶剂。
    1. 向锥形管中加入5 mL TET缓冲液[含体积分数0.1%的辛基酚聚氧乙烯醚非离子去污剂（见材料表）的1× TE缓冲液]。上下移液10次以混匀。
    2. 将锥形管在2,000 × g条件下离心2分钟以收集微凝胶。抽吸去除TET缓冲液上清液。
    3. 重复TET缓冲液洗涤两次。
    4. 向锥形管中加入5 mL 1× TE缓冲液。上下移液10次以混匀。
    5. 将锥形管在2,000 × g条件下离心2分钟以收集微凝胶。抽吸去除TE缓冲液上清液。
    6. 重复一次TE缓冲液洗涤。
  5. 取10 µL凝胶样品，加入1×核酸染料（见材料表）染色，然后在显微镜下以400倍放大观察，验证微凝胶中的细胞包封情况。
    注意：在明场通道下，微凝胶呈透明状；而在GFP通道（激发/发射波长为497/520 nm）下，细胞DNA会发出荧光。明场与荧光通道叠加图像可显示微凝胶内的细胞，如图4A所示。

4. 通过溶菌酶在琼脂糖中裂解细胞

  1. 使用800 µL TE缓冲液（1x）、2 µL酵母裂解酶（5 U/µL储存液，终浓度10 U/mL）、30 µL二硫苏糖醇（1 M储存液，终浓度30 mM）、60 mg溶菌酶（冻干粉末）、15 µL EDTA（0.5 M储存液，终浓度7.5 mM）、2 µL溶壁酶（100 U/µL储存液，终浓度200 U/mL）、2 µL溶葡萄球菌素（10 U/µL储存液，终浓度20 U/mL）和30 µL NaCl（1 M储存液，终浓度30 mM），配制1 mL裂解酶混合液。
  2. 加入额外的TE缓冲液，使总体积达到1 mL。通过涡旋振荡充分混匀溶液。
  3. 将全部1 mL裂解酶溶液加入不超过1 mL的洗涤后微凝胶中。用移液器吹打混匀10次。在37 °C摇床中孵育混合物，时间不少于>2小时（最长可过夜孵育）。

5. 基于去污剂的微凝胶处理

  1. 通过裂解酶裂解后（步骤4），洗涤微凝胶。
    1. 在2,000 × g下离心微凝胶2分钟，吸除上清液。由于细胞碎片分散在沉淀中，液滴将呈现不透明的白色。
    2. 将微凝胶重悬于5 mL的10 mM Tris-HCl缓冲液中，并上下吹打10次以混匀。
    3. 在2,000 × g下离心混合物2分钟，然后通过抽吸去除上清液。
  2. 对微凝胶进行去垢剂处理。
    1. 将凝胶重悬于十二烷基硫酸锂（LiDS）裂解缓冲液（含0.5% w/v LiDS的20 mM Tris-HCl）中，并加入60 µL的0.5 M EDTA，最终体积为3 mL。
    2. 加入5 µL蛋白酶K（储存浓度为800 U/mL）。上下吹打10次以混匀，然后将混合物置于42 °C金属浴中孵育1小时，以溶解细胞膜并消化蛋白质。
  3. 去垢剂处理后，洗涤微凝胶。
    1. 将含有微凝胶的锥形管在2,000 × g下离心2分钟，通过抽吸去除上清液。
    2. 用10 mL含2% v/v吐温-20（polysorbate 20）的水溶液洗涤微凝胶。上下吹打10次以混匀。
    3. 将锥形管在2,000 × g下离心2分钟，然后通过抽吸去除上清液。
    4. 用10 mL 100%乙醇洗涤微凝胶，以灭活任何残留的酶。上下吹打10次以混匀。
    5. 将锥形管在2,000 × g下离心2分钟，然后通过抽吸去除上清液。
    6. 用10 mL含0.02% v/v吐温-20（polysorbate 20）的水溶液洗涤微凝胶。上下吹打10次以混匀。
    7. 将锥形管在2,000 × g下离心2分钟，然后通过抽吸去除上清液。
    8. 重复吐温-20（polysorbate 20）洗涤3次。在最后一次洗涤前，将溶液通过100 µm细胞滤筛，以去除任何大块聚集体。
  4. 将微凝胶重悬于5 mL的10 mM Tris-HCl缓冲液中，以防止DNA降解。在进行标签化反应（步骤7）之前，微凝胶可在4 °C下保存最多1周。

6. 通过数字PCR生成条形码液滴

  1. 在低吸附管中，用1x TE缓冲液配制500 pM的BAR引物储备液（表2）。每次使用前，将引物稀释至1 pM的工作浓度，并在加热块上70 °C加热1分钟。
  2. 配制150 µL的PCR反应体系：加入75 µL高保真热启动预混液（见材料表）（2x）、42 µL PCR级水、3 µL DNA_BAR引物（10 µM储备液，终浓度0.2 µM）、3 µL P7_BAR引物（10 µM储备液，终浓度0.2 µM）、6 µL条形码稀释液（1 pM储备液，终浓度40 fM）、6 µL吐温20（50% v/v储备液，终浓度2%）和15 µL PEG 6k（50% w/v储备液，终浓度5%）。用移液器吹打混匀10次。
  3. 准备一支HFE背衬注射器：将200 µL HFE油吸入注射器，安装针头。将一段PE管连接至针头，并手动预润管路。将PE管末端插入目标溶液中，小心吸取全部150 µL PCR混合液进入PE管和注射器中。将注射器装入注射泵。
  4. 取一支1 mL注射器，装入含2% w/w全氟聚醚-聚乙二醇（PFPE-PEG）表面活性剂的氟化油（HFE），安装针头后放入注射泵中。
  5. 使用共流式液滴生成装置制备25 µm的条形码液滴。
    注：参见图3A中的装置示意图，了解试剂入口和出口的位置。
    1. 用一小段铅焊料封堵共流式液滴生成装置的细胞入口。
    2. 使用PE管段将装有HFE油和PCR混合液的注射器连接至微流控装置的入口，其中条形码PCR混合液使用熔融琼脂糖入口。在将管路插入装置前，先启动泵以排除管路中的空气。
    3. 将一段管路连接至出口，并将自由端放入0.2 mL PCR管中。采用以下（推荐）流速生成液滴：HFE含2% w/w PFPE-PEG的流速为600 µL/h，PCR混合液流速为200 µL/h。将生成的液滴收集至PCR管中，每管约收集50 µL液滴。
  6. 液滴生成后，使用凝胶加样枪头小心移除乳液下层的HFE油，并替换为含5% w/w PFPE-PEG表面活性剂的FC-40氟化油。按以下程序进行热循环：98 °C预变性3分钟；40个循环（98 °C变性10秒，62 °C退火20秒，72 °C延伸20秒）；72 °C终延伸5分钟；然后保持在12 °C。
    注：热循环后的液滴可在4 °C保存最多1天。
  7. 验证条形码扩增效率和包封率。
    1. 在含2% w/w PFPE-PEG表面活性剂的HFE油中配制1x核酸染料（见材料表）；该染料在HFE中微溶，可结合液滴中的DNA。
    2. 将1 µL热循环后的条形码乳液加入10 µL染色油中，室温孵育5分钟。
    3. 使用荧光显微镜（GFP通道，激发/发射波长497/520 nm）在200倍放大下观察液滴，并计算条形码包封率。注意信号呈离散分布：含有扩增条形码的液滴会明显荧光，而空液滴则呈暗态（图4B）。

7. 在液滴中对基因组DNA进行标签化片段化

注意：见图2B。

  1. 使用下一代测序文库制备试剂盒中的试剂（参见材料表）配制500 µL的标签化（tagmentation）溶液。加入7 µL标签化酶、250 µL标签化缓冲液和243 µL PCR级水。通过涡旋混合均匀后离心收集。将该溶液装入一个以HFE油为背衬的1 mL注射器中，并安装针头。
  2. 为重新注射准备微凝胶。
    1. 将微凝胶管在2,000 × g下离心2分钟，吸除上清液。使用加样枪头将200 µL凝胶转移至一个以HFE油为背衬的注射器顶部，并用一小片胶带密封喷嘴。
    2. 使用3D打印的离心机适配器（参见补充文件1和补充文件2），将装有微凝胶的注射器在3,000 × g下离心3分钟。
    3. 使用加样枪头从注射器中移除液体上清液。将微凝胶层推至注射器喷嘴底部，并安装针头。
  3. 将含有2% w/w全氟聚醚-聚乙二醇（PFPE-PEG）表面活性剂的氟化油（HFE）装入3 mL注射器中，安装针头后置于注射泵中。
  4. 将微凝胶重新包封进含有标签化试剂的液滴中。
    注：参见图3B中的装置示意图，了解试剂入口和出口的位置。
    1. 使用PE管将装有HFE油、标签化混合液和微凝胶的注射器连接至微流控装置的入口。在将管道插入装置前，先启动泵以排除管路中的空气。
    2. 将一段管道连接至出口端，并将自由端放入一个空的1 mL注射器中，活塞拉至1 mL刻度线处。
    3. 采用以下推荐的流速生成液滴：HFE含2% w/w PFPE-PEG的流速为2,000 µL/h，微凝胶流速为200 µL/h，标签化混合液流速为500 µL/h。
  5. 在400倍光学显微镜下观察微凝胶的包封率。约80–90%的液滴应包含一个微凝胶，如图4C所示。
  6. 为装有标签化乳液的注射器安装针头，并将其直立放置于金属浴或烘箱中，在55 °C下孵育1小时，以片段化基因组DNA。

8. 基于微流控双融合的单细胞条形码标记

注：参见图2C。

  1. 通过将FC-40油相替换为含2% w/w PFPE-PEG的HFE油，制备用于合并的条形码液滴。小心地将这些液滴转移至1 mL注射器中，安装针头，并放入注射泵中。
  2. 将孵育并已完成标签化片段化处理的微凝胶液滴注射器装入注射泵。
  3. 配制500 µL PCR反应混合液。按以下顺序添加试剂，以防止沉淀形成：140 µL PCR级水、10 µL P5_DNA引物（10 µM母液，终浓度0.2 µM）、10 µL P7_BAR引物（10 µM母液，终浓度0.2 µM）、50 µL PEG 6k（50% w/v母液，终浓度5%）、50 µL 吐温20（50% v/v母液，终浓度5%）、250 µL Taq Master Mix（2x）（参见材料表）、10 µL等温扩增聚合酶（参见材料表）以及10 µL中和缓冲液（参见材料表）。用移液器反复吹打10次混匀，短暂离心收集液体。将该溶液装入背衬HFE的1 mL注射器中，安装针头后置于注射泵中。
  4. 将三个3 mL注射器装满含有2% w/w全氟聚醚-聚乙二醇（PFPE-PEG）表面活性剂的氟化油（HFE），每个注射器安装针头后放入注射泵中。
  5. 将三个1 mL注射器装满2 M NaCl溶液，每个安装针头后备用。
  6. 使用双合并装置将条形码液滴、标签化基因组液滴与PCR混合液进行合并。
    注：参见图5中的装置示意图，了解试剂入口、电极入口及出口的位置。
    1. 使用PE管将3个NaCl注射器连接至2个电极入口和1个护城河（moat）入口。对于电极通道，手动施加压力使盐溶液完全充满电极。电极充满后，手动对护城河注射器施压，直至护城河充满。用一小段铅焊料封住护城河出口端。
    2. 将安装在泵上的3个HFE注射器通过PE管分别连接至2个间隔油入口和液滴生成油入口。在将管道插入装置前，先启动泵以排除管路中的空气。
    3. 使用PE管将PCR混合液注射器、微凝胶液滴注射器和条形码液滴注射器分别连接至对应的入口。在将液滴重注入管路连接至注射器针头前，先用防静电枪处理所有管路；该防静电处理可降低PE管表面静电荷引起的液滴融合风险。
    4. 将一段PE管连接至出口端，并将自由端放入0.2 mL PCR管中。
    5. 使用鳄鱼夹将电极注射器的针头连接至冷阴极荧光逆变器。将逆变器的直流电源设置为2 V。
    6. 以推荐流速运行双合并装置：标签化微凝胶液滴为300 µL/h，条形码液滴为100 µL/h，HFE 2% w/w PFPE-PEG（液滴生成油）为1500 µL/h，扩增混合液为600 µL/h，HFE 2% w/w PFPE-PEG（条形码间隔油）为200 µL/h，HFE 2% w/w PFPE-PEG（微凝胶间隔油）为700 µL/h。将生成的液滴收集至PCR管中，每管约含50 µL乳液。
  7. 在热循环前，使用凝胶加样枪头小心移除乳液下层的HFE油，并替换为含5% w/w PFPE-PEG表面活性剂的FC-40氟化油。按以下程序进行热循环：65 °C 5分钟，95 °C 2分钟，30个循环（95 °C 15秒，60 °C 1分钟，72 °C 1分钟），72 °C 5分钟，最后在12 °C保温。
  8. 从热循环后的液滴中回收带条形码的DNA。
    1. 将液滴汇集至微量离心管中，加入20 µL PFO破乳。涡旋振荡10秒以混匀。
    2. 在10,000 x g下离心1分钟，使混合物分层为水相（上层）和油相（下层）。小心吸取上层水相转移至新的微量离心管中，弃去油相。
    3. 根据制造商说明书，使用离心柱纯化带条形码的PCR产物，并用20 µL 1x TE缓冲液洗脱。
    4. 继续进行第9和第10步的测序与分析。

9. 文库构建与测序

  1. 按照制造商的方案进行片段大小选择和定量，制备用于测序的单细胞文库。
  2. 使用默认化学方法对双端文库进行Read 1和Read 2测序。使用定制的Index 1引物I7_READ（表2）进行15 bp的index读取，对应于单细胞条形码。

10. 单细胞数据分析

注意：用于 SiC-seq 数据质量控制和初步分析的自定义 Python 脚本可从 https://www.github.com/AbateLab/SiC-seq 下载。

  1. 运行脚本 "barcodeCleanup.py" 对带条形码的测序读段进行质量控制，并将单细胞数据导出至 SQLite 数据库。对于对照实验，使用该脚本并设置 "-align" 标志，以将读段比对至已知参考基因组。
  2. 使用脚本 "purity.py" 分析条形码组的纯度（用于对照实验），并确认纯度值较高，与 图 6B 一致。

结果

SiC-seq 实验流程包含3个采用软光刻技术制备的PDMS微流控装置（图1）。共流式液滴生成器（图3A）用于生成25 µm的数字条形码液滴，以对基因组DNA进行标记，并赋予每个单细胞唯一的标识符。条形码寡核苷酸包含一段15 bp的随机序列，两侧为用于扩增的PCR接头（表2，BAR引物）。将条形码稀释至飞摩尔浓度，以实现单分子封装，每个液滴中包含0个或1个条形码片段。含有条形码的液滴随后进行扩增，产生大量双链条形码扩增子。使用核酸染料检测扩增是否成功，并量化条形码片段的封装效率（图4B）。微凝胶通过将细菌细胞悬液与熔融琼脂糖凝胶以相等流速共流生成（图2A）。琼脂糖配制浓度为最终所需浓度的两倍，因为在共流液滴生成过程中，水相溶液会被有效稀释两倍。随着琼脂糖冷却，其固化形成直径为25 µm的微凝胶，占据液滴的球形空间。

一系列洗涤和裂解步骤可纯化微凝胶中的高分子量基因组DNA（图2B）。破乳后，使用大体积的水相溶液进行洗涤，以稀释可能抑制后续酶促反应的微量有机溶剂。通过显微镜观察经洗涤的微凝胶，以验证细胞包封率（图4A）。向微凝胶悬浮液中加入具有广谱裂解活性的酶混合液，以降解细菌和真核微生物的细胞壁19。随后用蛋白酶K和去垢剂进行第二次处理，以降解蛋白质并溶解细胞碎片。

为避免小片段的标签化DNA在微凝胶之间扩散可能导致的交叉污染，对纯化后的DNA在液滴中进行标签化（tagmentation）处理18。液滴封装装置（图3B）将每个微凝胶与缓冲液及标签化酶分隔在独立的液滴中，该酶可同时将双链DNA打断并用预加载的寡核苷酸对其进行“标记”20。微凝胶以紧密堆积的颗粒形式被加载至液滴中，实现接近每个液滴封装一个微凝胶的效率，且双包率极低21（图4C）。

在微流控工作流程的最后一步（图2C），设备通过一个双合并操作，在受控的两步过程中将1个条形码液滴、1个含微凝胶的液滴以及扩增混合液进行整合。首先，含有PCR试剂的液滴在黄色区域（图5）与条形码液滴配对并合并。微流控通道中的盐水电极产生高电场梯度，从而触发液滴合并。随后，第一个合并后的液滴在红色区域以类似方式与含微凝胶的液滴配对，并进行第二次合并。合并后的液滴被收集，并在芯片外通过单重叠延伸（SOE）PCR进行热循环扩增。条形码与经标签化处理的基因组DNA之间的互补重叠末端可实现融合，并仅对正确标记的构建体进行指数级扩增。

测序数据首先根据读段质量进行过滤，然后通过将读段按其15 bp的单细胞条形码序列进行分组来解析。一个条形码组要被视为有效，必须包含最低数量的读段；该阈值设定可将分析限制在具有足够测序数据量的细胞，并去除发生PCR突变的条形码 "孤儿" 从数据集中。在此样本运行中，每组的最小值设定为 7.5 kbps（每组 50 条读段，每条 150 bp）。条形码计数与组大小的直方图显示，大量有效条形码组的大小仅略高于阈值大小（图6A).

在已知微生物群落组成的对照实验中，使用纯度和相对丰度指标来评估 SiC-seq 运行的质量。此处分析了一个由 3 种革兰氏阴性菌、5 种革兰氏阳性菌和 2 种酵母组成的合成 10 细胞群落。给定条形码组的纯度定义为该组中比对到最常见基因组的读段数除以该组总读段数。绝大多数条形码组的纯度均高于 0.95（图 6B）。细胞类型的相对丰度通过统计原始读段数和条形码组数来计算，其中每个条形码组根据其成员读段的一致性被分配一个细胞类型（图 6C）。读段数与条形码组数的丰度呈大致相同比例变化，表明细胞群体的取样方式使得某些物种未被过度集中于过小或过大的条形码组中。绘制来自单一物种所有条形码组的总覆盖度，显示在整个基因组范围内具有高覆盖度，且几乎不存在或仅有极少的覆盖缺失区域（图 7）。覆盖度的均匀性可通过归一化覆盖度值的频率分布进行验证，大多数值集中在平均值附近（图 7，插图）。

figure-results-1
图 1：通过光刻技术制备微流控装置。（A）通过在硅片上旋涂一层 SU-8 光刻胶来制备具有单一特征高度的母模。随后使用光刻掩模和紫外光对光刻胶进行图案化，使曝光区域的 SU-8 发生交联。最后，未交联的 SU-8 在显影液中溶解。所得的模具用于浇铸 PDMS，并与载玻片键合，从而制成完整的微流控装置。（B）对于双层装置，其制备同样始于旋涂和曝光步骤，随后重复这些步骤以构建双层结构。请点击此处查看该图的放大版本。

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图2： SiC-seq 工作流程概述。 (A) 在液滴生成装置中，将微生物悬液与熔融琼脂糖共流，以将单个细胞包裹在微凝胶中。B微凝胶经过一系列洗涤步骤以纯化细菌基因组DNA。裂解酶消化革兰氏阳性菌和酵母的细胞壁，去污剂溶解细胞碎片。微凝胶被重新包封到液滴中进行标签化（tagmentation），以减少交叉污染。C微流控融合以一定速率将数字PCR条形码、经标签化剪切的微凝胶基因组以及扩增混合物组合在一起 >1 kHz。片外SOE-PCR将独特的单细胞条形码连接到经标签化处理的基因组上，并选择性扩增完全带有条形码的构建体。 请点击此处以查看此图的放大版本。

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图3： 用于液滴生成和微凝胶再包封的微流控装置。（A）本图展示了一种共流式液滴生成装置（特征高度为25 µm）。细胞和熔融琼脂糖以相等的流速注入装置，在25 µm × 25 µm的交汇处生成25 µm的液滴。在数字条形码液滴生成过程中，细胞入口被封闭，PCR反应混合物被引入琼脂糖入口。（B）本图展示了一种微凝胶再包封装置（特征高度为25 µm）。微凝胶通过漏斗形入口流入，以维持其紧密排列的有序结构，并在进入25 µm × 30 µm交汇处进行再包封前，接收一定体积的标签化混合物。请点击此处查看该图的放大版本。

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图4：液滴和微凝胶的显微图像。（A）本图显示酶解前洗涤后的25 µm微凝胶。细菌经荧光染色，用于量化包封率。根据泊松加载统计，为最大限度降低多重包封事件的发生频率，细胞的包封率应控制在每10个液滴或更少包含1个细胞。（B）本图显示经核酸染料染色的25 µm数字条形码液滴的荧光显微图像。含有扩增条形码片段的液滴产生强烈的荧光信号。（C）本图显示重新包封于50 µm液滴中的微凝胶。微凝胶的紧密堆积使得包封率接近每个液滴1个凝胶，且双包封情况较少。请点击此处查看该图的放大版本。

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图5：用于单细胞基因组条形码编码的微流控双融合装置。 通过两步融合操作，以高通量方式将条形码液滴与经标签化剪切的基因组合并。首先生成PCR混合液液滴，并在黄色区域利用盐水电极将其与条形码液滴融合。随后，引入含有微凝胶的液滴，并在红色区域进行第二次融合。油相入口可精确控制重新注入液滴之间的间距。条形码重注室及其间隔油相位于较短的25 µm层上，以蓝色阴影表示。所有其他装置结构均属于较厚的层，总高度为45 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

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图6：10个细胞合成微生物群落的条形码组指标。（A）本图显示了条形码组大小的分布情况。随着组大小的增加，特定大小的组数量呈指数级下降。每组至少7.5 kbps的最低阈值限制了分析范围，仅保留信息量足够的组，并去除了PCR突变产生的序列“孤儿”。（B）本图显示了条形码组纯度的分布情况。绝大多数（>90%）的组具有很高的纯度（>95%）。（C）本图显示了在测序读段和条形码组水平上计算得到的10个物种的相对丰度。两种计数方法产生相似的结果，表明不同物种间的条形码组大小具有一致性。请点击此处查看该图的放大版本。

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图7基因组覆盖度的总和 枯草芽孢杆菌 条形码组 所有比对到该细菌的条形码组的测序读段 B. subtilis （N = 9,398）被合并后进行整体分析。环形覆盖度图展示了SiC-seq读段的覆盖均匀性，未见明显的覆盖缺失区域。圆周周围的虚线表示平均覆盖深度（5.55x）。插图中的相对覆盖频率直方图显示，大部分碱基的覆盖深度接近全基因组平均水平，该水平由虚线表示。 请点击此处以查看此图的放大版本。

装置第一层高度 (µm)第一层旋转速度 (rpm)第二层高度 (µm)第二层旋转速度 (rpm)
共流液滴生成器254000N/AN/A
凝胶再包封装置254000N/AN/A
双融合装置254000205000

表1：微流控器件制备参数。 本表列出了在SiC-seq工作流程中使用的微流控器件及其光刻胶旋涂所需的转速（依据SU-8 3025生产商的技术规格）。

标签序列 (5' > 3')
BARGCAGCTGGCGTAATAGCGAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGNNNNNNNNNNNNNNNTAAGCCAGCCCCGACACT
DNA_BARCTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA
P7_BARCAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGCTGGCGTAATAGCG
P5_DNAAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTC
I7_READGCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA

表2：引物序列。

补充文件 1： 请点击此处下载该文件。

补充文件 2： 请点击此处下载该文件。

讨论

SiC-seq 微流控工作流程可从数千个细菌细胞中生成单细胞基因组测序数据。数字条形码被拼接到微凝胶包裹的细胞基因组上，从而允许通过in silico方法将高通量测序（NGS）数据解卷积为来自同一细胞的条形码读段组。为了评估条形码组的纯度，必须使用已知组成的微生物群落进行对照实验。若低纯度组占比较大，表明细胞包封率过高，或在微流控处理步骤中发生了显著的液滴交叉污染。根据泊松统计，条形码与细胞的包封应达到每10个液滴中包含1个颗粒的目标比例，以将多重包封事件的发生率限制在所有非空液滴的5%以下。包封率超过此值将导致双细胞包封率呈指数级上升，因此在液滴生成过程中验证包封比例至关重要。用户应特别警惕单个微凝胶中包封多个细胞的情况，因为共享相同条形码序列的不同细胞所产生的读段无法通过生物信息学手段分离。如果单个细胞获得了两个不同的条形码，则条形码组的纯度不受影响，但在按条形码序列计数时会导致丰度度量出现偏差。

由于合并条件不理想，也可能导致液滴交叉污染。在成功操作过程中，微流控合并装置（图5）可精确地将1个条形码液滴与1个微凝胶及一定体积的PCR试剂可控配对。非理想的流速会导致液滴配对比例错误：例如，1个条形码可能与2个微凝胶配对。本方案中列出的所有流速均为估算值，可能需要根据装置几何结构和液滴尺寸的微小差异进行相应调整。具备高速录像功能相机（>10,000帧/秒）的用户，应在微流控操作开始阶段及整个过程中验证液滴合并的正确性。无高速相机的用户可收集少量合并后的输出液滴，在显微镜下手动测量液滴尺寸。液滴尺寸应保持均一：若存在大量未合并的条形码液滴或微凝胶液滴，则表明需相应降低重注入速率。

在处理微凝胶和微液滴时，应采取若干常规预防措施以保持其完整性。微凝胶虽然具有一定的机械强度，但在进行破碎和洗涤步骤之前必须充分冷却，以确保完全凝胶化。若微凝胶呈现非球形，表明琼脂糖未获得足够时间充分固化。洗涤微凝胶时，应以指定转速离心悬浮液，避免产物损失。琼脂糖水凝胶的折射率与水相近，在离心管中可能难以观察22，因此操作者在吸取液体前应仔细识别凝胶与液体之间的界面。水包油液滴易因实验手套和管路表面积累静电而发生聚并23。因此，我们建议使用徒手加载液滴重注注射器，并在启动泵之前，使用防静电枪处理所有重注管路。可通过缓慢旋转注射器中的乳液，并手动吸取因浮力较大而聚集在上部的较大液滴，从而去除发生聚并的大液滴。

SiC-seq 是首个实现单细胞基因组测序的技术 >50,000 个细菌细胞。该平台在通量方面较现有方法具有显著优势，能够对异质性微生物群落进行更深入的取样。迄今为止，用于单细胞基因组测序的微流控技术均采用微腔结构9 和微孔24 用于细胞分离与扩增，但通量仅限于数十至数百个细胞。将单个细胞通过流式分选进入孔板5,6 不需要专门的微流控仪器，但通量同样较低。鉴于环境中采集的土壤和水样通常具有较高的α多样性 >1,000 个物种水平25,26，SiC-seq 由于能够取样更多数量的生物体而具有显著优势。SiC-seq 的工作流程可适用于来自实验室培养、自然环境或活体宿主的细胞输入。细胞样品只需处于水相悬浮状态，并去除大颗粒即可>10 µm）适用于微流控封装。例如，该方法此前已应用于海水样品，通过一系列洗涤和过滤步骤在封装前对细胞进行预处理17.

SiC-seq 技术从每个单细胞产生的测序数据相对稀疏，可能不适用于所有应用场景。某些生物信息学算法，例如从头基因组组装或单核苷酸变异（SNV）检测，需要更高的测序覆盖深度才能有效运行。作为替代方案，可通过分类学分箱方法27对条形码组进行体外聚类，从而使算法能够应用于更大规模的测序读段集合。此外，SiC-seq 流程整体条形码标记效率相对较低，在输入样本量有限的情况下可能带来挑战。SiC-seq 依赖于符合泊松分布的条形码封装步骤，因此大约仅有 10% 的细胞能够获得分子条形码，并在最终文库构建步骤中被扩增。尽管这一效率与其他基于微滴的条形码技术相当10，但对于珍贵细胞样本的操作者而言，可能难以获得足够的文库产量用于测序，因而可能需要增加最终扩增步骤中的 PCR 循环次数。对于具备微流控技术经验的操作者，另一种潜在解决方案是在数字 PCR 步骤后对携带阳性条形码的微滴进行分选，从而将整体条形码效率提升至>85%28。

SiC-seq 技术未来可能的发展方向之一是将该工作流程适配用于哺乳动物细胞，从而为新的临床单细胞研究铺平道路。例如，对单个癌细胞中拷贝数变异的分析可能加深我们对异质性在癌症病理中作用的理解2。此外，将 SiC-seq 与现有方法相结合，用于探测和富集感兴趣的 DNA 序列29，将实现对细胞亚群或稀有细胞株的靶向单细胞测序。对于环境样本，可靶向已知代谢通路中的基因，并与邻近基因进行上下文联合分析，以鉴定新的基因组岛。在人体宿主环境中，可对低滴度的致病菌样本进行单细胞水平的分离与测序，以更深入地研究其毒力表型的基因型起源。

披露

与该工作流程相关的专利可能已授权给 Mission Bio，而 Adam R. Abate 是该公司的股东。

致谢

本工作得到了美国国家科学基金会职业奖（资助号 DBI-1253293）；美国国立卫生研究院（NIH）（资助号 HG007233-01、R01-EB019453-01、1R21HG007233、DP2-AR068129-01、R01-HG008978）；以及美国国防高级研究计划局生命制造计划（合同号 HR0011-12-C-0065、N66001-12-C-4211、HR0011-12-C-0066）的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3" 硅片，P型，原始测试级University Wafers447
SU-8 3025 光刻胶Microchem17030192
旋涂仪Specialty Coating SystemsG3P-8
光掩模CadArt Servcies(定制)参见补充文件中的掩模设计
PGMEA 显影液Sigma-Aldrich484431
异丙醇Sigma-Aldrich109827
Sylgard 184 硅橡胶弹性体试剂盒Krayden4019862
脱气室Bel-Art42025
0.75 mm 活检打孔器World Precision Instruments504529
玻璃显微镜载玻片 (75 mm × 50 mm)Corning294775X50
Aquapel（疏水性玻璃处理剂）Pittsburgh Glass Works47100
PE-2 聚乙烯管Scientific CommoditiesB31695-PE/2
1 mL 注射器BD309628
27 号针头BD305109
注射泵New Era Pump SystemsNE-501
Novec HFE-7500 氟化油 (HFE)3M98-0212-2928-5
FC-40 氟化油Sigma-AldrichF9755
PEG-PFPE 表面活性剂Ran Biotechnologies008-FluoroSurfactant
电暖器Lasko CD09250 
低凝胶温度琼脂糖Sigma-Aldricha9414
TE 缓冲液 (10X)Rocklandmb-007
PBS 1X, pH 7.4E&K Scientific ProductsEK-65083
OptiPrep（密度梯度介质）Sigma-Aldrichd1556
1H,1H,2H-全氟-1-辛醇 (PFO)Sigma-Aldrich370533
Span 80（单油酸山梨醇酯）Sigma-Aldrichs6760
己烷Sigma-Aldrich139386
Tween 20（聚山梨酯20）Sigma-Aldrichp2287
溶菌酶 IV 型MP Biomedicals195303
突变溶菌酶 (Mutanolysin)Sigma-AldrichM9901
Zymolyase（酵母裂解酶）Zymo Researche1004
溶葡萄球菌素 (Lysostaphin)Sigma-AldrichL7386
氯化钠Sigma-AldrichS9888
EDTASigma-AldrichE6758
Tris-HCl, pH 7.5, 1MInvitrogen15567-027
二硫苏糖醇 (DTT)Teknovad9750
十二烷基硫酸锂Sigma-AldrichL9781
蛋白酶KNew England BiosciencesP8107S
乙醇，200 证明（100%）KoptecV1001
SYBR Green I（核酸染料）InvitrogenS7563
PEG 6kSigma-Aldrich81260
Triton X-100（辛基酚聚氧乙烯醚）Sigma-Aldricht8787
Nextera DNA 文库制备试剂盒IlluminaFC-121-1030
Phusion Hot Start Flex Master Mix（高保真热启动预混液）New England Biosciencesm05365
Platinum Multiplex PCR Master Mix（Taq 预混液）Applied Biosystems4464263
Warmstart 2.0 Bst 聚合酶（等温扩增聚合酶）New England Biosciencesm0538m
Nextera XT 试剂盒中的 NT 缓冲液（中和缓冲液）IlluminaFC-131-1024
冷阴极荧光逆变器(定制)(定制)
直流电源MastechHY1503D
Zerostat 3 防静电枪Milty5036694022153
3D 打印离心机注射器支架(定制)(定制)参见补充文件中的 3D 打印文件
Zymo DNA Clean & Concentrator-5Zymo ResearchD4003

参考文献

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微液滴微流控细胞包封DNA标签化条形码合并微凝胶纯化高通量测序荧光油热循环
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