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方法文章

通过电穿孔法将质粒DNA递送至小鼠膀胱尿路上皮的新方法

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DOI：

10.3791/57649

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2018年5月3日

 ,  ,  , 
1Department of Molecular, Cell, and Developmental Biology, University of California, Santa Cruz

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们介绍一种将DNA质粒递送至小鼠膀胱尿路上皮细胞的新方法 体内 通过尿道插管和电穿孔技术，为建立膀胱疾病的同源小鼠模型提供了一种快速且便捷的方法。

摘要

基因工程小鼠模型（GEMMs）在揭示人类疾病（如癌症）发生与进展机制方面具有极高的价值。转基因小鼠和条件性基因敲除小鼠常被用于在特定组织或细胞类型中实现基因的过表达或缺失（体内）。然而，构建生殖系小鼠模型往往耗时较长且成本高昂。近年来，基因编辑技术的进步以及通过病毒感染递送DNA质粒的可行性，使得多种器官的非生殖系原位小鼠癌症模型得以快速建立。由于膀胱尿路上皮表面覆盖有一层糖胺聚糖，病毒载体难以进入，因此该器官一直较难进行有效基因递送。本文中，我们介绍了一种实验室开发的新型方法，可高效地将DNA质粒递送至小鼠膀胱尿路上皮（体内）。通过向膀胱内灌注pCAG-GFP DNA质粒并结合手术暴露后电穿孔处理，我们证实该质粒可特异性地进入膀胱尿路上皮细胞并实现瞬时表达。本方法为在小鼠膀胱中进行基因过表达和基因敲降提供了快速便捷的途径，也可应用于膀胱癌及其他泌尿系统疾病的GEMMs构建。

引言

基因工程小鼠模型（GEMMs）在拓展我们对动物发育和基因功能的认识方面一直发挥着至关重要的作用 体内及疾病进展的机制1,2生殖系基因工程小鼠模型（GEMMs）的传统构建方法主要有两种。第一种是通过将DNA质粒显微注射至受精卵原核中，随后将受精卵移植到假孕雌鼠体内，从而获得转基因小鼠。第二种是通过胚胎干细胞中的同源重组技术构建基因敲除或基因敲入小鼠，并进一步培育嵌合体小鼠。若需在特定组织或细胞类型中实现条件性基因敲除，则需将经过基因改造的等位基因与Cre重组酶及floxed位点小鼠进行多代杂交。整个过程成本高昂且耗时较长，尤其当目标是实现多个基因的组织特异性靶向时更为复杂。近年来，成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）等基因编辑技术已被应用于小鼠多个器官，以诱导组织特异性的遗传改变，从而建立自发性肿瘤模型。3,4,5,6,7 或纠正致病突变 原位8,9在这些研究中，gRNA 载体的递送通常通过腺病毒或慢病毒感染靶器官，或经水动力尾静脉注射实现。相较于传统的基于 Cre-Lox 的小鼠模型，CRISPR 组分递送至肺和肝的相对便捷性显著提高了在这些器官中建立癌症模型的便利性与效率。

膀胱尿路上皮是大多数膀胱肿瘤的起源部位。由于尿路上皮顶端表面存在一层糖胺聚糖，可作为感染性病毒黏附的屏障，因此将DNA载体递送至膀胱尿路上皮以进行癌症建模或基因治疗受到阻碍10,11。已有多种预处理试剂（如Syn3和十二烷基-β-d-麦芽糖苷）被用于破坏该屏障，从而提高腺病毒的感染效率12,13,14。然而，腺相关病毒（AAVs）是否能够有效感染膀胱尚未见报道。总体而言，一种非病毒介导的递送方法将更具优势。本文中，我们描述了一种实验室开发的新方法，通过尿道插管和电穿孔实现将DNA质粒高效递送至小鼠尿路上皮。由于该方法无需对糖胺聚糖层进行化学预处理，也无需制备病毒，因此显著简化了DNA质粒向小鼠膀胱尿路上皮的递送过程，有望促进多种膀胱疾病相关的体内研究。

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方案

此处所述所有操作均按照加州大学圣克鲁斯分校机构动物照护与使用委员会（IACUC）的指南和规定进行。

1. 质粒与工具准备

  1. 每个需要转染的膀胱，准备至少 20 µL 的 DNA 质粒（1 µg/µL）。
  2. 在 1.5 mL 微离心管中，向 20 µL 质粒溶液中加入 1 µL 台盼蓝，用移液器充分混匀。
  3. 对所有手术器械进行高压灭菌，并用 70% 乙醇消毒操作区域。在执行以下步骤时，频繁用 70% 乙醇喷洒手术器械和手套，或使用玻璃珠灭菌器 以维持无菌条件。

2. 动物麻醉

  1. 使用台式麻醉系统以异氟烷对动物进行麻醉。打开氧气2 储气罐并调节氧气流量计至1 L/min。
  2. 将一只成年雌性C57BL/6J小鼠放入诱导室中。打开异氟烷挥发器并调节至3%用于诱导麻醉，小鼠应在2分钟内进入麻醉状态。 将小鼠从诱导室取出后，皮下注射布托啡诺镇痛剂（0.1 mg/kg）以进行预先镇痛。
    注意：本实验方案使用雌性小鼠，因其在尿道插管过程中更易操作。该方案同样适用于雄性小鼠，但在执行步骤3时需格外谨慎。
  3. 为动物眼部涂抹眼药膏以防止干燥。将麻醉后的小鼠仰卧置于加热垫上，使其鼻部进入鼻罩。打开空气回路开关，使异氟烷通过鼻罩输送。
  4. 用胶带固定头部和鼻罩。将异氟烷挥发罐调节至2%以维持麻醉。
  5. 用胶带固定动物四肢，进行足趾夹捏测试以确认动物处于深度麻醉状态，然后剃除腹部区域的毛发。

3. 尿液去除与膀胱冲洗

  1. 将润滑剂涂抹在导管（24G，长度为2.11 cm，外径为0.045 cm）上，确保其外表面完全覆盖。
  2. 将导管插入尿道口，并缓慢推进直至进入膀胱，此时尿液应通过导管流出。轻轻按压腹部以帮助排空尿液。
    1. 通过观察尿液是否自动流出，检查导管是否正确插入膀胱。避免刺穿尿道或膀胱壁，必要时可多次涂抹润滑剂。
  3. 用移液器将尿液弃入废液杯中。
  4. 将80 µL磷酸盐缓冲液（PBS）通过移液器加入导管的外端，此时导管的另一端仍位于膀胱内。小心地将1 mL注射器连接至导管，轻柔推动注射器，将PBS注入膀胱。保留部分PBS在导管中，以避免在膀胱内产生气泡。
  5. 取下注射器，等待PBS从膀胱排出。轻轻按压腹部以排空PBS。
  6. 用移液器将导管中的PBS弃入废液杯中。
  7. 重复PBS冲洗步骤（步骤3.4 - 3.6）再进行两次。
    注意：在这些冲洗步骤中操作务必轻柔。若导管中出现血液或液体无法自动流出，通常提示尿道已被刺穿。同时应避免引入气泡，因为气泡会降低电穿孔效率。

4. 质粒递送

  1. 用70%乙醇擦拭小鼠腹部，使用手术刀在膀胱上方的腹部皮肤做1 cm的纵向切口。
  2. 用移液器将至少20 µL质粒与台盼蓝溶液加入导管的外端，并连接注射器。
  3. 将质粒溶液注入膀胱。若膀胱变为蓝色，则表明注射成功。导管中需保留少量液体，以避免在膀胱内产生气泡。
  4. 用镊子夹住尿道外口，然后移除导管和注射器。用细线结扎尿道外口，绕两圈后打两个结。
    注意：结扎尿道外口对于防止质粒溶液反流至关重要。
  5. 开启电穿孔仪，设置参数为：33 V，工作时间50 ms，间隔时间950 ms。
  6. 用镊子固定膀胱，并用两个电极夹住膀胱，踩下脚踏开关进行电穿孔。
    注意：每次踩下脚踏开关后，电脉冲将以短间隔连续进行5次。在此过程中，小鼠可能出现抽搐。多次踩下脚踏开关可提高质粒递送效率，但过多的电脉冲可能损伤尿路上皮的组织完整性。
    1. 避免镊子与电极之间发生接触，否则会产生电火花。

5. 恢复

  1. 使用无菌手术缝线和缝合钉闭合腹腔和皮肤切口，并在伤口处涂抹碘伏。
  2. 将动物从异氟烷麻醉系统中移出，皮下注射布托啡诺镇痛剂（0.1 mg/kg）以缓解术后疼痛。
  3. 将动物置于加热垫上，待其完全恢复意识后放回原饲养笼。每日至少检查一次，观察其活动能力、饮水和进食行为是否正常，且无感染迹象，直至切口愈合后拆除缝合钉。若动物出现理毛行为减少、攻击性增强或发声等疼痛症状，应追加注射布托啡诺镇痛剂。

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结果

为了验证基因递送至膀胱尿路上皮的成功效果，我们采用 pCAG-GFP15 质粒进行电穿孔。通过尿道注入 20 µL 质粒与台盼蓝溶液，并施加 5 次电脉冲。48 小时后，解剖小鼠膀胱并在解剖荧光显微镜下观察到 GFP 荧光呈斑块状分布，而未进行电穿孔的阴性对照膀胱则未检测到 GFP 信号（图 1A）。对膀胱组织切片进行细胞角蛋白（CK）5、CK18 和 GFP 抗体的免疫荧光染色后，我们发现 GFP 信号存在于伞细胞、中间细胞和基底细胞中，但不在肌层中（图 1B），表明质粒递送至尿路上皮具有良好的特异性。约 15% 的尿路上皮细胞呈 GFP+，这种克隆性特征适用于癌症建模，因为肿瘤通常起源于单个细胞。

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讨论

电穿孔可增强细胞膜通透性，是一种高效的基因电转移技术16活体啮齿类动物的基因递送常通过电穿孔技术在神经生物学领域中应用17,18,19,20,21其在其他多种器官中的潜在应用尚未得到充分探索。据我们所知，本文所述方法是首次成功通过电穿孔技术将基因递送至膀胱尿路上皮的报道。该方法相较于基于腺病毒或慢病毒的感染方法具有多项优势。首先，电穿孔技术更简便、安全且成本较低，因其采用非病毒性基因载体，并可将DNA质粒递送至特定器官部位 体内 相对简单。其次，它避免了病毒载体递送时常伴随的不良宿主免疫反应22第三，在膀胱的情况下，该方法避免了对糖胺聚糖层进行化学预处理的需要，而该层通常会阻断病毒与尿路上皮细胞的结合。...

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

感谢陈斌教授、张悦博士和Kendy Hoang在建立电穿孔系统方面提供的帮助。本工作获得了圣克鲁斯癌症受益集团和美国国立卫生研究院（NIH）向Z.A.W.提供的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BD 1 mL TB 注射器Fisher148232E
布托啡诺SigmaB9275-50MG
杜蒙特镊子Roboz Surgical InstrRS-5005手术使用前用 70% 乙醇处理
ECM830 SQ 波电穿孔仪Harvard Apparatus450052
Exel International 一次性安全型静脉导管Fisher Scientific14-841-2124G，长度 2.11 cm，外径 0.045 cm
超细显微解剖剪Roboz Surgical InstrRS-5135手术使用前用 70% 乙醇处理
异氟烷Vet one501017
K&H 小动物加热静卧垫，9 英寸 × 12 英寸Amazonn/a用纸巾覆盖加热垫
眼科软膏FisherNC0849514
PBS，pH 7.4Life Technologies10010049
移液器吸头 200 µLUSA Scientific1111-0206
移液器吸头，通用型；0.1 至 10 µLFisher02707438(CS)
PIPETMAN NEO P2GilsonF144561
PIPETMAN NEO P200NGilsonF144565
质粒 CAG-GFPAddgene16664
铂金镊状电极，5 mmHarvard Apparatus450489直径 5 mm
剪刀Roboz Surgical InstrRS-5880手术使用前用 70% 乙醇处理
绳线Amazonn/aMandala Crafts 150D 210D 0.8 mm 1 mm 平面蜡涂层皮革缝纫线
透明胶带（Scotch）Fisher19047257
兽用润滑胶 Therio-gelPBS animal health353-736
台盼蓝染色液Life Technologies15250061
V-1 台式麻醉系统VetEquip901806
薇乔紫线缝合线 18" FS-2 角针 5-0FisherNC0578475
Walgreens 聚维酮碘 10%Walgreens953982
伤口夹Fisher018045
伤口夹施加器Fisher01804

参考文献

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