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利用X射线晶体学与生物物理技术对具有免疫球蛋白折叠结构的糖蛋白进行表征

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DOI：

10.3791/57750

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2018年7月5日

 ,  ,  ,  , 
1Program in Molecular Medicine, The Hospital for Sick Children Research Institute, 2Department of Biochemistry, University of Toronto, 3Department of Immunology, University of Toronto

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们介绍了利用生物膜干涉技术、等温滴定热量法和X射线晶体学对具有免疫球蛋白折叠结构的糖蛋白进行生物物理和结构表征的方法。

摘要

细胞表面的糖蛋白在细胞功能中发挥关键作用，包括信号传导、黏附和转运。在白细胞上，多种此类糖蛋白具有免疫球蛋白（Ig）折叠结构，对免疫识别与调控至关重要。本文介绍了一个用于设计、表达及生物物理表征人B细胞受体CD22胞外域的平台。我们提出，这些方法可广泛应用于含有Ig结构域的哺乳动物糖蛋白胞外域的表征。采用两种悬浮培养的人胚胎肾细胞系HEK293F和HEK293S，分别表达携带复杂型和高甘露糖型糖链的糖蛋白。这些具有不同糖型的重组糖蛋白可用于研究糖链大小和组成对配体结合的影响。我们讨论了研究糖蛋白与生物学相关配体及治疗性抗体候选分子之间结合动力学和热力学的实验方案。由于HEK293S细胞产生的重组糖蛋白糖链均一性高、柔性较低，且可被内切糖苷酶H处理，因此适合用于结晶。我们介绍了将糖蛋白晶体分别浸泡于重原子和小分子溶液中，以进行相位确定和配体结合分析的方法。本文所述实验方案有望推动哺乳动物糖蛋白的表征研究，深入理解其功能，并揭示治疗药物的作用机制。

引言

表面蛋白在细胞功能中发挥着关键作用。通过其胞外结构域，这些膜蛋白可以调节细胞间相互作用、黏附、转运和信号传导1,2。由于这些蛋白定位于细胞外侧，使其成为开发治疗多种疾病（包括癌症和自身免疫性疾病）药物的理想靶点3,4,5,6,7。人类膜蛋白胞外区最常见的折叠结构之一是免疫球蛋白样（Ig）折叠，由七条或更多的β链组成两个β片层结构8,9。通常，含Ig结构域的糖蛋白是由多个结构域组成的复合体，其中Ig结构域依次排列在膜蛋白的胞外部分10。这些细胞表面蛋白的翻译后修饰，特别是N-连接和O-连接糖基化，在其调控、折叠、分泌和功能中已被证实具有重要作用11。为了更深入理解其功能，并更有效地设计靶向这些蛋白的治疗分子，亟需能够对其开展详细分子表征的技术。本文介绍了一组联合技术，可用于对含Ig结构域的膜糖蛋白的胞外区进行生物物理（生物层干涉技术（BLI）和等温滴定 calorimetry（ITC））和结构（X射线晶体学）表征，既可单独分析，也可 与其生物学相关配体或治疗分子形成复合物后进行分析（图1）。

N-连接糖基化是哺乳动物蛋白质中最常见的翻译后修饰之一，发生在蛋白质于内质网和高尔基体中成熟的过程中12,13细胞系，例如人胚肾（HEK）293细胞，已被开发用于大量重组表达糖基化的哺乳动物蛋白。14,15该细胞系已开发为悬浮培养形式，便于大规模扩增以生产较大量蛋白质。 与贴壁细胞系相比。在此，我们使用了两种 HEK293 细胞系：HEK293F 和 HEK293 Gnt I-/- （HEK293S），两者的区别在于后者缺乏N-乙酰葡萄糖胺基转移酶I（Gnt I）。因此，后者无法产生复杂的糖链（如HEK293F细胞中所见），而只能生成高甘露糖型糖链（主要为Man5GlcNAc2位于 N-连接糖基化位点18,19,20使用这两种细胞系进行平行实验，可研究糖链大小和复杂性对生物学功能及治疗靶向性的影响。事实上，HEK293F细胞产生的糖蛋白所携带的糖链比在HEK293S细胞中产生的相同糖蛋白具有更大的尺寸和更高的复杂性。由于HEK293S细胞中N-连接糖链的化学和构象异质性较低，其产生的糖蛋白更易于结晶。为进一步提高结晶能力，可在HEK293S细胞（而非HEK293F细胞）中表达的糖蛋白使用内切糖苷酶H（Endo H）处理，该酶可切割高甘露糖型糖链，使每个N-连接糖基化位点仅保留一个N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）基团。21,22. 也可采用其他方法限制细胞内N-糖链的加工，例如在糖蛋白表达过程中加入糖基转移酶抑制剂，如kifunensine23替代方法包括在HEK293F细胞中表达天然糖蛋白，随后使用肽-N-糖苷酶F（PNGaseF）进行酶法去糖基化。然而，研究表明在天然条件下使用PNGaseF去糖基化效率较低，并可能导致某些蛋白质发生聚集；在处理后蛋白质仍保持可溶的情况下，由于天冬酰胺残基脱酰胺转化为天冬氨酸，其表面会引入负电荷24，这可能不利于其结晶。预测的N-糖基化位点也可被突变，通常突变为丙氨酸或谷氨酰胺残基，以阻止这些位点发生N-连接糖基化，从而获得高度均一的糖蛋白样品。 Alternatively，糖蛋白也可在其他真核细胞表达系统中产生，包括酵母、昆虫和植物细胞系统，或其他哺乳动物细胞系，如中国仓鼠卵巢（CHO）细胞。16,17.

许多哺乳动物表达载体（包括pHLsec）可将重组糖蛋白胞外域分泌到细胞培养基中25。从HEK293细胞中分泌糖蛋白无需细胞裂解，从而实现快速且简便的纯化。在目标糖蛋白的N端或C端添加纯化标签（例如 His标签、Strep标签、Flag标签、Myc标签、HA标签），可通过一步亲和层析进行纯化。随后可采用尺寸排阻层析，以获得单一分散的样品，用于生物物理和结构表征。

在适当条件下，高纯度且均一的糖蛋白样品可形成衍射质量良好的晶体。一旦从此类晶体获得完整的X射线衍射数据集，便需要确定初始相位，以计算该糖蛋白的电子密度。得益于蛋白质数据库（Protein Data Bank, PDB）中结构数量的持续增长，目前最常用的相位确定方法是分子置换法（molecular replacement, MR），该方法利用已知的同源蛋白结构来获取初始相位26。然而，对于某些多免疫球蛋白结构域的糖蛋白，分子置换法有时无法解决相位问题27,28,29，此时则需要采用其他替代方法。本文详细描述了一种用于相位确定的重原子（heavy atom, HA）浸泡晶体的方法，该方法曾被用于解析CD22胞外域的结构28。选择合适的重原子进行相位测定是一个迭代过程，其结果取决于重原子的反应性、糖蛋白在特定晶格中可利用的原子种类以及结晶溶液的组成30,31。此外，若糖蛋白中半胱氨酸和甲硫氨酸残基所含的天然硫原子比例足够高，且能够收集到足够高冗余度的X射线衍射数据，则也可利用这些硫原子进行相位测定32,33。

膜糖蛋白的生物学功能通常由蛋白质-蛋白质相互作用或蛋白质-配体相互作用介导，例如与碳水化合物的相互作用。当配体足够小，能够从溶液中扩散至晶体晶格中糖蛋白的结合位点时，浸泡实验可能成功获得糖蛋白-配体共结晶结构，从而更深入地理解配体识别机制。

本文所述方案对于理解表面糖蛋白与合成治疗性配体34,35以及抗体类治疗药物36,37之间的相互作用同样具有重要意义。当结合结构信息时，结合动力学和热力学参数可用于深入理解并优化其作用机制。一种可用于分析治疗性抗体与糖蛋白结合动力学的技术是生物膜干涉技术（BLI）38,39。BLI利用固定了配体的生物传感器，测量其与结合伙伴的结合与解离动力学，最终确定平衡解离常数（KD）。BLI是一种颇具吸引力的方法，因其所需糖蛋白用量少（<100 µg）、实验时间短（每次运行约10–15分钟），且可实现自动化。等温滴定量热法（ITC）也适用于研究糖蛋白与其结合伙伴之间的亲和力40,41,42,43。尽管ITC在时间和试剂消耗上要求更高，但可获得有关相互作用热力学的宝贵信息（ΔG、ΔH、ΔS及化学计量比）。ITC还特别适用于研究通常与表面糖蛋白和配体之间瞬时结合相关的弱相互作用。此外，这些技术可联合使用，以评估不同构建体的结合特性，并分析在不同细胞系中表达糖蛋白所获得的不同N-连接糖型的影响。对在HEK293F、HEK293S细胞中表达并经Endo H处理产生的糖蛋白进行BLI和ITC分析，可深入揭示糖链在生物学活性及治疗作用中的功能。

我们成功应用这些方案对人CD22的胞外域（ECD）进行了表征28，CD22是一种唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素（Siglecs）家族的糖蛋白成员，在维持B细胞稳态中起关键作用44。我们通过深入的构建设计以促进结晶，并采用Hg进行重原子浸泡法对X射线数据集进行相位解析。此外，我们将CD22晶体与其配体唾液酸（α2-6 唾液乳糖）进行浸泡，获得了免疫受体-配体复合物的结构，从而为基于结构设计糖类模拟物提供了蓝图45,46。另外，我们制备了抗CD22治疗性抗体epratuzumab的抗原结合片段（Fab）——该抗体目前正处于非霍奇金淋巴瘤III期临床试验阶段47——并通过BLI和ITC测定其与不同糖基化修饰的CD22 ECD构建体之间的结合亲和力。这些研究揭示了N-连接糖基化在epratuzumab结合过程中的关键作用，对功能异常B细胞上CD22的识别具有潜在意义。

方案

1. 糖蛋白ECD的构建设计

  1. 使用 InterPro 和 Phyre2 服务器分析人类 CD22 的氨基酸序列（Uniprot），以鉴定蛋白质中预测的结构域元件及其边界48,49.
  2. 将人CD22的序列（缺失信号肽、跨膜区和胞质区，残基20-687，以下简称CD22胞外域，CD22 ECD）克隆至pHLsec哺乳动物表达载体中25 使用限制性内切酶 AgeI 和 KpnI (图2A)50.
    注意：pHLsec 载体经过优化，适用于在哺乳动物细胞中过表达可溶性分泌蛋白25该载体含有一个分泌信号，可实现可溶性糖蛋白的胞外分泌。pHLsec 包含一个C端（His）6x 标签，用于通过固定化金属亲和层析方法从细胞上清液中进行亲和纯化。
  3. 克隆CD22胞外区（ECD）的截短构建体，依次缺失C端Ig结构域：结构域1-6（残基20-687）、结构域1-5（残基20-592）、结构域1-4（残基20-504）和结构域1-3（残基20-330）图2B和图2C)50.
  4. 使用 NetNGlyc 服务器分析 CD22 ECD 的初级序列，以鉴定该构建体中预测存在的 N-连接糖基化位点51.
  5. 使用定点突变技术，按照标准实验方案52 或通过重叠PCR53，对每个预测的N-连接糖基化位点（Asn突变为Gln和/或Asn突变为Ala）进行突变，以构建包含单个或多个N-连接糖基化突变的CD22 ECD质粒。
  6. 克隆构建体经序列验证后，转入感受态细胞 E. coli DH5α 细胞54 并按照说明书进行DNA的大提纯（maxi-prep），以准备转染。

2. HEK293F 和 HEK293S 细胞系的建立

注意：所有涉及 HEK293F 或 HEK293S 细胞的操作，以及所需试剂和设备的使用，均必须在生物安全二级设施中的合适生物安全柜内进行。所有物品的外表面必须用 70% 乙醇溶液或等效试剂进行消毒。

  1. 获取HEK293F和HEK293S悬浮细胞（参见 材料表）并于 -80 °C 直至准备使用为止。
  2. 温热的培养基（参见 材料表）在室温下孵育1小时 37 °C 水浴。将24 mL预热的培养基转移至带有通气盖的125 mL带挡板细胞培养瓶中。
  3. 从 - 获取 1 mL 细胞等分试样80 °C 并转移至冰上。
  4. 在培养箱中孵育细胞 37 °C 水浴约1分钟，使细胞部分解冻。将1 mL细胞从冻存管转移至125 mL带挡板的细胞培养瓶 含有培养基的培养瓶
  5. 关闭细胞 带有透气盖的培养瓶，并将培养瓶置于设定好的摇床中 37 °C，130 rpm，70% 湿度，8% CO₂2.

3. HEK293 细胞培养

注意：解冻后约 24 小时必须检测细胞密度和细胞活力。此步骤可确保细胞在接种后处于恢复状态；初始活力应 >80%.

  1. 从含有新鲜悬浮细胞的 125 mL 锥形瓶中小心吸取 10 µL 细胞，转移至无菌的 1.5 mL 微量离心管中。盖紧锥形瓶并放回培养箱。
  2. 向含有细胞的 1.5 mL 微量离心管中加入 10 µL 台盼蓝溶液，充分混匀后，取 10 µL 加入细胞计数板的计数室中。
  3. 将计数板放入自动细胞计数仪中，获取细胞密度（单位：cells mL-1）和细胞活力（百分比）。
  4. 根据以下公式计算接种新鲜 200 mL 培养液至终密度约为 0.8 x 106 cells mL-1 所需的细胞体积：
    figure-protocol-1    (1)
    figure-protocol-2   (2)
    注意：可能需要约 5 天时间才能获得适合接种 200 mL 培养液的细胞密度。
  5. 当细胞密度达到可接种 200 mL 培养液的水平时，将培养基在 37 °C 水浴中预热 1 小时，并将预热后的培养基转移至生物安全柜中。
  6. 使用刻度移液管，小心地将所需体积的培养基（根据公式 2 计算得出）转移至带通气盖的 500 mL 带挡板细胞 培养瓶中。
  7. 使用刻度移液管，将所需体积的悬浮细胞（根据公式 1 计算得出）转移至已加入培养基的 500 mL 带挡板细胞 培养瓶中。
  8. 盖紧新的 200 mL 维持培养储备瓶，并放回培养箱。将细胞培养至密度约为 3 x 106 cells mL-1。每 2–3 天在细胞密度为 0.8 x 106 cells mL-1 时传代一次，以维持稳定的细胞培养状态（如第 3.4–3.7 节所述）。切勿使细胞密度超过约 4 x 106 cells mL-1。

4. 用于糖蛋白表达的 HEK293 细胞转染

  1. 计算转染时 200 mL 培养液体积所需的细胞和培养基体积6 细胞/mL-1 （使用第 3.4 节中的公式 1 和公式 2）。
    注意：可进行的200 mL转染反应次数取决于维持培养物的细胞密度。
  2. 将转染所需的培养基和细胞转移至一个新的带通气盖的500 mL细胞培养瓶中，并将细胞储备液放回培养箱。
  3. 将细胞传代后孵育1小时，使其在转染前充分适应环境。
  4. 转移 50 µg 将DNA加入无菌50 mL锥形管中，并用5 mL培养基稀释。使用真空过滤装置过滤稀释后的DNA 0.22 µm 将滤液转移至另一无菌离心管中。
  5. 将稀释并过滤的DNA与转染试剂按1:1的质量:体积比例混合。轻轻涡旋DNA与转染试剂的混合液以混匀，并于室温孵育10分钟。
  6. 将DNA:转染试剂溶液直接加入细胞中。将转染后的细胞在 37 °C，130 rpm，70% 湿度，8% CO₂2 在摇床中振荡 5-7 天。

5. 细胞转染条件的优化

注意：为了优化细胞转染条件以获得最大糖蛋白产量，可在多种初始细胞密度下进行细胞转染，并随时间评估蛋白产量（图3A)。按照第4节所述方法转染细胞，初始细胞密度范围为0.5 × 106 至 2 × 106 细胞/mL-1 55. 试验性转染可缩小至总体积25 mL（在125 mL带挡板细胞培养瓶中） 培养瓶）与 6 µg 以节省空间和试剂。DNA 用量也可进一步优化55.

  1. 转染后每天（第1–7天），在生物安全柜中将500 µL细胞培养液转移至无菌的1.5 mL微量离心管中。
  2. 收集后立即在微量离心机中以12,000 × g离心5分钟。将上清液转移至新的1.5 mL微量离心管中，并于4 °C保存，直至所有样品收集完毕。
  3. 通过密度测定法定量分泌的糖蛋白
    1. 所有样品收集完毕后，将每份样品各20 µL分装至新的1.5 mL微量离心管中，并加入6 µL非还原型4× Laemmli上样缓冲液，混匀。
    2. 在95 °C的温控金属块中煮沸样品5分钟。随后在微量离心机中以12,000 × g离心1分钟。
    3. 将每份样品各20 µL加样至10孔4–15%梯度SDS-PAGE凝胶的每个泳道中。设置一泳道用于蛋白分子量标记物。在Tris/Glycine/SDS缓冲液中以250 V电压电泳20分钟。
    4. 电泳完成后，将凝胶转移至考马斯亮蓝染色液（见材料表）中染色20分钟。随后用ddH2O脱色20分钟，并对凝胶成像。
    5. 按照标准操作流程，使用ImageJ软件进行密度测定57,58。
    6. 将数据整理并作图，以“转染后天数”为X轴，“密度测定值”为Y轴（图3A）。
      ​注意：若蛋白表达量过低，无法通过SDS-PAGE可视化，可采用如蛋白质印迹（Western blotting）等其他技术56。
  4. 通过BLI定量分泌的糖蛋白
    1. 使用Ni-NTA生物传感器，利用BLI技术定量分泌的糖蛋白含量59。
    2. 将数据整理并作图，以“转染后天数”为X轴，“蛋白浓度（µg/mL）”为Y轴（图3A）。

6. 从 HEK293 上清液中纯化可溶性糖蛋白

  1. 通过离心收集细胞，条件为 6,371 x g，4 °C 下离心 20 分钟 4 °C. 收集含有分泌型CD22 ECD的上清液，并使用滤膜过滤 0.22 µm 滤膜
  2. 以 4 mL/min 的速度上样上清液-1 在台式层析系统上，使用预先平衡的（20 mM Tris pH 9.0，150 mM NaCl，5 mM 咪唑）Ni-NTA 柱（5 mL 体积）。
    注意：可根据第1节中构建设计所包含的亲和标签，选用其他基于亲和力的纯化技术。
  3. 上清液上样后，用3-4个柱体积（CV）的洗涤缓冲液（20 mM Tris pH 9.0，150 mM NaCl，5 mM 咪唑）洗涤亲和柱。
  4. 使用洗脱缓冲液（20 mM Tris pH 9.0，150 mM NaCl，500 mM 咪唑）以4-100%梯度（4 CV）从柱中洗脱纯化的糖蛋白，同时收集组分图3B).
  5. 在具有10 kDa标称分子量截留值（NMWL）的离心过滤装置中合并含有洗脱峰的组分，并在4,000 x g条件下离心浓缩 4 °C 15 分钟，或直至样品体积达到 500 µL.
  6. 将浓缩的糖蛋白注入一个 500 µL 样品环，以0.5 mL/min加载-1 连接至快速蛋白液相色谱（FPLC）系统上预先平衡的高效尺寸排阻色谱柱（约24 mL体积，20 mM Tris，pH 9.0，150 mM NaCl） 4 °C 在收集组分的同时（图3C).
  7. 运行SDS-PAGE凝胶以分析洗脱组分，鉴定含糖蛋白的组分，并合并相应组分。SDS-PAGE凝胶的电泳操作可按照第5节所述方法进行60.

7. 纯化糖蛋白的去糖基化

  1. 通过测量280 nm处的吸光度除以消光系数，测定凝胶过滤层析后纯化蛋白的浓度（例如， 1.418 M-1 cm-1 用于CD22胞外区（ECD）。
    注意：目的蛋白的理论消光系数可使用 ExPASy ProtParam 等在线工具进行计算61.
  2. 将纯化的蛋白质与Endo H在37°C下孵育1小时 37 °C，按每1 mg纯化蛋白 10 µL 按照制造商说明，将商业酶溶于1X Endo H缓冲液中。
    注意：内切糖苷酶H（Endo H）可切割HEK293S细胞中产生的高甘露糖型糖链，使每个糖基化位点保留一个N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）残基21Endo H 不切割在 HEK293F 细胞中产生的蛋白质上的糖链22，但也可使用其他酶来实现此目的（例如，PNGaseF24).
  3. 浓缩去糖基化的ECD至 500 µL 并以0.5 mL/min的流速在高效尺寸排阻色谱柱（约24 mL体积）上进行凝胶过滤层析-1 在FPLC上去除内切酶H并分离任何形成的聚集体。
  4. 将去糖基化的蛋白质储存于 4 °C 直至用于后续实验。

8. 糖蛋白的结晶

注意：使用市售的结晶筛选试剂盒，并利用结晶机器人设置悬滴实验进行结晶试验。

  1. 使用截留分子量为10 kDa的离心过滤装置，在4,000 × g、4 °C条件下将纯化的去糖基化ECD浓缩至10 mg mL-1，直至达到所需浓度。
  2. 通过测定280 nm处的吸光度，并除以消光系数来确定蛋白质浓度。
  3. 在进行结晶试验前，将样品在4 °C下以12,000 × g离心5分钟，以去除样品中不必要的灰尘或其他污染物。
  4. 向96孔坐滴结晶板的储液池孔中加入80 µL来自商业结晶筛选试剂盒的结晶溶液。
    注：我们使用稀疏矩阵型商业筛选试剂盒，其设计依据是PDB数据库中已报道结构所采用的最成功的结晶条件。
  5. 使用结晶机器人，以纯化蛋白与结晶溶液1:1的比例，在结晶板的孔中分配总滴体积为200 nL的液滴。
  6. 整块板加样完成后，用封板膜密封，并放入板式成像仪中，通过可见光和紫外光进行观察。
  7. 在设置后立即以及随后几周内，使用可见光和紫外光检查结晶板，以识别能够产生初始糖蛋白晶体的条件。
  8. 针对初始结晶获得的晶体，基于晶体生长条件或采用随机矩阵微接种方法，利用精细筛选条件进一步优化晶体质量62,63,64,65。
  9. 对于结晶条件中缺乏足够冷冻保护剂的晶体，可通过将晶体浸泡在添加了20%（v/v）甘油溶液（或等效冷冻保护剂，如乙二醇或聚乙二醇400）的母液中进行冷冻保护处理。
  10. 将晶体装载至冷冻环中，并在液氮中快速冷冻，随后在实验室X射线衍射仪或同步辐射光源下进行数据收集。

9. 利用重原子衍生物进行相位测定

注意：在操作任何高亲和力（HA）化合物之前，必须考虑安全事项。蛋白质晶体学中使用的HA化合物因其对生物分子具有强亲和力，长期接触可能对人类健康造成风险。应根据这些化合物的材料安全数据表（MSDS）中所述采取适当的安全防护措施。

  1. 为了测试不同的HA化合物、浓度和孵育时间，重复第8节中获得的良好衍射晶体 在24孔结晶板中使用 悬滴气相扩散法66.
  2. 确定将用于晶体衍生物制备的HA。服务器（例如， 重原子数据库系统67可协助进行HA化合物的筛选，确保所选化合物适合目标蛋白及结晶条件。
    注意：HA 筛选试剂盒亦可商业获取，便于快速筛选最有效的用于相位测定的 HA 化合物。一组 "魔法七" HA化合物此前已被描述为具有较高的HA衍生化成功率68.
  3. 设置HA浸泡工作台（图4A）。使用冷冻环，迅速将晶体转移至 0.2 µL 将样品滴加到含有HA溶液的22 mm盖玻片上，HA溶液用结晶条件缓冲液稀释，使最终HA浓度为1–20 mM。密封液滴，并在不同时间点孵育图4B一个合适的起始时间点是 5、10、60 和 90 分钟，以及过夜。
  4. 使用光学显微镜目视检查晶体，观察是否存在裂纹或颜色变化，这些现象可能表明糖蛋白晶体或晶体衍生物化受到了不利影响。
  5. 将晶体装载到冷冻环中，并依次在三种溶液中分别反向浸泡 30 秒 0.2 µL 含有母液溶液并添加20%（v/v）甘油（或其他冷冻保护剂）的液滴69通过反向浸泡晶体，可去除非特异性结合的HA化合物，并减少因HA弱结合导致的部分占位现象。将晶体在液氮中快速冷冻。图4B).
  6. 用于数据收集、处理、结构解析和精修，请采用先前已描述的方案26,70,71,72.

10. 用配体浸泡糖蛋白晶体

  1. 使用悬滴气相扩散法，在24孔结晶板中重复获得第8节所述的优质衍射晶体  。
  2. 在20 mM Tris（pH 9.0）、150 mM NaCl缓冲液中配制50 mM配体的储备溶液。
    注意：配体的浓度应根据其与糖蛋白的亲和力进行配制。若亲和力未知，可能需要在开始浸泡实验前采用等温滴定量热法（ITC，见第12.2节）测定亲和力。确保配体在所需缓冲液中于目标浓度下可溶。
  3. 将不同浓度的配体加入含有ECD晶体的液滴中，密封后孵育5分钟至5天不等。
  4. 使用光学显微镜观察晶体，识别其形态是否发生可能的变化。
  5. 将晶体装载至冷冻环中，并用添加了20%（v/v）甘油（或其他冷冻保护剂，如乙二醇或低分子量聚乙二醇400）的母液进行冷冻保护69。
  6. 数据收集、处理、结构解析与精修请采用先前描述的方案73,74,75。

11. 抗原结合片段（Fab）的制备

  1. 亚克隆编码抗ECD抗体Fab重链（HC）和轻链（LC）序列的基因 例如，epratuzumab
    ​注意：或者，IgG 可通过木瓜蛋白酶消化产生 Fab 片段76.
  2. 按照第4节所述转染细胞，但作如下修改：
    1. 转染Fab片段时使用总DNA质量为 90 µg 每 200 mL 培养液
    2. 以2:1的比例共转染HC和LC质粒，以减少LC二聚体的形成。
  3. 孵育 7 d 后，收集细胞，保留上清液并用滤器过滤 0.22 µm 真空驱动过滤装置
  4. 使用台式层析系统，用 PBS 缓冲液平衡抗 LC（kappa 或 lambda）亲和柱。
    注意：如果在纯化过程中出现轻链二聚体形成的问题，可使用Protein G亲和层析作为κ/λ轻链亲和纯化的替代方法。
  5. 以 4 mL/min 的流速将上清液上样至亲和层析柱-1上样后，用3-4个柱体积的PBS洗涤柱子。
  6. 使用100 mM甘氨酸（pH 2.2）进行等度洗脱，从柱中洗脱蛋白质，并在每份收集的洗脱组分中立即加入10%（v/v）1 M Tris（pH 9.0）进行中和。
    注意：可使用FPLC通过离子交换层析和/或尺寸排阻层析对洗脱的Fab片段进行进一步纯化 4 °C.

12. 抗原结合片段及小分子与糖蛋白结合特性的表征

  1. 生物层干涉技术
    1. 配制 50 mL 1x 动力学缓冲液（1x PBS，0.002% (v/v) Tween-20，0.01% (w/v) BSA）。
    2. 将六个 Ni-NTA 生物传感器置于缓冲液中水合。 200 µL 在预湿板中，用 1x 动力学缓冲液孵育 10 分钟。
    3. 将 His 标签胞外域稀释于 1 mL 1× 动力学缓冲液中，终浓度为 25 ng。 µL-1. 将纯化后的 Fab 进行系列稀释，并移液至 200 µL 1x 动力学缓冲液，初始浓度为 500 nM，随后进行系列稀释，浓度分别为 250 nM、125 nM 和 62.5 nM。
    4. 将试剂按图示分装至黑色平底聚丙烯 96 孔微孔板中 图 5A，其中每个孔均含有 200 µL 指定溶液。
    5. 使用数据采集软件中的动力学检测功能收集数据，具体操作如前所述。38,39,77 (图5A).
      1. 简言之，将生物传感器转移至含有1x动力学缓冲液的孔中，进行60秒基线测量，随后加入25 ng。 µL-1 以每分钟1000转的转速离心糖蛋白240秒（或直至达到1.0纳米的阈值）。
      2. 在 1x 动力学缓冲液中完成第二个 60 秒基线测量后，将生物传感器转移至含有 Fab 系列稀释液的孔中。随后进行 180 秒结合阶段，紧接着在 1x 动力学缓冲液中进行 180 秒解离步骤。
        注：若在上述操作流程后增加再生步骤，生物传感器可重复使用。再生步骤包括：将生物传感器在剥离缓冲液（含500 mM咪唑的PBS）中清洗5秒，随后在1x动力学缓冲液中中和5秒，此循环重复三次。同一日内，生物传感器可重复使用约10-20次，或直至数据质量明显下降为止。
    6. 使用分析软件分析数据。图 5A):
      1. 在选项卡 1 下，导入并选择数据。
      2. 在选项卡 2 的步骤 1：数据选择中，选择“传感器选择”并高亮参考孔（E 行和 F 行）。 图 5A)，右键单击并设置为参比孔。在步骤2：扣除中，选择“参比孔”。在步骤3：Y轴对齐中，在0.1至59.8秒的时间范围内选择“基线”。在步骤4：步骤间校正中，选择“对齐至解离”。在步骤5：处理中，选择“Savitzky-Golay滤波”并点击处理数据。
      3. 在“选项卡3”下，于“分析步骤”中选择“结合与解离”并使用1:1模型。选择“全局拟合”和“按颜色分组”。右键点击曲线，选择“更改颜色”，将所有曲线设置为您选择的颜色。选择“拟合曲线”。若数据拟合良好，可通过选择“保存报告”导出报告。
    7. 使用在 HEK293F 和 HEK293S 细胞中产生的糖蛋白（第 5 节）以及经过 Endo H 处理后（第 7 节）重复实验，以评估不同糖型（如果存在）对 Fab 识别的影响。此外，使用 ECD 截短体重复实验，以深入了解 Fab 所结合的域。
  2. Fab-糖蛋白相互作用的等温滴定量热法
    ​注：本文所述等温滴定量热实验使用自动化等温滴定量热仪进行。实验在1毫升圆底96孔板中进行。
    1. 将 ECD 和 Fab 置于单个 4 L 烧杯中，在 20 mM Tris、pH 8.0、150 mM NaCl 的缓冲液中进行透析。 4 °C 使用搅拌子搅拌过夜。
    2. 将透析后的ECD与Fab浓缩至 5 µM 以及 50 µM分别使用截留分子量为10 kDa的离心过滤装置，确保用5 mL透析缓冲液洗涤浓缩膜三次，每次在4,000 x g离心力下于4°C处理5分钟。 4 °C 使用前。
      注意：样品池与注射器中缓冲液成分的任何不匹配，都可能在等温滴定量热实验过程中导致非预期的热量释放，从而造成数据质量不佳。
    3. 对于实验 1：加入 400 µL ECD 与 A1 的结合物加载至细胞中， 120 µL 将 Fab 加入 A2 孔以便装入注射器。A3 孔留空，用于实验完成后回收混合样品。后续每次实验均可按相同顺序向板中添加样品。即， 实验 2：细胞 - A4，注射器 - A5，空孔 - A6； 图5B).
      注意：每次运行开始和结束时，均需将缓冲液纳入缓冲液对照（以确认仪器运行正常），同时将配体（在注射器中）加入缓冲液（在样品池中）对照，以计算注射器中样品的稀释热。随后在数据分析过程中，应将计算得到的稀释热从原始实验数据中扣除。图 5B).
    4. 共运行 16 次进样，进样体积为 2.5 μL 每次注射的注射时长为5秒，相邻注射间隔为180秒。将样品池温度设定为 25 °C搅拌速度为750 rpm，过滤周期为5秒。
      注意：根据 ECD:Fab 相互作用的亲和力与热力学特性，可能需要调整样品浓度、注射次数或样品池温度。
    5. 使用分析软件分析数据，具体方法如前所述。40,41,43 (图 5B).
    6. 请至少进行两次重复实验，计算平均 K 值。D 数值与标准误。使用ECD重复实验。 不同糖型（第5和第6节）以评估糖型（若存在）对Fab片段与糖蛋白相互作用热力学的影响。
  3. 针对配体-糖蛋白相互作用的等温滴定量热法，请按照第12.2节所述设置ITC实验，并作如下调整：
    1. 将 ECD 置于 4 L 透析缓冲液中透析过夜。透析完成后，使用透析缓冲液溶解配体。
    2. 进行等温滴定量热（ITC）实验时，应使用显著更高的浓度，以便检测低亲和力相互作用。对于胞外结构域（ECD）与配体的相互作用，请在浓度为 100 µM 细胞中 ECD 浓度为 1 mM，注射器中配体浓度为 1 mM。

结果

成功将多个CD22胞外区（ECD）构建体克隆至pHLsec表达载体，并在哺乳动物HEK293F和HEK293S细胞系中过表达（图 2和3A）。所有构建体均通过尺寸排阻色谱纯化至分子大小均一，并获得高纯度样品用于结晶研究（图 3B和3C）。最终获得良好衍射晶体的CD22构建体为d1-d3截短体（残基20-330），其中预测的六个N-连接糖基化位点中有 五 个由天冬酰胺（Asn）突变为丙氨酸（Ala）（N67A、N112A、N135A、N164A和N231A），该构建体在HEK293S细胞中表达，仅保留位于N101位置的糖基化位点（此构建体命名为CD2220-330, 5A）。晶体在MCSG-1稀疏矩阵筛选的多个条件下获得，其中最优晶体来自含30%（w/v）聚乙二醇4000、0.2 M氯化锂和0.1 M Tris（pH 8.5）的条件。这些天然晶体衍射至2.1 Å分辨率；在分子置换（MR）搜索中，使用相关Siglec蛋白Ig结构域的已知结构未能获得任何可行解。

为了获得相位信息，我们将天然晶体浸泡在一系列包含Hg、Pt、Os、Ta和Br的重原子（HA）化合物中，HA化合物浓度范围为1–20 mM，孵育时间从5分钟至1天不等（图4）。我们监测了晶体形态的变化，发现用20 mM HA化合物浸泡的晶体迅速出现开裂和溶解现象。我们共冷冻了63颗在特定孵育时间后仍保持完整形态的晶体，这些晶体分别浸泡于溴化钽簇、氯铂酸、醋酸汞和氯化汞溶液中。其中，用7 mM氯化汞浸泡30分钟的晶体在加拿大光源（CLS）08-BM线站（加拿大萨斯卡通）进行荧光扫描时显示出明显的反常散射信号，从而实现了单晶的多波长反常衍射X射线数据收集。这些数据集使我们能够解析CD2220-330, 5A的汞亚结构，结果显示一个汞原子结合在C308位点的游离半胱氨酸上，最终使我们能够利用AutoBuild78将CD2220-330, 5A的结构搭建到带相位的电子密度图中。

在解析出无配体结合的结构后，我们进一步希望解析CD22与其配体α2-6-唾液酸乳糖结合后的结构。我们首先采用等温滴定量热法（ITC）测定CD22对α2-6-唾液酸乳糖的亲和力，以表征该相互作用的结合热力学参数。实验测得其亲和力约为280 µM，并据此确定了用于浸泡原生CD2220-330,5A晶体的初始配体浓度（约100倍KD）。我们将CD2220-330, 5A晶体分别在25 mM唾液酸乳糖溶液中浸泡5分钟、2小时、14小时、40小时和5天，并监测晶体形态的变化。共约75颗晶体在不同时间点被冷冻，并送往加拿大萨斯卡通的CLS同步辐射光源08-ID线站进行远程数据收集。从衍射质量良好的晶体中总共收集了六套X射线衍射数据集。每套X射线数据集的结构均通过分子置换法（MR） 解析，以无配体结合的CD2220-330, 5A结构作为初始搜索模型。随后，我们检查了各数据集的电子密度图，特别关注Fo-Fc差值图中是否存在对应于CD22结合位点内结合的α2-6-唾液酸乳糖的正向电子密度。值得注意的是，所有收集的数据集——即使来自仅浸泡5分钟的晶体——均显示出与配体结合相符的正向电子密度。总体而言，无配体与有配体结合的CD22结构高度相似，构象变化极小，这可能解释了使用α2-6-唾液酸乳糖进行浸泡实验能够成功的原因。

接下来，我们通过BLI和ITC实验表征了治疗性抗体epratuzumab识别的CD22抗原表面（图5）。epratuzumab Fab与不同糖型CD22构建体结合的动力学和热力学分析显示，随着N-连接糖链尺寸减小，其对CD22的亲和力逐渐增强，在较小糖链情况下亲和力最高可提升达14倍（BLI结果：327 nM vs 24 nM；ITC结果：188 nM vs 58 nM）。通过CD22单点突变体的BLI分析以及epratuzumab Fab与CD22 d1-d3共结晶结构的解析，确定了限制抗体接近其表位的CD22 N-连接糖链28。

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图 1．糖蛋白表征的总体流程：从构建设计到生物物理与结构表征。 （1）代表性糖蛋白的一级序列分析。灰色部分为胞外域（ECD）；绿色部分为跨膜（TM）区段；蓝色部分为糖蛋白的胞内域。预测的N-连接糖链已作标注。（2）ECD构建体的克隆。（3）在哺乳动物细胞中表达ECD构建体。（4）糖蛋白纯化。在HEK293F细胞中表达的蛋白含有复杂的糖型，而在HEK293S细胞中表达的蛋白则具有高甘露糖型糖链。使用Endo H对在HEK293S细胞中产生的糖蛋白进行酶处理，可得到仅在N-连接糖基化位点保留一个GlcNAc基团的糖蛋白。（5a）通过生物层干涉技术（BLI）和等温滴定量热法（ITC）检测糖蛋白与抗体的结合能力。ITC也可用于测定其与小分子配体的亲和力。（5b）对具有均一N-连接糖链的糖蛋白（例如在HEK293S中表达并经Endo H去糖基化的蛋白）进行结晶试验。（6）在某些情况下，需对N-连接糖基化位点进行突变以获得晶体。请点击此处查看该图的放大版本。

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图2．用于在哺乳动物细胞中表达的CD22胞外域DNA构建体设计。 A) 用于瞬时转染CD22 ECD构建体的pHLsec质粒示意图。用于克隆的AgeI和KpnI酶切位点以红色框标出。B) CD22 ECD包含七个Ig结构域（d1-d7）和12个预测的N-连接糖基化位点（以蓝色标出）。从CD22 ECD设计了四种构建体。C) 1%琼脂糖凝胶电泳显示用于克隆至pHLsec哺乳动物表达载体的CD22 ECD构建体的PCR扩增产物。第一泳道为1 kb DNA标记物。请点击此处查看该图的放大版本。

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图3糖蛋白的表达与纯化 A) 细胞密度对表达量的影响。在25 mL小规模培养中，转染三种不同起始密度细胞（0.5 × 10⁶、1.0 × 10⁶ 和 1.5 × 10⁶ 个细胞/mL）的HEK293F悬浮细胞后，糖蛋白的表达情况。6 细胞/mL-1，1.0 × 106 细胞/mL-1，以及 1.5 x 106 细胞/mL-1左侧图示通过 SDS-PAGE 电泳条带密度测定进行定量，右侧图示通过定量 BLI 分析进行定量。数据代表一次糖蛋白制备样品的典型结果。 B) 构建体CD22第一步纯化层析图谱20-330, 5A 从600 mL上清液中使用Ni-NTA亲和柱纯化糖蛋白。采用咪唑梯度（灰色线条）进行洗脱，其中100%对应含500 mM咪唑的洗脱缓冲液。合并的组分以垂直线表示。 C) CD22 构建体的尺寸排阻色谱图20-330,5A 使用高性能凝胶过滤柱。洗脱峰的合并组分以垂直线表示。插图：考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶，显示糖蛋白的纯度。 请点击此处以查看此图的放大版本。

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图 4．使用重原子进行晶体浸泡。 A) 用于将天然晶体浸泡在重原子（HA）化合物中的样品工作台。所有必需的工具均已标注。B) 将CD2220-330, 5A构建体的晶体浸泡在HA化合物中的操作步骤。步骤 1，打开含有晶体的孔，使用环状工具将晶体转移至载玻片上含有HA溶液的0.2 µL液滴中，该HA溶液用结晶条件缓冲液稀释，使其终浓度为1–10 mM。步骤 2，将液滴密封于结晶板中，并让晶体与HA化合物孵育不同时间。步骤 3，将浸泡后的晶体用环状工具夹取，并依次在载玻片上三个连续的、每份0.2 µL、含有补充了20% (v/v) 甘油的母液的液滴中进行反向浸泡（back-soak），每次30秒。步骤 4，将环上固定的晶体用液氮快速冷冻，随后放入样品托（puck）中，准备运送到同步辐射光束线进行数据收集。请点击此处查看该图的放大版本。

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图5．生物层干涉测量与等温滴定热量测定实验结果。A） 典型的BLI实验。上图：动力学实验的微孔板设置示例，图中标注如下：1×动力学缓冲液（B）、His6x-标签糖蛋白上样（L）、典型Fab浓度（500、250、125、 62.5 nM）、PBS + 500 mM再生缓冲液（R）以及1×动力学中和缓冲液（B）。每个孔中含200 µL溶液。动力学实验的步骤编号位于板的上方。中图：使用Ni-NTA生物传感器及上图所述微孔板进行的BLI实验的典型原始数据。步骤编号对应于基线（1）、His6x糖蛋白上样（2）、基线（3）、Fab系列稀释液中的结合（4）和解离（5）。再生步骤未显示（步骤6-7）。下图：典型分析数据，显示原始结合与解离曲线（蓝色线）及相应的1:1拟合曲线（红线）。B） 上图：在自动化ITC仪器上进行单次ITC运行的典型微孔板设置，使用96孔圆底板，共包含七个实验，每个实验由三个孔组成。第一个孔（红色）为样品池样品（400 µL），第二个孔（绿色）为注射器样品（120 µL）。第三个孔保持空置，实验完成后混合样品将返回此孔。实验1、2和7为缓冲液对缓冲液的对照实验。实验3-5为在样品池中加入糖蛋白（P）、注射器中加入Fab或配体（L）的三重复实验。实验6为配体稀释热对照，在数据分析过程中应从实验3-5中扣除。下图：典型的原始（上）和处理后（下）ITC数据，显示Fab（epratuzumab）与在HEK293F细胞中表达的CD22 ECD的结合。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

膜锚定糖蛋白对细胞功能至关重要，并且是极具潜力的治疗靶点。本文介绍了一种用于对膜糖蛋白的胞外区（ECD）进行结构与生物物理表征的实验方案，既可单独研究，也可用于研究其与小分子配体及Fab片段形成的复合物。我们已成功应用该方案解析了人CD22胞外区最靠近N端的三个Ig结构域的晶体结构28，CD22是B细胞上一种关键的共受体，在调控体液免疫中发挥重要作用79。我们还鉴定了CD22与其天然配体α2-6-唾液酸乳糖的结合位点，并阐明了一种治疗性抗体识别人CD22的分子机制。这些结果揭示了Siglec家族中一个在B细胞上特异性表达的关键成员的结构与功能关系，并为开发靶向CD22的小分子及抗体类新疗法提供了分子基础。尽管本方案最初成功应用于含Ig结构域的B细胞受体，但我们认为该方法可推广至任何具有明确结构域组织的膜糖蛋白的结构与生物物理表征。在此类情况下，可通过设计表达载体并结合N-连接糖链的组合突变（突变为Gln或Ala），筛选出适合晶体生长并获得高分辨率衍射数据的蛋白构建体。

获得均一且纯净的糖蛋白样品对于晶体生长和X射线衍射，以及后续的生物物理表征至关重要。糖蛋白上的N-连接聚糖本质上具有异质性，可能导致糖蛋白内部的构象和化学异质性，从而阻碍晶体形成。为降低这种微异质性，可采用一些策略，例如引入定点突变以去除预测携带N-连接聚糖的Asn残基，或使用突变细胞系（如HEK293S），再结合内切糖苷酶处理（如EndoH），这些方法可显著提高结晶成功率15,21,22。在本方案中，我们讨论分泌到细胞上清液中的可溶性糖蛋白和Fab片段的纯化。糖蛋白的分泌提供了一条相对简单的纯化途径，无需细胞裂解或添加剧烈化学试剂或去污剂。收集细胞后获得的上清液可直接上样至对目标蛋白具有亲和力的层析柱（例如，用于His标签糖蛋白的Ni-NTA柱，或用于Fab片段的LC亲和柱）。然而，根据所用层析柱类型及细胞上清液的条件（例如，pH值），目标蛋白与层析柱的结合能力可能受到影响。若出现此类情况，可能需要对细胞上清液进行浓缩和缓冲液置换，以提高其在层析柱上的结合效率。此外，强烈建议在纯化过程中引入质量控制步骤，以评估蛋白纯度。对所有样品（纯化前、纯化中和纯化后）进行SDS-PAGE电泳或Western blot分析，有助于判断所设计的纯化方案是否适用于目标蛋白。若在SDS-PAGE中观察到污染条带，或在纯化过程中获得多个组分（例如，尺寸排阻层析中出现多个峰），则应考虑增加额外的纯化步骤，例如离子交换层析，以提高纯度并增加后续结晶的成功几率80。

对于大分子结晶，通常需要获得足量的目标蛋白，以便在高蛋白浓度下筛选大量潜在的结晶条件，从而找到合适的晶体初筛结果。一般来说，本文讨论的HEK293细胞系（HEK293F和HEK293S）是稳定的表达系统，可根据需要轻松放大培养以获得更多样品。然而，目标蛋白在这些细胞系中可能表达量不足。在此情况下，已有研究发现其他细胞系（如Expi293细胞81,82）的蛋白表达水平更优，可作为替代选择。

如果在测试了目标蛋白的多个构建体后，尽管蛋白纯度较高，仍未能获得有序且可衍射的晶体，则可能需要拓展结晶技术以促进晶体形成。已有研究表明，抗体的Fab片段和纳米抗体可以 优异的结晶促进剂，并促进晶体形成高度有序的排列83,84,85这些片段可被表达并纯化至均一，可用于与目标蛋白形成复合物以促进结晶。值得注意的是，按照第10节所述方法制备的Fab片段可能倾向于形成无功能的轻链（LC）二聚体。86这些二聚体属于杂质，应在纯化过程中予以去除。根据我们的经验，轻链二聚体在尺寸排阻层析中通常具有不同的洗脱体积，或在离子交换层析中呈现为独立的洗脱峰，因此可在Fab片段纯化过程中将其分离；但情况并非总是如此。若上述方法不足以从Fab片段纯化中完全去除轻链二聚体，则可采用其他纯化手段，如Protein G亲和层析，以提高产物纯度。

除了与Fab片段共复合物化之外，已有充分文献记载的技术（如随机基质微晶种法）可提高获得有序晶体的几率63,70。该方法是在结晶条件下加入少量研碎的、非理想的晶体，以提供晶核促进晶体生长。此操作可使用目标蛋白自身的晶体，也可使用具有相似结构域架构和三级结构的其他晶体。此外，随机基质微晶种法 可用于尝试使目标蛋白单独结晶，或使其与Fab片段或小分子配体形成复合物后结晶。近年来冷冻电子显微技术的进步，也使其成为获取具有合适特征分子高分辨率结构信息的一种颇具吸引力的X射线晶体学替代方法87,88,89,90,91。

当通过分子置换法（MR）无法确定X射线衍射数据集的相位时，可能需要通过重原子（HA）浸泡，利用反常散射或同晶置换法来解决相位问题。分析蛋白质的氨基酸序列可为HA衍生化策略提供线索，包括结合的最佳pH值。特别是，蛋白质中未配对的半胱氨酸可特异性结合含汞的重原子化合物。将天然晶体与重原子化合物进行浸泡是一个迭代过程，旨在确定最佳重原子化合物的种类、浓度以及所需的孵育时间。如果初步的浸泡尝试未能获得具有良好衍射质量且含有适合用于相位确定的重原子的晶体，则可能需要引入氨基酸替换突变，以提高重原子结合的概率并增强反常信号。例如，可引入突变以产生游离的半胱氨酸残基，从而高效结合Hg、Au、Pt或Pb。在大肠杆菌（E. coli）中利用添加硒代甲硫氨酸的培养基表达蛋白质，已被广泛用于反常散射相位确定；然而，目前尚无可靠且适用于悬浮培养的哺乳动物细胞的等效系统来有效掺入硒代甲硫氨酸，这仍是未来发展的方向92,93。

获得目标糖蛋白的无配体结构后，可通过将晶体浸泡在小分子配体溶液中，以获得免疫受体-配体复合物的结构。这些数据为合理设计更具特异性和高亲和力的配体提供了蓝图，此类配体可作为小分子治疗药物，同时也为糖蛋白的生物学功能提供了高分辨率的深入见解。在尝试将目标小分子配体浸泡到糖蛋白晶体中时，可通过检查无配体晶体结构来判断浸泡是否可行。如果在配体结合位点周围或预期在配体结合后发生构象变化的区域存在紧密的晶体堆积接触，则浸泡很可能存在问题。在此情况下，应采用其他方法，例如蛋白质-配体复合物的共结晶。

披露

作者声明无竞争利益。

致谢

本文所述的X射线衍射实验在加拿大光源（Canadian Light Source）的08-ID和08-BM光束线上完成。加拿大光源得到了加拿大创新基金会、加拿大自然科学与工程研究委员会、萨斯喀彻温大学、萨斯喀彻温省政府、加拿大西部经济多元化部、加拿大国家研究委员会以及加拿大卫生研究院的资助支持。我们感谢多伦多病童医院（The Hospital for Sick Children）的结构与生物物理核心设施（Structural & Biophysical Core Facility）提供等温滴定量热仪（ITC）和生物层干涉仪（BLI）的使用机会。J.E.O. 的研究得到了加拿大卫生研究院颁发的班廷博士后奖学金（Banting Postdoctoral Fellowship BPF-144483）的支持。T.S. 获得了加拿大卫生研究院提供的加拿大研究生奖学金硕士奖项（Canada Graduate Scholarship Master's Award）以及范尼尔加拿大研究生奖学金（Vanier Canada Graduate Scholarship ）。本研究获得了加拿大卫生研究院运营基金（项目号：PJT-148811，负责人：J.-P.J.）的支持。本研究的部分工作得益于加拿大研究教席计划（Canada Research Chairs program (J.-P.J.)）提供的资金支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.22 μm Steritop 滤器EMD MilliporeSCGPS02RE
10 孔 4-15% 梯度 SDS-PAGE 凝胶Bio-Rad4561084
10x 糖缓冲液 3New England BiolabsP0702S随 Endo H 试剂提供
10x 动力学缓冲液PALL FortéBio18-1092
10x Tris/甘氨酸/SDS 缓冲液Bio-Rad1610732
1 mL 圆底 96 孔板ThermoFisher260251
22 mm 盖玻片Hampton ResearchHR3-231
4x Laemmli 上样缓冲液Bio-Rad1610747
96-3 孔 INTELLIPLATE  低体积储液槽Art Robbins Instruments102-0001-03
AgeINew England BiolabsR0552S
ÄKTA PureGE Healthcare
ÄKTA Start GE Healthcare
Amicon Ultra 15 离心过滤装置，10 kDa MWCOMilliporeUFC901008
Amicon Ultra 4 离心过滤装置，10 kDa MWCOMilliporeUFC801008
Auto-iTC200Malvern
Axygen MaxyClear Snaplock 1.5 mL 微量离心管Fisher ScientificMCT150C
Countess 细胞计数板Thermo Fisher ScientificC10228
CryoLoop 18 × 0.05–0.1 mmHampton ResearchHR4-945
CryoLoop 18 × 0.1–0.2 mmHampton ResearchHR4-947
CryoLoop 18 × 0.2–0.3 mmHampton ResearchHR4-970
数字干浴器Bio-Rad1660562EDU
E. coli DH5αInvitrogen18258012
Endo HNew England BiolabsP0702S
锥形瓶（带挡板底），聚碳酸酯，无菌，500 mL，DuoCAPTriForest LabwareFBC05000S
锥形瓶 125 mL（带挡板底），聚碳酸酯，无菌，125 mL，带通气盖VWR89095-258
Falcon 一次性无菌移液管，无热原，10 mLGreiner Bio-One607180
Falcon 一次性无菌移液管，无热原，25 mLGreiner Bio-One760180
Falcon 一次性无菌移液管，无热原，5 mLGreiner Bio-One606180
Falcon 一次性无菌移液管，无热原，50 mLGreiner Bio-One768180
FectoPRO DNA 转染试剂，PolyplusVWR10118-842
Freestyle 293F 细胞Thermo Fisher ScientificR79007
Freestyle 表达培养基Thermo Fisher Scientific12338001
重原子筛选试剂盒 AuHampton ResearchHR2-444
重原子筛选试剂盒 HgHampton ResearchHR2-446
重原子筛选试剂盒 M1Hampton ResearchHR2-448
重原子筛选试剂盒 M2Hampton ResearchHR2-450
重原子筛选试剂盒 PtHampton ResearchHR2-442
HEK 293SATCCATCC CRL-3022
HisTrap 亲和层析柱GE Healthcare17525501
HiTrap KappaSelect 亲和层析柱GE Healthcare17545811
HiTrap LambdaSelect 亲和层析柱GE Healthcare17548211
KpnINew England BiolabsR0142S
MCSG-1 结晶筛选试剂盒 1.7 mL 板AnatraceMCSG-1
MCSG-2 结晶筛选试剂盒 1.7 mL 板AnatraceMCSG-2
MCSG-3 结晶筛选试剂盒 1.7 mL 板AnatraceMCSG-3
MCSG-4 结晶筛选试剂盒 1.7 mL 板AnatraceMCSG-4
氯化汞Sigma1044170100
微孔板，96 孔，聚丙烯，平底，黑色 Greiner Bio-One655209
Minstrel DT UVFormulatrix
Multitron Pro 摇床Infors HTMP25-TA-CO2HB
Nanodrop 2000/2000c 分光光度计Thermo Fisher ScientificND-2000
Nanosep 3K Omega 离心浓缩管PALL Life ScienceOD003C33
Ni-NTA 生物传感器PALL FortéBio18-5102
Octet RED96PALL ForteBio
Oryx 4 结晶机器人Douglas InstrumentORY-4/1
氯铂酸Sigma520632-1g
Precision Plus Protein 标准蛋白Bio-Rad161-0374
PureLink HiPure 质粒大提试剂盒InvitrogenK210006
Quick Coomassie 染色液Protein ArkGEN-QC-STAIN-1L
Steriflip 无菌 50 mL 一次性真空过滤系统，0.22 µm Millipore ExpressEMD MilliporeSCGP00525
Superdex 200 Increase 10/300 GLGE Healthcare28990944
Superose 6 10/300 GLGE Healthcare17517201
溴化钽簇Jena BiosciencePK-103
Top96 结晶筛选试剂盒Rigaku Reagents1009846
台盼蓝Thermo Fisher ScientificT10282
VDX 24 孔板（带密封剂）Hampton ResearchHR3-172
α2-6 唾液酸乳糖Sigma AldrichA8556-1mg

参考文献

  1. Sachs, J. N., Engelman, D. M. Introduction to the membrane protein reviews: The interplay of structure, dynamics, and environment in membrane protein function. Annu Rev Biochem. 75 (1), 707-712 (2006).
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